Khảo sát điều kiện thu nhận màng cellulose từ gluconacetobacter xylinus để cố định enzyme lipase

MỤC LỤC NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP i LỜI CẢM ƠN ii LỜI CAM ĐOAN iii DANH MỤC HÌNH .vii DANH MỤC BẢNG BIỂU viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix TÓM TẮT KHÓA LUẬN x MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài 3 Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan màng cellulose vi khuẩn 1.2 Tổng quan Gluconacetobacter xylinus 1.2.1 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus 1.2.2 Quá trình sinh tổng hợp BC 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng cellulose vi khuẩn 1.3.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng cellulose vi khuẩn giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng cellulose vi khuẩn Việt Nam 1.4 Tiền xử lý BC phương pháp acetyl hóa 1.5 Tổng quan enzyme lipase 11 1.5.1 Giới thiệu 11 1.5.2 Các phản ứng xúc tác enzyme lipase 11 1.5.3 Nguồn enzyme lipase 12 1.5.4 Cấu trúc chế xúc tác 13 1.6 Tình hình nghiên cứu ứng dụng enzyme lipase 14 1.6.2 Xử lý, phát triển hương vị cải thiện chất lượng thực phẩm 14 1.6.3 Ngành công nghiệp bánh mì 14 1.6.4 Polymer phân hủy sinh học 14 1.6.5 Ngành công nghiệp chất tẩy rửa 14 iv 1.6.6 Các nghiên cứu việc cố định enzyme lipase 15 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vi sinh vật, môi trường nhân giống – môi trường thu BC, enzyme hóa chất 16 2.1.1 Vi sinh vật 16 2.1.2 Môi trường nhân giống – môi trường thu BC 16 2.1.3 Enzyme 17 2.2 Hóa chất 17 2.3 Quy trình nhân giống, sản xuất – xử lý BC cố định lipase BC 17 2.3.1 Quy trình nhân giống thu nhận BC 17 2.3.2 Quy trình xử lý BC trước cố định 19 2.3.3 Quy trình cố định lipase 20 2.4 Nội dung nghiên cứu 21 2.4.1 Sơ đồ nghiên 21 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ vi sinh vật ban đầu đến khả thu nhận BC 21 2.4.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng chế độ khuấy đến khả thu BC thích hợp 22 2.4.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ vi sinh vật ban đầu đến khả thu nhận BC 22 2.4.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường đến sinh tổng hợp BC 23 2.4.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát hiệu suất cố định enzyme lipase 23 2.4.6 Thí nghiệm 5: Khảo sát hoạt độ enzyme lipase cố định BC 24 2.5 Phương pháp phân tích 24 2.5.1 Phương pháp thu hồi, xác định hàm lượng sinh khối BC 24 2.5.2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate 24 2.5.3 Xác định hoạt độ enzyme lipase tự enzyme lipase cố định 25 2.5.4 Hiệu suất cố định 26 2.5.5 Đặc tính cấu trúc BC 26 2.5.7 Phương pháp đo quang phổ FTIR 27 2.5.7 Phương pháp xử lý số liệu 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 v 3.1 Ảnh hưởng chế độ khuấy đến khả thu BC thích hợp 28 3.2 Ảnh hưởng nồng độ vi sinh vật ban đầu đến khả thu nhận BC 30 3.3 Ảnh hưởng pH môi trường đến sinh tổng hợp BC 31 3.4 Khảo sát hiệu suất cố định enzyme lipase 33 3.5 Khảo sát hoạt độ enzyme cố định BC 366 CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cellulose thực vật cellulose vi khuẩn (Nguyễn, 2006) Hình 2: Hình thái G xylinus (Kato cộng sự, 2007) Hình 3: Con đường sinh tổng hợp BC G xylinus (Lin cộng sự, 2013) Hình 4: Cấu tạo phân tử cellulose (Salgado, 2015) Hình 5: Cơ chế acetyl hóa BC với iodine chất xúc tác 10 Hình 6: Sơ đồ chế xúc tác enzyme lipase (Casas-Godoy cộng sự, 2018) 13 Hình 1: Quy trình nhân giống sản xuất BC (Nguyễn, 2006) 18 Hình 2: Quy trình xử lý BC trước có định (Hu cộng sự, 2011) 19 Hình 3: Quy trình cố định enzyme lipase BC xử lý (Hu cộng sự, 2011) 20 Hình 4: Sơ đồ nghiên cứu 21 Hình 1: Đồ thị biểu diễn sinh khối (a) BC (b) sau 24 h 28 Hình 2: Đồ thị biểu diễn tổng hàm lượng đường sau 24h 29 Hình 3: Đồ thị biểu diễn sinh khối (a) BC (b) sau 24h 30 Hình 4: Đồ thị biểu diễn tổng hàm lượng đường mơi trường lỏng sau 24h 31 Hình 5: Đồ thị biểu diễn sinh khối (a) BC (b) sau 24 h 32 Hình 6: Đồ thị biểu diễn tổng hàm lượng đường sau 33 Hình 7: Kết chụp SEM BC (a) BC acetyl hóa (b) 34 Hình 8: So sánh phổ FTIR mẫu BC BC acetyl hóa 35 vii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Ứng dụng BC thực phẩm (Esa cộng sự, 2014) Bảng 1: Môi trường nhân giống nước