Sản xuất và ứng dụng màng cellulosc vi khuẩn làm màng lọc vi sinh trong lọc nước

LỜI CẢM ƠN Trong suốt bốn năm rưỡi học tập, em nhận nhiều dìu dắt tất thầy cô trường Giúp chúng em nắm vững kiến thức chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học chúng em có đủ hành trang để bước vào sống Để hôm nay, chúng em, lần thực đề tài lớn, tự độc lập nghiên cứu học tập Chúng em hiểu rõ hội để chúng em vận dụng tất kiến thức học vào thực tiễn, trình bày báo cáo vấn đề khoa học cách khoa học, logic Để có thành cơng ngày hôm Lời xin cảm ơn bố mẹ ủng hộ, động viên tạo điều kiện cho hồn thành tốt chương trình học Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô giáo Trường Đại Học Tôn Đức Thắng đặc biệt thầy cô Khoa Khoa Học Ứng Dụng hết lòng truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian em học trường Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Ngô Minh Nhã hướng dẫn em đợt thực tập lời cảm ơn đến anh chị khoa Sinh Học Ứng Dụng trường Cao Đẳng Kinh Tế Cơng Nghệ TP HỒ CHÍ MINH Một lần em xin chúc tất thầy cô bạn bè lời chúc sức khỏe thành đạt sống! SVTH: Nguyễn Thùy Dung i TÓM TẮT LUẬN VĂN Công nghệ màng lọc cho “Công nghệ xanh” áp dụng rộng rãi cơng nghệ lọc nước Q trình lọc nước màng lọc đem lại hiệu lượng gây ô nhiễm cho môi trường Hiện nay, Việt Nam dang sử dụng nhiều cơng nghệ lọc nước có sử dụng màng lọc: Vi lọc, siêu lọc, lọc thẩm thấu ngược Các màng lọc phải nhập từ nước ngồi nên giá thành nước lọc cịn cao chưa đáp ứng nhu cầu sử dụng nước người dân Vì vậy, việc tìm loại màng lọc giá thành rẻ sản xuất nước vấn đề cần giải Do đó, cơng nghệ màng lọc sử dụng rộng rãi giới Việt Nam Chính lý đó, để đáp ứng nhu cầu trên, thực đề tài “Sản xuất ứng dụng màng cellulose vi khuẩn làm màng lọc vi sinh lọc nước” Màng BC tạo vi khuẩn Acetobacter Xylinum theo phương pháp lên men tĩnh truyền thống trải mỏng Màng BC thu sau lên men với bề dày 0,5mm; 1,0mm; 1,5mm; 2,0mm; 2,5mm; khảo sát số tính chất học khả lọc nước Màng BC dày 1,0mm cho kết lọc nước khả quan với kết lọc sau: Lọc 100% vi khuẩn nước, tốc độ thẩm thấu 392,964 lít/m2giờ độ bền kéo 25,3Mpa Theo định hướng ứng dụng màng BC làm màng lọc nước tiến hành kiểm chứng khả lọc màng màng BC đưa vào thí nghiệm ứng dụng bình lọc nước Các kết tiêu xét nghiệm vi sinh qua màng lọc BC cho thấy màng BC đủ điều kiện để đáp ứng yêu cầu làm màng lọc nước Chi phí 1m2 màng lọc dày 1mm 9738VNĐ so với màng lọc vi sinh thị trường dùng để lọc nước giá thành loại màng lọc thấp ii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt luận văn ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách hình vii Danh sách bảng viii Danh sách sơ đồ ix Danh sách biểu đồ x CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 CELLULOSE VI KHUẨN (BACTERIAL CELLULOSE – BC) 2.1.1 Lịch sử nghiên cứu 2.1.2 Cellulose vi khuẩn 2.1.3 Vi sinh vật sản sinh cellulose 2.1.4 Quá trình