Khéo tay hay làm Khéo tay hay làm Khéo tay hay làmkl le uyen nhan

TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐỘNG VIỆT NAM ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN LÊN MEN THU NHẬN SINH KHỐI BACILLUS INDICUS GIÀU CAROTENOID TRÊN NỒI LÊN MEN Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM Ngành : CƠN NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : LÊ UYÊN NHÀN Niên khóa: 2006 - 2011 Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 1/2011 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực phịng thí nghiệm Vi Sinh Cơng Nghệ Dược – Khoa Dược – ĐH Y Dược TP.HCM Em xin gởi lời tri ân đến Thầy PGS.TS Trần Cát Đông truyền đạt kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi quan tâm sâu sắc giúp em hồn thành khóa luận Các Thầy Cơ Khoa Cơng Nghệ Sinh Học – ĐH Tôn Đức Thắng truyền đạt kiến thức để em có tảng vững vận dụng khóa luận Em xin chân thành cảm ơn anh chị Vũ Thanh Thảo, Trần Thị Thanh Thảo, Huỳnh Bái Nhi, Lê Minh Trí quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn, chia sẻ kinh nghiệm, động viên giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài Cảm ơn người bạn tơi chia sẻ khó khăn, giúp đỡ động viên tơi thời gian làm khóa luận Xin cám ơn Ban Giám hiệu Khoa Dược - ĐH Y Dược tạo điều kiện để em thực tập phòng thí nghiệm Vi Sinh Cơng Nghệ Dược Lê Un Nhàn Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đơng MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC ĐỒ THỊ v DANH MỤC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Khái quát Bacillus 1.1.1 Đặc điểm sơ Bacillus 1.1.2 Dinh dưỡng phát triển Bacillus [7, 8] 1.2 Tổng quan Bacillus indicus [14] .3 1.2.1 Phân loài [14] 1.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa [14] .4 1.3 Carotenoid [6, 13, 15] 1.3.1 Vài nét carotenoid 1.3.2 Ứng dụng carotenoid 1.3.3 Con đường sinh tổng hợp carotenoid vi khuẩn .8 1.3.4 Vai trò carotenoid vi khuẩn 1.4 Lên men 1.4.1 Khái niệm .9 1.4.2 Các phương pháp lên men 10 1.4.3 Nồi lên men yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 12 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2 Vật liệu 15 2.2.1 Dụng cụ, thiết bị 15 2.2.2 Hóa chất, mơi trường 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Kiểm tra hình thái, đặc tính vi khuẩn 17 2.3.2 Khảo sát nhiệt độ, pH, NaCl 18 2.3.3 Thử nghiệm xác định thời điểm kết thúc lên men 19 2.3.4 Khảo sát thông số lên men 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Đặc điểm hình thái, đặc tính vi khuẩn 27 SVTH: Lê Uyên Nhàn i Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đơng 3.1.1 Đặc điểm hình thái 27 3.1.2 Khả sinh amylase, protease 27 3.2 Điều kiện phát triển 29 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 29 3.2.2 Ảnh hưởng pH 29 3.2.3 Ảnh hưởng NaCl 30 3.3 Khảo sát thời điểm kết thúc lên men 32 3.3.1 Xác định mật độ tế bào trình lên men 32 3.3.2 Xác định lượng carotenoid trình lên men 32 3.3.3 Xác định hoạt tính amylase q trình lên men 33 3.3.4 Xác định hoạt tính protease trình lên men 35 3.3.5 Kết tổng hợp 36 3.4 Khảo sát thơng số thích hợp nồi lên men 37 3.4.1 Lượng chủng đầu vào 37 3.4.2 Tốc độ khuấy 39 3.4.3 pO2 41 3.5 Quy trình ni cấy chủng HU36 nồi lên men 43 3.6 Bàn luận 43 3.6.1 Các yếu tố sinh trưởng 43 3.6.2 Phương pháp xác định thời điểm kết thúc lên men 44 3.6.3 Thông số lên men thích hợp 44 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Đề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 SVTH: Lê Uyên Nhàn ii Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxy Ribonucleic ARN Acid Ribo Nucleic BSA Bovium Serum Albumin CFU Colony forming Unit CDSM Chemically Defined Sporulation Medium CIP Clean In Force DSM Difco Sporulation Agar DNS 3, 5-Di nitro salycylic LDL Low density lipoprotein vòng/phút Revolutions per minute TCA Trichloroacetic Acid TSA Trypton Soya Agar TSB Trypton Soya Broth VK Vi khuẩn pO2 Nồng độ oxi hòa tan SVTH: Lê Uyên Nhàn iii Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa Bacillus indicus Bảng 2.1 Thành phần khoáng 16 Bảng 2.2 Giai mẫu để xác định đường chuẩn tinh bột 20 Bảng 2.3 Bảng số liệu đường chuẩn amylase 21 Bảng 2.4 Thông số dựng đường chuẩn tyrosin 22 Bảng 2.5 Thông số đường chuẩn tyrosin 22 Bảng 3.1 Kết khảo sát hàm lượng carotenoid 32 Bảng 3.2 Kết khảo sát hoạt tính amylase 34 Bảng 3.3 Kết khảo sát hoạt tính protease 35 Bảng 3.4 Bảng tổng hợp kết khảo sát thời điểm kết thúc lên men 36 Bảng 3.5 Lượng chủng đầu vào % 38 Bảng 3.6 Lượng chủng đầu vào % 38 Bảng 3.7 Lượng chủng đầu vào 10 % 38 Bảng 3.8 Tốc độ khuấy 150 vòng/phút 39 Bảng 3.9 Tốc độ khuấy 250 vòng/phút 40 Bảng 3.10 Tốc độ khuấy 500 vòng/phút 40 Bảng 3.11 pO2 25% 41 Bảng 3.12 pO2 50% 41 Bảng 3.13 pO2 75% 42 SVTH: Lê Uyên Nhàn iv Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 2.1 Đường chuẩn amylase 21 Đồ thị 2.2 Đường chuẩn protease 22 Đồ thị 3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng HU36 29 Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng pH lên sinh trưởng HU36 30 Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng % NaCl lên sinh trưởng HU36 31 Đồ thị 3.4 Mật độ tế bào trình lên men 32 Đồ thị 3.5 Hàm lượng carotenoid theo thời gian 33 Đồ thị 3.6 Hoạt tính amylase theo thời gian 34 Đồ thị 3.7 Hoạt tính protease theo thời gian 35 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây phân lồi dựa việc giải trình tự 16S rRNA Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp carotenoid Hình 1.3 Vị trí carotenoid màng tế bào Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo bồn lên men 12 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 16 Hình 2.2 Sơ đồ khảo sát phương pháp xác định thời điểm kết thúc lên men 19 Hình 2.3 Quy trình chiết carotenoid 24 Hình 3.1 Khuẩn lạc hình ảnh nhuộm Gram chủng HU36 27 Hình 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên HU36 29 Hình 3.3 Ảnh hưởng pH lên HU36 30 Hình 3.4 Sự phát triển HU36 nồng độ muối khảo sát 31 Hình 3.5 Bảng điều khiển hệ thống lên men 37 SVTH: Lê Uyên Nhàn v Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông ĐẶT VẤN ĐỀ Bacillus đối tượng hàng đầu nhà khoa học quan tâm nghiên cứu để sản xuất probiotic đặc điểm như: khả sinh sản nhanh, quy trình sản xuất đơn giản, có khả tạo bào tử Bên cạnh đó, số chủng Bacillus có khả sinh carotenoid, sử dụng chủng làm probiotic cung cấp carotenoid tự nhiên mang lại lợi ích cho sức khỏe người Hiện nay, Phịng thí nghiệm Vi sinh Cơng nghệ Dược sàng lọc 40 chủng có khả sinh carotenoid từ vùng biển hồ tôm Việt Nam bao gồm chủng: Bacillus firmus, Bacillus indicus, Bacillus catenulatus, Bacillus aquimaris, Bacillus marisflavi Trong số chủng này, HU36 - Bacillus indicus chủng có tiềm sinh carotenoid cao tạo nhiều enzym ngoại bào Bên cạnh đó, mơi trường lên men chủng HU36 từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền nghiên cứu Tuy nhiên, hướng đến việc khai thác sử dụng chủng làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức giàu carotenoid, cần nghiên cứu điều kiện lên men để thu nhận sinh khối quy