dừa già (Nguyễn, 2008) 16 Bảng 2: Môi trường thu nhận BC (Nguyễn, 2008) 16 Bảng 3: Bố trí thí nghiệm 22 Bảng 4: Bố trí thí nghiệm 23 Bảng 5: Bố trí thí nghiệm 23 Bảng 1: Hoạt độ enzyme lipase mẫu enzyme tự do, enzyme cố định BC enzyme cố định BC acetyl hóa 36 Bảng 2: Hàm lượng protein mẫu enzyme tự (5mg/mL), BC, enzyme cố định BC, enzyme cố định BC acetyl hóa 35 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A xylinum : Acetobacter xylinum BC : Cellulose vi khuẩn G xylinus : Gluconacetobacter xylinus MBC : Môi trường thu nhận BC MTL : Môi trường lỏng MTR : Môi trường rắn PC : Cellulose thực vật VSV : Vi sinh vật ix TÓM TẮT KHÓA LUẬN Cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC) loại loại polymer tự nhiên có nguồn gốc từ vi sinh vật BC nghiên cứu rộng rãi nước ngồi nước đặc tính vượt trội so với cellulose có nguồn gốc từ động vật thực vật Q trình ni cấy chủng vi sinh vật Gluconacetobacter xylinus để thu nhận BC phụ thuộc vào điều kiện khác Hiệu suất thu nhận BC cao mà nghiên cứu khảo sát ni cấy Gluconacetobacter xylinus mơi trường lỏng có độ pH 4, nồng độ vi sinh vật ban đầu cấy vào 0,04 g/L ủ tĩnh nhiệt độ 30˚C ngày Từ đó, sử dụng BC thu để cố định enzyme lipase, loại enzyme có giá thành cao nhằm cải thiện hoạt tính tăng tính ổn định x MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cellulose polymer sinh học tự nhiên, thành phần quan trọng thành tế bào thực vật, nấm số loại tảo Vật liệu cellulose nghiên cứu ứng dụng phổ biến suốt gần thập kỷ nhiều lĩnh vực khác công nghiệp sản xuất giấy bột giấy, kỹ thuật y học, nông nghiệp, tinh lọc nước,… (Czaja cộng sự, 2007) Có hai nguồn cellulose thường sử dụng cellulose thực vật (PC) cellulose từ vi khuẩn (BC) Cellulose thu từ thực vật thường không tinh khiết chứa polymer khác dạng lignin hemicellulose Việc loại bỏ tạp chất cần thiết để ứng dụng đa dạng nhiều lĩnh vực, để làm việc BC cần phải xử lý hóa học phức tạp khắc nghiệt Tuy nhiên, xử lý hóa học dẫn đến thay đổi khơng có lợi cấu trúc cellulose dẫn đến thay đổi đặc điểm vật lý, học (Ul-Islam cộng sự, 2019) Cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC) loại cellulose sản xuất số chủng vi khuẩn thuộc giống Acetobacter, Agrobacterium, Gluconacetobacter, Rhizobium Sarcina, có cấu trúc tương tự với cellulose thực vật Trong năm gần đây, BC nhận nhiều ý nghiên cứu nhà khoa học đặc tính đặc biệt so với cellulose thực vật Độ tinh khiết BC cao nhiều so với cellulose thực vật cellulose vi khuẩn sở hữu mạng lưới sợi nano liên kết với với diện tích bề mặt độ xốp cao giúp tăng khả hấp thu thời gian giữ nước Ngoài ra, khả tương tác sinh học, độ suốt, tính ưa nước, khơng có tính độc hại giúp BC trở thành vật liệu tối ưu cho ứng dụng y sinh đóng vết thương hở, nối ghép mạch máu, làm khn cho thí nghiệm in vitro in vivo kỹ thuật mô tế bào,… (Czaja cộng sự, 2007) Bên cạnh đó, BC cịn ứng dụng hiệu làm vật liệu cố định cho số loại enzyme, vi khuẩn hay nấm men cố định enzyme glucoamylase lên BC dạng viên (Wu cộng sự, 2008), cố định enzyme laccase lên BC biến đổi từ tính (Drozd cộng sự, 2018), cố định enzyme lysozyme lên BC để khảo sát tính chất (Bayazidi cộng sự, 2018), cố định tế bào nấm men lên màng BC (Yao cộng sự, 2011),… Hiện nay, có nhiều nghiên cứu nước giới trình thu nhận BC nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tính chất BC (Krystynowicz cộng sự, 2002), thay đổi điều kiện sinh trưởng Gluconabacter xylinus để tối ưu hóa suất BC (Ruka cộng sự, 2012), ảnh hưởng nguồn chất kiểu lên men đến suất chất lượng BC (Nguyễn, 2008),… Các nghiên cứu cho thấy hiệu thu hồi BC phụ thuộc nhiều vào điều kiện chủng vi sinh vật, môi trường nuôi cấy điều kiện nuôi cấy phịng thí nghiệm Do đó, đề tài nghiên cứu thực nhằm khảo sát lại yếu tố, điều kiện nuôi cấy (pH, chế độ ủ, nồng độ vi sinh vật ban đầu, thời gian nuôi cấy) để đưa phương pháp nuôi cấy tối ưu cho việc thu nhận BC từ chủng vi sinh vật Gluconacetobacter xylinus Lipase (triacylglycerol acylhydrolases, E.C 3.1.1.3) loại enzyme phổ biến nay, có nhiều ứng dụng quan trọng tiềm công nghiệp lớn Enzyme lipase xúc tác cho phản ứng thủy phân triacylglycerol thành glycerol acid béo tự Lipase khơng có chức thủy phân chất béo hệ tiêu hóa hay triglyceride