tổng hợp cellulose 12 2.1.5 Ảnh hưởng yếu tố dinh dương điều kiện nuôi cấy đến trình len men sản xuất cellulose vi khuẩn 14 2.1.6 Ứng dụng màng BC 17 2.2 MÀNG LỌC NƯỚC 19 2.2.1 Các loại màng lọc nước 19 2.2.2 Tính chất màng lọc nước 20 2.2.3 Chất lượng màng lọc nước 23 2.3 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CHẤT LƯỢNG NƯỚC 24 2.4 CÁC CHỈ TIÊU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NƯỚC 27 iii CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 32 3.2 VẬT LIỆU 32 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 3.3.1 Nội dung nghiên cứu 34 3.3.2 Kiểm tra số tính đặc điểm sinh học chủng Acetobacter xylinum 35 3.3.3 Phương pháp lên men tĩnh truyền thống trải mỏng tạo màng BC 36 3.3.4 Ứng dụng màng BC bình lọc nước 40 3.3.5 Các phương pháp kiểm tra chất lượng nước lọc 41 3.3.6 Phương pháp xác định độ pH 42 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 KIỂM TRA MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG ACETOBACTER XYLINUM 43 4.1.1 Kiểm tra vi thể 43 4.1.2 Kiểm tra đại thể 43 4.2 PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN TĨNH TRUYỀN THỐNG TRẢI MỎNG TẠO MÀNG BC 44 4.2.1 Lên men tạo màng BC 45 4.2.2 Bề dày màng 46 4.2.3 Đo khả thẩm thấu màng 47 4.2.4 Kiểm tra vi sinh sau lọc 48 4.2.5 Độ bền học màng BC 51 4.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LỌC NƯỚC CỦA MÀNG BC TRONG BÌNH LỌC NƯỚC 50 4.3.1 Khả lọc vi sinh 50 4.3.2 Khả thẩm thấu màng BC bình lọc nước 51 4.3.3 So sánh khả lọc nước màng BC với màng lọc sứ bình lọc nước51 4.4 TÍNH KINH TẾ 52 iv CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 54 5.2 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI 54 5.3 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 57 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BC Bacteria cellulose CS Cellulose synthase FK Fructokinase Fru-bi-P Fructose-1,6-bi-phosphate Fru-6-P Fructose-6-phosphate FBP Fructose-1,6-biphosephate phosphatase GK Glucokinase G6PDH Glucose-6-phosphate dehydrogenase Glc-6-P Glucose-6-phosphate Glc-1-P Glucose-1-phosphate Gluconcogenenis Glucose giải 1PFK Fructose-1-phpsphate kinase PC Cellulose thực vật PGA Phosphogluconic acid PGI Phosphoglucoisomerase PGM Phosphoglucomutase PTS Hệ thống phosphotransferase SPW Nước peptone (Saline Petone Water) UDPGlc Uridine diphosphoglucose UGP UDP-gluccose pyrophosphorylase vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Màng Bacteria cellulose Hình 2.2 Màng BC Acetobacter xylinum kính hiển vi điện tử điều kiện nuôi khác Hình 2.3 Vi khuẩn Acetobacter xylinum 11 Hình 2.4 Màng BC điều kiện nuôi cấy tĩnh 15 Hình 2.5 Màng BC điều kiện ni cấy có sử dụng cánh khuấy 15 Hình 2.6 Cấu trúc màng lọc Cellulose acetate 20 Hình 2.7 Cấu trúc màng lọc Cellulose nitrate 21 Hình 2.8 Cấu trúc màng lọc Cellulose tái sinh 21 Hình 2.9 Cấu trúc màng lọc Cellulose triacetate 22 Hình 