mô lớn với hiệu suất cao Nhằm thu nhận lượng sinh khối lớn, ni cấy chìm nồi lên men phương pháp ứng dụng rộng rãi dễ dàng cho việc tự động hóa Do đó, tiến hành nghiên cứu đề tài: “KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN LÊN MEN THU NHẬN SINH KHỐI BACILLUS INDICUS GIÀU CAROTENOID TRÊN NỒI LÊN MEN Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM” Với mục tiêu sau: • Khảo sát số đặc điểm sinh trưởng chủng HU36- B indicus mơi trường thay • Khảo sát dấu hiệu trình lên men để xác định sơ thời điểm kết thúc lên men làm sở cho việc khảo sát thông số lên men • Xác định thơng số lên men thích hợp chủng B indicus để thu lượng lớn sinh khối giàu caroitenoid SVTH: Lê Uyên Nhàn Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Khái quát Bacillus 1.1.1 Đặc điểm sơ Bacillus Theo khóa phân loại Bergey, Bacillus phân loại sau: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Chi Bacillus phân bố rộng tự nhiên đất, nước, khơng khí, thể thực vật, động vật, vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí, tế bào vi khuẩn tồn riêng lẻ hay dính với thành chuỗi ngắn bao gồm nhiều tế bào, đa số có khả tạo nội bào tử Sự tạo thành nội bào tử coi tính chất để phân biệt thành viên chi Đối với Bacillus có nội bào tử bào tử hình trụ, oval, trịn, có hình bầu dục Tùy theo lồi, bào tử nằm giữa, gần cuối cuối túi bào tử phồng không phồng Tế bào sinh dưỡng Bacillus thẳng, có đầu trịn vng, kích thước từ 0,5-1,2 x 2,5-10 µm, dạng đơn lẻ hay chuỗi ngắn dài [7, 8] 1.1.2 Dinh dưỡng phát triển Bacillus [7, 8] Môi trường nuôi cấy Bacillus phát triển tốt môi trường dinh dưỡng thương mại gồm thành phần như: pepton, cao thịt, glucose, lactose, chất khống… Trong phịng thí nghiệm, điều kiện phát triển tối ưu, thời gian hệ Bacillus khoảng 25 phút Hầu hết loài Bacillus cần môi trường đặc biệt để tạo bào tử Sự tạo bào tử cảm ứng sau pha tăng trưởng hàm mũ nồng độ dinh dưỡng, đặc biệt nguồn carbon, nitrogen, phospho bị cạn kiệt SVTH: Lê Uyên Nhàn Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông Nhiệt độ phát triển Phần lớn Bacillus ưa nhiệt trung tính, tạo khuẩn lạc đặc trưng sau 24 ni cấy 37oC Các lồi ưa nhiệt phát triển từ 55 đến 70oC, thường khoảng 60oC Loài ưa nhiệt trung bình phát triển tốt 45 - 50oC Lồi gây bệnh cho trùng phát triển nhiệt độ từ 25 - 30oC 1.2 Tổng quan Bacillus indicus [14] Hiện nay, chưa có nhiều tài liệu nghiên cứu Bacillus indicus, đặc điểm loài mô tả dựa nghiên cứu Bacillus indicus Sd/3T phân lập từ mẫu đất vùng Tây Bengal, Ấn độ Suresh cộng năm 2004 Theo nghiên cứu này, đặc điểm hình thái, phát triển, sinh hóa phân lồi dựa giải trình tự 16S rRNA mơ tả chi tiết Phổ UV-Vis sắc tố từ dịch chiết sinh khối Bacillus indicus acetone có ba đỉnh hấp thu đặc trưng carotenoid 404, 428 451 nm 1.2.1 Phân loài [14] Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài: Bacillus indicus Dựa việc giải trình tự 16S rRNA, mối liên hệ loài Bacillus indicus số Bacillus khác trình bày hình 1.2 Trong đó, Bacillus indicus có liên hệ gần (94%) với B megaterium MTCC 1684, B flexus 95% với B cohnii DSM 6307T, Bacillus pumilus IFO 15566T Bacillus bataviensis LMG 21833T SVTH: Lê Uyên Nhàn Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông Thời gian (h) Log10 tế bào (CFU/ml) Carotenoid (µg/ml) Thời gian (h) 7,8 0,000 11 Log10 tế bào (CFU/ml) 9,33 8,5 0,024 12 9,3 0,831 8,6 0,117 13 9,27 0,820 8,7 0,263 14 9,24 0,788 8,7 0,318 Carotenoid 0,753 Tế bào 10 0.8 0.6 0.4 0.2 Log10 (CFU/ml) Carotenoid (mg/ml) Carotenoid (µg/ml) 4 