quy mơ lĩnh vực kỹ thuật mà cịn chất xúc tác sinh học cho phản ứng acyl hóa deacyl hóa chất nhân tạo (Schmid cộng sự, 1998) Enzyme lipase ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác loại bỏ vết dầu mỡ sợi vải công nghiệp chất tẩy rửa, cải thiện hương vị nhiều ngành công nghiệp thực phẩm sữa, bánh mỳ, nước giải khát, tổng hợp chất nhũ hóa, chất dưỡng ẩm ngành công nghiệp mỹ phẩm,… (Sharma cộng sự, 2001) Tuy nhiên, enzyme bị ức chế nhiều yếu tố nhiệt độ, độ pH hay thời gian bảo quản nên tính ổn định chúng mức trung bình kể điều kiện sinh lý thích hợp (Singh cộng sự, 2012) Trong đó, điều kiện phản ứng chất dùng công nghiệp thường điều kiện tối ưu cho enzyme lipase (Ortiz cộng sự, 2019) Bên cạnh đó, lipase enzyme có giá thành cao, khoảng 650 SGD (hơn 11 triệu VND) cho 100g lipase trích xuất từ Candida rugosa 182 SGD cho 100mg lipase trích xuất từ Pseudomonas cepacia (các sản phẩm lipase bán thương hiệu Sigma-Aldrich) Vì vậy, cố định enzyme lipase cần thiết để cải thiện tính ổn định, khả tái sử dụng nhiều lần loại enzyme đắt đỏ Các nghiên cứu cố định enzyme lipase thực nhiều chất mang khác acrylic resin (Shimada cộng sự, 1999), hạt nano Fe3O4 (Xie cộng sự, 2009), kaolinite (Iso cộng sự, 2001), celite (Liu cộng sự, 2009),… Tuy nhiên, việc cố định lipase chất mang số hạn chế giá thành cao, hiệu suất thấp hay phương pháp c nh phc (Gonỗalves Filho v cng s, 2019) Trong đó, BC loại vật liệu rẻ tiền, nghiên cứu để cố định hiệu số loại enzyme laccase, glucoamylase, lysozyme Lipase nghiên cứu để cố định lên hạt alginate/BC phương pháp hấp phụ nhiên phương pháp có hiệu suất cố định khơng cao (khoảng 25% - 47%) sử dụng đến nguồn nguyên liệu từ thực vật (alginate có nguồn gốc từ tảo) (Kim cộng sự, 2017) Cho đến nay, nước có nhiều báo khoa học BC nghiên cứu cố định enzyme lipase để cải thiện, tối ưu hóa tính chất lipase chưa có nghiên cứu cụ thể việc cố định loại enzyme vật liệu BC Do đó, nghiên cứu thực để khảo sát điều kiện nuôi cấy khác nhằm thu nhận BC từ chủng Gluconacetobacer xylinus, từ sử dụng BC để cố định enzyme Mục tiêu đề tài Đề tài thực nhằm mục tiêu đánh giá điều kiện thu nhận màng cellulose từ G xylinus để cố định enzyme lipase Nội dung nghiên cứu Đề tài “Khảo sát điều kiện thu nhận màng cellulose từ G xylinus để cố định enzyme lipase” gồm nội dung cụ thể sau: - Khảo sát ảnh hưởng chế độ khuấy đến khả thu nhận BC - Khảo sát ảnh hưởng nồng độ vi sinh vật ban đầu đến khả thu nhận BC - Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường đến sinh tổng hợp BC - So sánh hoạt độ enzyme lipase cố định BC enzyme lipase tự Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: + Nghiên cứu làm tiền đề cho nghiên cứu sau vận dụng phát triển + Tìm nguồn nguyên liệu để ứng dụng vào việc cố đinh enzyme - Ý nghĩa thực tiễn: + Tái sử dụng lipase sản xuất công nghiệp, giảm thiểu giá thành sản phẩm + Sử dụng cellulose nguồn gốc vi sinh vật giảm thiểu việc khai thác cellulose từ thực vật, từ góp phần bảo vệ môi trường CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Ảnh hưởng chế độ khuấy đến khả thu BC thích hợp Tốc độ tăng mật độ sinh khối môi trường lỏng chế độ khảo sát xác định cách lấy mẫu dung dịch môi trường để đo độ hấp thu quang học (OD) sau 24h ni cấy (hình 3.1a) (a) (b) Hình 1: Đồ thị biểu diễn sinh khối (a) BC (b) sau 24 h Vi sinh vật ni cấy chế độ khuấy từ có tốc độ sinh trưởng, phát triển sinh khối nhanh chế độ mơi trường lỏng đảo trộn liên tục, cung cấp khuếch tán oxy đồng dịch lỏng môi trường Sinh khối cấy vào ban đầu 0,04 g/L, chúng sinh trưởng phát triển nhanh chóng đạt đến nồng độ 0,7426 g/L sau ngày ni cấy sau tốc độ sinh trưởng chúng chậm lại lượng sinh khối tăng lên ngày thứ không đáng kể với hàm lượng 0,7807 g/L lúc hàm lượng chất dinh dưỡng có mơi trường suy giảm đáng kể Ở chế độ nuôi cấy lắc với tốc độ 200 rpm, vi sinh vật sinh trưởng phát triển chậm tăng hàm lượng từ 0,04 g/L đến 0,1270 g/L ngày nuôi cấy Ở ngày tiếp theo, tốc độ sinh trưởng vi sinh vật tăng lên cao đạt nồng độ cực đại với 0,3402 g/L ngày thứ Sau đó, hàm lượng vi sinh vật môi trường thay đổi không đáng kể ngày nuôi cấy cuối Ở ba chế độ khảo sát lại, tốc độ sinh trưởng phát triển vi sinh vật chậm khơng có thay đổi