2.10 Một đoạn màng UF (dày 0,2mm) 22 Hình 2.11 Lọc màng UF 23 Hình 3.1 Bình lọc nước 40 Hình 3.2 Bộ lọc bình lọc nước 41 Hình 4.1 Giống Acetobacter xylinum 43 Hình 4.2 Khuẩn lạc Acetobacter xylinum 44 Hình 4.3 Acetobacter xylinum mơi trường lỏng 44 Hình 4.4 Màng BC thu từ phương pháp lên men truyền thống trải mỏng chưa xử lý 45 Hình 4.5 Màng BC thu từ phương pháp lên men truyền thống trải mỏng xử lý 46 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1Cấu trúc màng phụ thuộc vào loại vi khuẩn tạo màng cellulose Bảng 2.2 Phân loại vi khuẩn acetic theo Frateur Bảng 2.3 Ảnhhưởng loại đường khác đến hình thành màng BC nước dừa pH= 5,0 14 Bảng 2.4 Ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC 16 Bảng 2.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng nước nước dừa pH= 5,0 17 Bảng 2.6 Tính chất số loại màng lọc 24 Bảng 2.7 Phân loại độ cứng 25 Bảng 2.8 Chỉ tiêu vi sinh vật cho nước uống đóng chai 27 Bảng 2.9 Chỉ tiêu cảm quan nước uống 27 Bảng 2.10 Chỉ tiêu hóa lý nước uống Châu Âu 28 Bảng 2.11 Chỉ tiêu vi sinh nước uống 31 Bảng 4.1 Xác định bề dày màng BC 45 Bảng 4.2 Bề dày màng BC 47 Bảng 4.3 Tốc độ thẩm thấu màng 47 Bảng 4.4 Kết kiểm tra khả lọc vi sinh màng BC áp suất thường 48 Bảng 4.5 Kết kiểm tra khả lọc vi sinh màng BC áp suất chân không 49 Bảng 4.6 Độ bền kéo màng 50 Bảng 4.7 Kết lọc vi sinh màng BC màng lọc sứ 50 Bảng 4.8 Khả thẩm thấu màng BC màng lọc sứ 51 Bảng 4.9 Chất lượng nước lọc màng BC màng lọc sứ 51 Bảng 4.10 Chi phí mơi trường nhân giống 52 Bảng 4.11 Chi phí mơi trường lên men 52 Bảng 4.12 Chí phí xử lý màng BC sau lên men 53 viii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1 So sánh đường kính sợi BC với sợi tự nhiên nhân tạo Sơ đồ 2.2 Con đường chuyển hóa fructose glucose tạo cellulose Acetobacter xylinum 13 Sơ đồ 3.1 Phương pháp nghiên cứu 34 Sơ đồ 3.2 Quá trình tạo màng BC thô 36 Sơ đồ 3.3 Phương pháp xử lý màng BC sau lên men 38 ix DANH SÁCH BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1 So sánh tốc độ thẩm thấu 48 x Quy trình định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí 1ml mẫu + 9ml SPW, đồng stomacher 30 giâydung dịch 10-1 Pha loãng 10-2,10 -3,10-4… Cấy 1ml dung dịch mẫu pha lỗng vào đĩa peptri vơ trùng Cấy độ pha loãng liên tiếp, độ pha loãng đĩa Đổ vào đĩa cấy mẫu 15-20ml môi trường PCA đun tan để nguội đến 45oC Lắc cho mẫu khuếch tán vào môi trường Để đĩa mặt phẳng ngang cho môi trường đông đặc Lật ngược đĩa ủ tủ ấm (30±1 oC 72±6 giờ) Chọn đĩa có số khuẩn lạc khoảng 25-250 khuẩn lạc/ đĩa để đếm Tính kết quả: Tổng vi sinh vật hiếu khí mẫu (CFU/ml) 70 Cách tính kết Mật độ vi sinh vật hiếu khí 1ml (TCP) tính sau: TCP (CFU / ml )  N n1Vf1   niVf i N: Tổng số khuẩn lạc đếm đĩa n: Số đĩa nồng độ V: Thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa (ml) f: Độ pha lỗng tương ứng 71 Quy trình định lượng Coliform phương pháp đếm khuẩn lạc 1ml mẫu + 9ml SPW, đồng stomacher 30 giâydung dịch 10-1 Pha loãng 10-2,10 -3,10-4… Cấy 1ml dung dịch mẫu pha lỗng vào đĩa peptri vơ trùng Cấy độ pha loãng liên tiếp , độ pha loãng đĩa Đổ vào đĩa cấy mẫu 5-10ml môi trường TSA đun tan để nguội đến 45oC Lắc cho mẫu khuếch tán vào môi trường để yên 1-2 Đổ thêm đĩa 10-15ml môi trường VRB đun tan để nguội đến 45 oC Để yên đến đông Lật ngược đĩa ủ tủ ấm (37±1oC 24-48 giờ) Đếm khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vịng tủa muối mật, đường kính 0,5mm, chọn khuẩn lạc Cấy vào ống nghiệm có chứa mơi trường BGBL ống Durham úp ngược Ủ 37oC 24-48 Đếm ống BGBL (+)sinh hơi, tính tỉ lệ khẳng định Coliform Mật độ Colifrom 72 Cách tính kết Mật độ Coliform có 1ml mẫu tính sau: Xác định tỉ lệ khẳng định R Số khuẩn lạc sinh BGBL R= Số khuẩn lạc cấy Mật độ Coliform C (CFU/ml) C N xR nVf n: Số đĩa nồng độ pha lỗng V: Thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa (ml) f: Độ pha loãng tương ứng 73 Quy trình phân tích E coli phương pháp đếm khuẩn lạc Chọn ống sinh môi trường BGBL, cấy sang môi trường EMB agar ủ 37,0C ±0,5oC 24 Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim tím, đường kính khoảng 1mm, cấy chuyền vào mơi trường thử nghiệm sinh hóa: canh tryptone, MR-VP, SCA ủ 44,5±0,2oC 24 Thử nghiệm IMViC E.coli có biểu sinh hóa: Indol(+), Methyl red (+), Voges Proskauer (-), Citrate (-) Dựa vào ống sinh IMViC ++ tra bảng MPN Mật độ E coli 74 Thử nghiệm sinh hóa  Thử nghiệm indol: Thuốc thử cho kiểm nghiệm Kovacs Trước cho thuốc thử vào canh khuẩn môi trường tryptone, bổ sung 1ml ether xylene vào ống nghiệm, lắc để chiết tách indol lên lớp dung môi hữu Nhỏ giọt thuốc thử vào canh khuẩn, để yên vài phút theo dõi tạo màu lớp dung môi hữu Đọc kết quả: thử nghiệm dương (+) có xuất lớp màu đỏ bề mặt mơi trường, âm (-) có lớp màu vàng thuốc thử bề mặt môi trường Đơi có xuất màu cam skatol, tiền chất methyl hóa indol tạo  Thử nghiệm methyl red (MR) Nhỏ vài giọt thuốc thử Methyl red vào canh khuẩn môi trường MR-VP, lắc đều, đọc kết Đọc kết quả: thử nghiệm dương (+) mơi trường có màu đỏ sau bổ sung thuốc thử, âm (-) có màu vàng Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống canh khuẩn thêm ngày thực lại thử nghiệm  Thử nghiệm Voges- Proskauer (VP) Thuốc thử dùng thử nghiệm dung dịch A dung dịch B Nhỏ giọt dung dịch A sau nhỏ tiếp giọt dung dịch B, lắc nhẹ, đọc kết sau 20 phút chậm sau Đọc kết quả: thử nghiệm VP dương (+) có màu đỏ bề mặt mơi trường, âm (-) bề mặt môi trường không đổi màu  Thử nghiệm Citrate Không sử dụng thuốc thử thử nghiệm mà quan sát thay đổi màu sắc môi trường sau ủ Đọc kết quả: thử nghiệm Citrate dương (+) môi trường xuất sinh khối chuyển sang màu xanh da trời, âm (-) môi trường sinh khối chuyển màu 75 Phụ lục Hình 4.1 Vi sinh vật hiếu khí mơi trường PCA Hình 4.1Khuẩn lạc Coliform mơi trường TSA mơi trường VRB 76 Hính 4.3 Mơi trường BGBL Hình 4.4 Kết dương tính (+) mơi trường BGBL Hình 4.5 Kết âm tính (-) mơi trường BGBL 77 Hình 4.6 Khuẩn lạc E.coli mơi trường EMB Hình 4.7 Mơi trường nước Tryptone Hình 4.8 Kết âm tính (-) mơi trường nước tryptone 78 Hình 4.9 Kết dương (+) tính mơi trường nước tryptone Hình 4.10 Mơi trường MR-VP Hình 4.11 Kết dương tính(+) âm tính (-) mơi trường MR-VP thử nghiệm Methyl Red 79 Hình 4.12 Kết âm tính (-) mơi trường MR-VP thử nghiệm VP Hình 4.13 Mơi trường SCA Hình 4.14 Kết dương tinh (+) âm tính (-) mơi trường SCA thử nghiệm citrate 80 Hình 4.15 Kích thước màng BC dày 1mm Hình 4.16 Thước đo bề dày màng 81 Hình 4.17 Dụng cụ đo áp suất thẩm thấu màng lọc Hình 4.18 Máy bơm chân khơng 82 Phụ lục 5: 5.1 Số liệu khảo sát bề dày màng BC thí nghiệm phần mềm thống kê ANOVA Table for the tich dung dich by be day mang BC Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 12643.7 3160.93 6773.43 0.0000 Within groups 4.66667 10 0.466667 Total (Corr.) 12648.4 14 The StatAdvisor Multiple Range TesMultiple Range Tests for the tich dung dich by be day mang BC -Method: 95.0 percent LSD be day mang BC Count Mean Homogeneous Groups -0.5 44.0 X 53.6667 X 1.5 83.6667 X 104.333 X 2.5 120.333 X -Contrast Difference +/- Limits -0.5 - *-9.66667 1.2428 0.5 - 1.5 *-39.6667 1.2428 0.5 - *-60.3333 1.2428 0.5 - 2.5 *-76.3333 1.2428 - 1.5 *-30.0 1.2428 - *-50.6667 1.2428 - 2.5 *-66.6667 1.2428 1.5 - *-20.6667 1.2428 1.5 - 2.5 *-36.6667 1.2428 - 2.5 *-16.0 1.2428 -* denotes a statistically significant difference 83 5.2 Số liệu khảo sát tốc độ thẩm thấu phần mềm thống kê ANOVA table for the toc tham thau by be day mang Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 218381.0 54595.3 6950.67 0.0000 Within groups 78.5468 10 7.85468 Total (Corr.) 218460.0 14 The StatAdvisor Multiple Range Tests for to tham thau by mau -Method: 95.0 percent LSD mau Count Mean Homogeneous Groups -2.5 230.719 X 293.424 X 1.5 354.027 X 392.964 X 0.5 586.238 X -Contrast Difference +/- Limits -0.5 - *193.274 5.09873 0.5 - 1.5 *232.211 5.09873 0.5 - *292.815 5.09873 0.5 - 2.5 *355.519 5.09873 - 1.5 *38.937 5.09873 - *99.5408 5.09873 - 2.5 *162.246 5.09873 1.5 - *60.6038 5.09873 1.5 - 2.5 *123.309 5.09873 - 2.5 *62.7048 5.09873 -* denotes a statistically significant difference 84 ... Fru-bi-P Fructose-1,6-bi-phosphate Fru-6-P Fructose-6-phosphate FBP Fructose-1,6-biphosephate phosphatase GK Glucokinase G6PDH Glucose-6-phosphate dehydrogenase Glc-6-P Glucose-6-phosphate Glc-1-P... enzyme cellulose UDP-Glucose Glucose Glucose-1-Phosphate Glucose -6 -Phosphate Fructose Fructose-6-Phosphate Phosphogluconic Acid TCA Cycle Fructose-1-Phosphate Fructose-1,6-Diphosphate Sơ đồ 2.2... hoạt hóa thường dẫn xuất uridin diphosphate (UDP- X) nucleotide, purin pirimidin khác Sự tổng hợp diễn theo phản ứng sau: …X-X-X-X- + UDP-X = …X-X-X-X-X + UDP n nhánh (n+1) nhánh Cơ chế sinh tổng