đáng kể nồng độ sinh khối suốt q trìn ni cấy Như vậy, chế độ ni cấy khảo sát hiệu suất thu hồi sinh khối môi trường lỏng chế độ khuấy từ cao với hiệu suất 0,1115 g/L/ngày cao nhiều so với chế độ có hiệu suất thu hồi cao thứ chế độ lắc 200 rpm với hiệu suất thu hồi 0,0486 g/L/ngày 28 BC polymer tự nhiên tổng hợp trình sinh trưởng phát triển cuả vi sinh vật Khả tổng hợp BC vi sinh vật xác định cách thu BC tạo sau 24h đem cân lấy khối lượng Ở chế độ ủ tĩnh, mật độ sinh khối vi sinh vật môi trường lỏng thấp khơng có thay đổi đáng kể suốt trình cấy tốc độ hàm sau ngày cao tất chế độ khảo sát với hàm lượng 14,8472 g/L chế độ này, hầu hết lượng đường vi sinh vật tập trung sử dụng để sinh BC bề mặt dịch lỏng mơi trường Trong đó, chế độ khuấy từ có mật độ vi sinh vật dịch lỏng tốc độ sinh trưởng nhanh lại khơng tạo BC q trình nuối cấy chế độ này, dịch lỏng khuấy đảo liên tục với vận tốc khuấy cao nên lượng BC nhỏ vừa tạo bị khuếch tán dịch lỏng mơi trường, khơng thể tạo BC có hình dạng, kích thước khối lượng lớn Bên cạnh đó, tổng hàm lượng đường giảm mạnh tỷ lệ thuận với tốc độ hàm lượng BC tạo chế độ khảo sát vi sinh vật sử dụng đường để sinh trưởng phát triển, tổng hợp sản phẩm BC (hình 3.2) Cụ thể, tổng hàm lượng đường chế độ ủ tĩnh giảm nhanh nhiều hàm lượng đường chế độ khuấy từ giảm chậm khơng q đáng kể Hình 2: Đồ thị biểu diễn tổng hàm lượng đường sau 24h Như vậy, với mục đích đề tài khảo sát trình thu nhận BC với hiệu suất lớn chế độ ủ tĩnh lựa chọn để tiến hành cho thí nghiệm khảo sát điều kiện 29 3.2 Ảnh hưởng nồng độ vi sinh vật ban đầu đến khả thu nhận BC Khi nồng độ vi sinh vật tăng lượng vi sinh vật có đơn vị thể tích tăng lên, đồng nghĩa với việc có nhiều lượng vi khuẩn tham gia sản xuất cellulose Tuy nhiên, nồng độ vi sinh vật tăng q cao lượng chất dinh dưỡng, khí oxy, khơng gian phát triển chúng bị hạn chế dẫn đến chúng cạnh tranh ức chế lẫn làm cho hiệu suất nuôi cấy giảm xuống (Seto cộng sự, 1985) Vì thí nghiệm này, nồng độ vi sinh vật khác 0,01 g/L, 0,04 g/L, 0,07 g/L 0,1 g/L cấy vào bình, ni cấy ủ tĩnh (đã chứng minh thí nghiệm trước) để khảo sát để xác định so sánh tốc độ sinh trưởng hiệu suất thu nhận BC phương pháp tương tự thí nghiệm trước (hình 3.3) (a) (b) Hình 3: Đồ thị biểu diễn sinh khối (a) BC (b) sau 24h Vi sinh vật nuôi cấy với mật độ tế bào ban đầu 0,1 g/L có tốc độ sinh trưởng, phát triển sinh khối nhanh đạt cực đại sau ngày với nồng độ 0,7241 g/L Sau đó, lượng chất dinh dưỡng môi trường dần càn kiệt, mật độ vi sinh vật môi trường lỏng cao khiến chúng cạnh tranh ức chế lẫn nhau, mật độ vi sinh vật giảm dần ngày 0,1625 g/L ngày cuối Tương tự với nồng độ 0,1 g/L, khảo sát với nồng độ vi sinh vật ban đầu 0,07 g/L, tốc độ sinh trưởng vi sinh vật nhanh mật độ vi sinh vật thu lớn, đạt cực đại với 0,6888 g/L sau ngày sau giảm dần ngày Mặt khác, mật độ vi sinh vật ban đầu 0,01 g/L 0,04 g/L phát triển sinh khối chậm gần thay đổi đáng kể suốt q trình nuôi cấy Như vậy, mật độ vi sinh vật cấy vào môi trường ban đầu khảo sát hiệu suất thu hồi sinh khối mơi trường lỏng mật độ 0,1 g/L cao với hiệu suất 0,1034 g/L/ngày 30 Lượng BC tạo sau ngày nuôi cấy tốc độ tăng hàm lượng BC nồng độ 0,04 g/L cao với 14,7855 g/L sau ngày nuôi cấy dù mật độ sinh khối môi trường lỏng thấp khơng có thay đổi đáng kể suốt q trình cấy Trong đó, khảo sát ni cấy với nồng độ ban đầu 0,1 g/L, tốc độ tăng sinh khối nhanh hàm lượng vi sinh vật lớn lại không thu BC suốt q trình ni cấy mật độ vi sinh vật q cao nên khơng có đủ không gian chất dinh dưỡng cần thiết để vi sinh vật thực tổng hợp cellulose Bên cạnh đó, với nồng độ ni cấy ban đầu 0,025 g/L mật độ vi sinh vật thấp nên khơng thu nhận BC q trình ni cấy Ngồi ra, tổng hàm lượng đường vi sinh vật sử dụng khảo sát tỷ lệ thuận với hàm lượng BC tạo q trình ni cấy (hình 3.4) Điều thể qua tổng hàm lượng đường giảm xuống nhiều nồng độ nuôi cấy ban đầu 0,04 g/L nồng độ 0,025 g/L Hình 4: Đồ thị biểu diễn tổng hàm lượng đường môi trường lỏng sau 24h Như vậy, với mục đích đề tài khảo sát trình thu nhận BC với hiệu suất lớn vi sinh vật cấy với mật độ ban đầu 0,04 g/L để khảo sát cho thí nghiệm 3.3 Ảnh hưởng pH môi trường đến sinh tổng hợp BC Sự tổng hợp cellulose vi khuẩn G xylinus phụ thuộc nhiều vào pH môi trường yếu tố khác nguồn sucrose, hàm lượng ammonium sulfate,… G xylinus hoạt động tốt mơi trường có khoảng pH từ đến (Zakaria cộng sự, 2012) Vì vậy, 31 TN này, G xylinus cấy vào MBC có pH thay đổi từ – 6, với nồng độ sinh khối ban đầu 0,04 g/L chế độ nuôi cấy ủ tĩnh Kết thu biểu diễn Hình 3.5 (a) (b) Hình 5: Đồ thị biểu diễn sinh khối (a) BC (b) sau 24 h Sinh khối vi sinh vật nuôi cấy môi trường pH tăng chậm ngày q trình ni cấy, sau phát triển nhanh đạt cực đại ngày thứ với mật độ 0,1286 g/L sau giảm dần ngày cuối xuống 0,0802 g/L Ở môi trường pH 5, vi sinh vật phát triển chậm, không đáng kể ngày sau sinh khối tăng nhanh đạt cực đại ngày thứ với nồng độ 0,1062 g/L sau giảm dần 0,0617 g/L ngày thứ Trong đó, vi sinh vật mơi trường pH có tốc độ phát triển sinh khối chậm gần khơng có thay đổi đáng kể suốt ngày khảo sát Như vậy, với mơi trường có độ pH khác nhau, hiệu suất thu hồi sinh khối môi trường pH cao với hiệu suất 0,0183 g/L/ngày Ngược lại, khả tổng hợp BC vi sinh vật pH môi trường tốt với tốc độ cao hàm lượng lớn 19,0717 g/L cao gấp hai lần hàm lượng BC thu nhận môi trường pH sau ngày với 9,5954 g/L Đồng thời, tổng hàm lượng đường sử dụng vi sinh vật môi trường pH nhiều nhanh tốc độ sử dụng đường vi sinh vật môi trường pH lại chậm (hình 3.6) Tuy tốc độ tăng sinh khối vi sinh vật môi trường pH thấp hàm lượng BC thu nhận lại cao nhất, chất lượng BC thu pH có chất lượng tốt Theo nghiên cứu trước đây, BC thu pH có độ dày, khả hút giữ nước tốt (Jagannath cộng sự, 2008) 32 Hình 6: Đồ thị biểu diễn tổng hàm lượng đường sau Như vậy, với mục đích đề tài khảo sát q trình thu nhận BC với hiệu suất cao mơi trường tối ưu để ni cấy chủng Gluconacetobacter xylinus môi trường pH4 3.4 Khảo sát hiệu suất cố định enzyme lipase Để xác định xem có thay đổi cấu trúc BC sau xử lý acetyl hóa, cấu trúc hóa học cấu trúc bề mặt BC trước sau xử lý phân tích  Cấu trúc bề mặt Hai mẫu BC chưa xử lí BC xử lí bề mặt sấy khô đến khối lượng không đổi 600C 12 Sau mẫu gửi đến khu công nghệ cao quận để tiến hành chụp SEM Từ kết chụp SEM hình (3.7) với độ phóng đại mẫu (a) mẫu (b) có độ khác biệt cấu trúc màng BC, sợi cellulose mẫu BC acetyl hố tách rời (Hình 3.7b) Sự thay đổi nhóm -OH thay nhóm acetyl làm cho BC từ ưa nước sang kỵ nước Hay nói cách khác, khả thấm nước BC giảm mạnh sau acetyl hoá, điều khẳng định biến đổi hoá học xảy bề mặt màng BC Màng BC acetyl hoá với bề mặt kỵ nước có khả hoạt động tốt với mơi trường kỵ nước, từ giúp cho enzyme lipase dễ dàng hoạt động môi trường ưa béo (Hu cộng sự, 2011) 33 (a) (b) Hình 7: Kết chụp SEM BC (a) BC acetyl hóa (b)  Cấu trúc hóa học: Để xác định có xuất gốc acetyl BC sau xử lý hay không, sử dụng phổ hồng ngoại FTIR để xác định nhóm chức BC trước sau xử lý Hình (3.8) cho thấy phổ FTIR mẫu BC mẫu BC acetyl hoá Kết cho thấy vùng hấp thụ rộng mạnh nằm 3200-3600 cm-1 hấp thụ nhóm O–H duỗi thẳng Sự hấp thụ tạo có thay phần gốc hydroxyl thành gốc acetyl phân tử (Hu cộng sự, 2011) Đỉnh 1367 cm-1 có uốn cong liên kết methyl -O(C=O)-CH3, đồng thời dải hấp thụ từ 1205 cm-1 đến 1105 cm-1 cho có kéo dãn liên kết C-O nhóm acetyl Ngồi ra, đỉnh 1425 1563 cm-1 cho thấy mẫu có chứa nhóm carboxylate tồn tên bề mặt, đỉnh 1030 cm-1 cịn liên quan đến nhóm chức C-O-C ether (Moosavi-Nasab cộng sự, 2010) 34 Hình 8: So sánh phổ FTIR mẫu BC BC acetyl hóa Enzyme có chất protein thơng qua việc xác định hàm lượng protein có dung dịch enzyme cịn dư sau cố định gián tiếp xác định lượng enzyme có mẫu cần khảo sát Hàm lượng protein mẫu enzyme lipase thể bảng 3.2 Bảng 1: Hàm lượng protein mẫu enzyme tự (5mg/mL), BC, enzyme cố định BC, enzyme cố định BC acetyl hóa Mẫu Hàm lượng protein (g/mL) Enzyme tự (5mg/ml) 240,580 Enzyme dư sau cố định lên BC 229,476 Enzyme dư sau cố định lên BC acetyl hóa 66,252 35 Lượng protein có dung dịch enzyme dư sau thực cố định lên BC qua acetyl hóa 66,252 g/mL, thấp nhiều so với lượng protein dung dịch enzyme dư mẫu cố định BC với 229,476 g/mL Điều cho thấy bề mặt BC qua xử lý acetyl hóa có khả tương thích tốt với enzyme lipase so với BC nguyên Vì vậy, hiệu suất cố định enzyme lipase BC nguyên khoảng 38% hiệu suất cố định enzyme BC qua xử lý acetyl hóa 82,1% 3.5 Khảo sát hoạt độ enzyme lipase cố định BC Bảng 2: Hoạt độ enzyme lipase mẫu enzyme tự do, enzyme cố định BC enzyme cố định BC acetyl hóa Hoạt độ enzyme (U) 7,6x10-4 8,2x10-4 7,3x10-4 Mẫu Lipase tự Lipase cố định BC Lipase cố định BC acetyl hóa Một đơn vị hoạt độ enzyme lipase (U) định nghĩa lượng enzyme lipase cần thiết để tạo mol acid béo tự phút điều kiện khảo sát (Soares cộng sự, 1999) Do đó, enzyme có số đơn vị U thấp hoạt độ cao Với kết thu cho thấy enzyme lipase sau cố định BC cịn giữ hoạt độ Đã có nhiều nghiên cứu enzyme cố định có hoạt độ cao so với enzyme tự (da Silva cộng sự, 2008) Bên cạnh đó, với hiệu suất cố định enzyme cao nhiều so với BC nguyên bản, lipase cố định BC acetyl hóa, lượng enzyme gắn BC acetyl hóa lớn Do đó, hoạt độ enzyme lipase cố định BC acetyl hóa cao với 7,3x10-4 U lipase cố định BC nguyên có hoạt độ thấp với 8,2x10-4 U 36 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Chủng vi sinh vật Gluconacetobacter xylinus nghiên cứu nhiều nước giới trình thu nhận BC với điều kiện nuôi cấy khác Thông qua thí nghiệm thực hiện, kết luận điều kiện nuôi cấy tốt để thu BC mà nghiên cứu khảo sát ni cấy chủng vi sinh vật 30˚C, môi trường nuôi cấy có pH 4, nồng độ vi sinh vật ban đầu cấy vào môi trường lỏng 0,04 g/L, ủ tĩnh ngày liên tiếp Quá trình nuôi cấy vi khuẩn để thu BC phương pháp cố định enzyme sử dụng nghiên cứu thực cách đơn giản, chi phí thấp so sánh với vật liệu cố định đắt tiền acrylic resin (Poojari cộng sự, 2013), hạt nano Fe3O4 (Xie cộng sự, 2009) Tuy nhiên, hiệu suất cố định enzyme lipase lên BC qua xử lý bề mặt phương pháp acetyl hóa lên đến 82,5%, cao đáng kể so với hiệu suất 47% nghiên cứu cố định enzyme lipase vật liệu alginate/BC trước (Kim cộng sự, 2017) Bên cạnh đó, hoạt độ enzyme lipase cố định BC ghi nhận cao so với hoạt độ enzyme tự Vì vậy, nói BC vật liệu phù hợp tiềm để ứng dụng việc cố định enzyme lipase quy mơ phịng thí nghiệm quy mơ thương mại đặc tính sinh học lợi ích kinh tế mà đem lại 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Aravindan, R., et al (2007) "Lipase applications in food industry." Barud, H S., et al (2008) "Thermal behavior of cellulose acetate produced from homogeneous acetylation of bacterial cellulose." 471(1-2): 61-69 Bayazidi, P., et al (2018) "Immobilization of lysozyme on bacterial cellulose nanofibers: Characteristics, antimicrobial activity and morphological properties." 107: 2544-2551 Biswas, A., et al (2005) "Solvent-free process to esterify polysaccharides." 6(4): 18431845 Cai, Q., et al (2018) "Enhanced activity and stability of industrial lipases immobilized onto spherelike bacterial cellulose." 109: 1174-1181 Campano, C., et al (2016) "Enhancement of the fermentation process and properties of bacterial cellulose: a review." 23(1): 57-91 Cannon, R E and S M J C r i m Anderson (1991) "Biogenesis of bacterial cellulose." 17(6): 435-447 Casas-Godoy, L., et al (2018) Lipases: an overview Lipases and Phospholipases, Springer: 3-38 Chawla, P R., et al (2009) "Microbial cellulose: fermentative production and applications." 47(2): 107-124 10 Cho, S and N Almeida (2012) Dietary fiber and health, CRC Press 11 Czaja, W K., et al (2007) "The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications." 8(1): 1-12 12 da Silva, V C., et al (2008) "Characterization and catalytic activity of free and immobilized lipase from Aspergillus niger: a comparative study." 19(8): 1468-1474 13 Drozd, R., et al (2018) "The application of magnetically modified bacterial cellulose for immobilization of laccase." 108: 462-470 14 Esa, F., et al (2014) "Overview of bacterial cellulose production and application." 2: 113-119 15 Fontana, J D., et al (2017) New insights on bacterial cellulose Food biosynthesis, Elsevier: 213-249 16 Gargouri, Y., et al (1989) "Gastric lipases: biochemical and physiological studies." 1006(3): 255-271 38 17 Gonỗalves Filho, D., et al (2019) "Lipases: sources, immobilization methods, and industrial applications." 103(18): 7399-7423 18 Gonzalez-Alfonso, J L., et al (2018) Lipase-Catalyzed Synthesis of Fatty Acid Esters of Trisaccharides Lipases and Phospholipases, Springer: 287-296 19 Haki, G and S J B t Rakshit (2003) "Developments in industrially important thermostable enzymes: a review." 89(1): 17-34 20 Hasan, F., et al (2010) "Enzymes used in detergents: lipases." 9(31): 4836-4844 21 Hu, W., et al (2011) "Solvent-free acetylation of bacterial cellulose under moderate conditions." 83(4): 1575-1581 22 Ifuku, S., et al (2007) "Surface modification of bacterial cellulose nanofibers for property enhancement of optically transparent composites: dependence on acetylgroup DS." 8(6): 1973-1978 23 Iguchi, M., et al (2000) "Bacterial cellulose—a masterpiece of nature's arts." 35(2): 261270 24 Iso, M., et al (2001) "Production of biodiesel fuel from triglycerides and alcohol using immobilized lipase." 16(1): 53-58 25 Jagannath, A., et al (2008) "The effect of pH, sucrose and ammonium sulphate concentrations on the production of bacterial cellulose (Nata-de-coco) by Acetobacter xylinum." 24(11): 2593 26 Jagannath, A., et al (2010) "Comparative evaluation of bacterial cellulose (nata) as a cryoprotectant and carrier support during the freeze drying process of probiotic lactic acid bacteria." 43(8): 1197-1203 27 Jin, Y H., et al (2019) "Improved production of bacterial cellulose from waste glycerol through investigation of inhibitory effects of crude glycerol-derived compounds by Gluconacetobacter xylinus." 75: 158-163 28 Jonas, R and L F Farah (1998) "Production and application of microbial cellulose." Polymer Degradation and Stability 59: 101 - 106 29 Jonas, R., et al (1998) "Production and application of microbial cellulose." 59(1-3): 101-106 30 Kato, N., et al (2007) "Viability and cellulose synthesizing ability of Gluconacetobacter xylinus cells under high-hydrostatic pressure." 11(5): 693-698 39 31 Kersters, K., et al (2006) "The family acetobacteraceae: the genera acetobacter, acidomonas, asaia, gluconacetobacter, gluconobacter, and kozakia." 5: 163-200 32 Kim, J H., et al (2017) "Alginate/bacterial cellulose nanocomposite beads prepared using Gluconacetobacter xylinus and their application in lipase immobilization." 157: 137-145 33 Krystynowicz, A., et al (2002) "Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose." 29(4): 189-195 34 Lee, D.-W., et al (1999) "Isolation and characterization of a thermophilic lipase from Bacillus thermoleovorans ID-1." 179(2): 393-400 35 Lin, S.-P., et al (2013) "Biosynthesis, production and applications of bacterial cellulose." 20(5): 2191-2219 36 Linko, Y.-Y., et al (1998) "Biodegradable products by lipase biocatalysis." 66(1): 41-50 37 Liu, C.-H., et al (2009) "Characterization of Burkholderia lipase immobilized on celite carriers." 40(4): 359-363 38 Mamura, S and S J J B Kitaura (2000) "Purification and characterization of monoacylglycerol lipase from the moderately thermophilic Bacillus species H-2575." 127: 419-425 39 Meftahi, A., et al (2010) "The effects of cotton gauze coating with microbial cellulose." 17(1): 199-204 40 Moayedallaie, S., et al (2010) "Bread improvers: Comparison of a range of lipases with a traditional emulsifier." 122(3): 495-499 41 Moosavi-Nasab, M., et al (2010) "Investigation of physicochemical properties of the bacterial cellulose produced by Gluconacetobacter xylinus from date syrup." 44: 1258-1263 42 Nguyễn, T H (2008) "Ảnh hưởng nguồn chất kiểu lên men đến suất chất lượng cellulose vi khuẩn." 43 Nguyễn, T H J L t s s h., ĐHQG TP HCM (2006) "Tuyển chọn cải thiện chủng Acetobacter xylinum tạo cellulose vi khuẩn để sản xuất ứng dụng quy mô pilot." 44 Nguyễn, T H J T c D t h v ứ d (2003) "Phạm Thành Hổ, Chọn lọc dịng Acetobacter xylinum thích hợp cho loại môi trường dùng sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn." 3: 49 40 45 Nielsen, S S (2010) Food analysis, Springer 46 Okiyama, A., et al (1992) "Bacterial cellulose II Processing of the gelatinous cellulose for food materials." 6(5): 479-487 47 Ortiz, C., et al (2019) "Novozym 435: the “perfect” lipase immobilized biocatalyst?" 9(10): 2380-2420 48 Poojari, Y., et al (2013) "Thermal stability of Candida antarctica lipase B immobilized on macroporous acrylic resin particles in organic media." 2(1): 7-11 49 Reis, P., et al (2009) "Lipases at interfaces: a review." 147: 237-250 50 Rezaee, A., et al (2008) "Microbial cellulose as support material for the immobilization of denitrifying bacteria." 7(5) 51 Rodrigues, R C and R J J o m c B E Fernandez-Lafuente (2010) "Lipase from Rhizomucor miehei as a biocatalyst in fats and oils modification." 66(1-2): 15-32 52 Ruka, D R., et al (2012) "Altering the growth conditions of Gluconacetobacter xylinus to maximize the yield of bacterial cellulose." 89(2): 613-622 53 Salgado, L F (2015) Genetic analysis of cellulose crystallization in Gluconacetobacter xylinus, University of Ontario Institute of Technology (Canada) 54 Sarney, D B., et al (1994) "Lipase-catalyzed synthesis of lysophospholipids in a continuous bioreactor." 71(1): 93-96 55 Schmid, R D and R J A C I E Verger (1998) "Lipases: interfacial enzymes with attractive applications." 37(12): 1608-1633 56 Seto, M., et al (1985) "Effect of bacterial density and substrate concentration on yield coefficients." 50(5): 1132-1136 57 Sharma, R., et al (2001) "Production, purification, characterization, and applications of lipases." 19(8): 627-662 58 Shimada, Y., et al (1999) "Conversion of vegetable oil to biodiesel using immobilized Candida antarctica lipase." 76(7): 789-793 59 Shoda, M., et al (2005) "Recent advances in bacterial cellulose production." 10(1): 60 Singh, A K., et al (2012) "Overview of fungal lipase: a review." 166(2): 486-520 61 Soares, C M., et al (1999) Characterization and utilization of Candida rugosa lipase immobilized on controlled pore silica Twentieth Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, Springer 41 62 Sun, D., et al (2010) "Bacterial cellulose/TiO2 hybrid nanofibers prepared by the surface hydrolysis method with molecular precision." 2(2): 287-292 63 Ul-Islam, M., et al (2019) "Comparative study of plant and bacterial cellulose pellicles regenerated from dissolved states." 137: 247-252 64 Ullah, H., et al (2016) "Applications of bacterial cellulose in food, cosmetics and drug delivery." 23(4): 2291-2314 65 Vakhlu, J J E J o B (2006) "Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning." 9(1): 0-0 66 Vandamme, E., et al (1998) "Improved production of bacterial cellulose and its application potential." 59(1-3): 93-99 67 Wang, J., et al (2019) "Bacterial cellulose production, properties and applications with different culture methods–A review." 219: 63-76 68 Waterborg, J H (2009) The Lowry method for protein quantitation The protein protocols handbook, Springer: 7-10 69 Wu, S.-C and Y.-K J J o M C B E Lia (2008) "Application of bacterial cellulose pellets in enzyme immobilization." 54(3-4): 103-108 70 Xie, W., et al (2009) "Immobilized lipase on Fe3O4 nanoparticles as biocatalyst for biodiesel production." 23(3): 1347-1353 71 Yamada, Y., et al (1997) "The phylogeny of acetic acid bacteria based on the partial sequences of 16S ribosomal RNA: the elevation of the subgenus Gluconoacetobacter to the generic level." 61(8): 1244-1251 72 Yao, W., et al (2011) "Bacterial cellulose membrane–A new support carrier for yeast immobilization for ethanol fermentation." 46(10): 2054-2058 73 Yoshinaga, F., et al (1997) "Research progress in production of bacterial cellulose by aeration and agitation culture and its application as a new industrial material." 61(2): 219-224 74 Yoshino, T., et al (1996) "Cellulose production by Acetobacter pasteurianus on silicone membrane." 81(1): 32-36 75 Zakaria, J and M Nazeri (2012) Optimization of bacterial cellulose production from pineapple waste: effect of temperature, pH and concentration 5th Engineering Conference," Engineering Towards Change-Empowering Green Solutions 42 ... đánh giá điều kiện thu nhận màng cellulose từ G xylinus để cố định enzyme lipase Nội dung nghiên cứu Đề tài ? ?Khảo sát điều kiện thu nhận màng cellulose từ G xylinus để cố định enzyme lipase? ?? gồm... cụ thể việc cố định loại enzyme vật liệu BC Do đó, nghiên cứu thực để khảo sát điều kiện nuôi cấy khác nhằm thu nhận BC từ chủng Gluconacetobacer xylinus, từ sử dụng BC để cố định enzyme Mục tiêu... Bảng 2: Hoạt độ enzyme lipase mẫu enzyme tự do, enzyme cố định BC enzyme cố định BC acetyl hóa Hoạt độ enzyme (U) 7,6x10-4 8,2x10-4 7,3x10-4 Mẫu Lipase tự Lipase cố định BC Lipase cố định BC acetyl