10 12 14 Thời gian (giờ) Đồ thị 3.5 Hàm lượng carotenoid theo thời gian Nhận xét: Trong khoảng thời gian từ đến giờ, hàm lượng carotenoid không tăng Từ đến 12 giờ, hàm lượng carotenoid tăng nhanh đạt cực đại 12 với hàm lượng carotenoid 117 µg giữ ổn định sau 12 Khi so sánh với đường cong tăng trưởng, nhận thấy hàm lượng carotenoid đạt cực đại vào pha ổn định tế bào Do đó, ta thu nhận carotenoid cực đại với sinh khối chủng HU36 3.3.3 Xác định hoạt tính amylase trình lên men Xác định thời điểm kết thúc lên men thơng qua hoạt tính amylase từ đến 14 Kết trình bày Bảng 3.2 SVTH: Lê Uyên Nhàn 33 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông Bảng 3.2 Kết khảo sát hoạt tính amylase Thời gian (h) Amylase (U/ml) Carotenoid (µg/ml) Thời gian (h) Amylase (U/ml) Carotenoid (µg/ml) 0 0,20 0,413 0 0,20 0,477 0 10 0,17 0,563 0 11 0,17 0,753 0,06 0,024 12 0,26 0,831 0,08 0,117 13 0,25 0,820 0,17 0,263 14 0,24 0,788 0,17 0,318 Amylase Carotenoid Amylase (U/ml) 0.25 0.8 0.2 0.6 0.15 0.4 0.1 0.2 0.05 Carotenoid ( µg/ml) 0.3 10 12 14 Thời gian (giờ) Đồ thị 3.6 Hoạt tính amylase theo thời gian Nhận xét: Trong đầu, chúng tơi nhận thấy khơng có enzym amylase sinh dịch nuôi cấy vi khuẩn Sau hoạt tính amylase tăng dần đạt cực đại 12 (0,26 U/ml) Nếu so sánh với hàm lượng carotenoid mục 3.3.2, hoạt tính amylase có tương quan với thời điểm hàm lượng carotenoid đạt cực đại, nhiên khả sinh hoạt tính amylase chủng HU36 thấp không ổn định qua thời gian khảo sát SVTH: Lê Uyên Nhàn 34 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đơng 3.3.4 Xác định hoạt tính protease trình lên men Xác định thời điểm kết thúc lên men thơng qua hoạt tính amylase từ đến 14 Kết trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết khảo sát hoạt tính protease Thời gian (h) Protease (U/ml) Carotenoid (µg/ml) 0,040 5,034 0,413 0,041 6,438 0,477 0,041 10 7,326 0,563 0,850 11 7,356 0,753 1,020 0,024 12 8,574 0,831 1,344 0,117 13 8,100 0,820 1,614 0,263 14 8,496 0,788 4,884 0,318 Thời gian Protease (h) (U/ml) Protease Carotenoid 0.8 0.6 0.4 0.2 Carotenoid (µg/ml) Protease (U/ml) Carotenoid (µg/ml) 0 10 12 14 Thời gian (giờ) Đồ thị 3.7 Hoạt tính protease theo thời gian Nhận xét Từ đến giờ, hoạt tính protease chủng vi khuẩn tăng chậm, tăng mạnh sau (6,62 U/ml), đạt cực đại 12 (11,97 U/ml) Từ thời điểm 12 trở hoạt tính protease ổn định Dựa vào đồ thị hàm lượng carotenoid, nhận thấy hoạt tính protease có tương quan với hàm lượng carotenoid tạo SVTH: Lê Uyên Nhàn 35 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông 3.3.5 Kết tổng hợp Kết tổng hợp việc khảo sát mật độ tế bào, hàm lượng carotenoid, hoạt tính protease, hoạt tính amylase để xác định thời điểm kết thúc lên men trình bày Bảng 3.4 Bảng 3.4 Bảng tổng hợp kết khảo sát thời điểm kết thúc lên men Thời gian (h) Amylase (U/ml) Protease (U/ml) Log10 tế bào (CFU/ml) Carotenoid (µg/ml) 0 0,040 5.1 0,041 5,7 0,041 7,0 0,850 7,8 0,06 1,020 8,5 0,024 0,08 1,344 8,6 0,117 0,17 1,614 8,7 0,263 0,17 4,884 8,7 0,318 0,20 5,034 9,0 0,413 0,20 6,438 9,2 0,477 10 0,17 7,326 9,3 0,563 11 0,17 7,356 9,33 0,753 12 0,26 8,574 9,3 0,831 13 0,25 8,100 9,27 0,820 14 0,24 8,496 9,24 0,788 Nhận xét: Qua kết khảo sát, nhận thấy hoạt tính amylase cịn thấp khơng ổn định qua thời gian nên sử dụng phương pháp để xác định thời điểm kết thúc lên men Kết khảo sát hoạt tính protease có tương quan với mật độ tế bào vi khuẩn hàm lượng carotenoid sinh Các kết cho thấy thời điểm 12 kể từ bắt đầu nuôi cấy thời điểm tốt để dừng mẻ lên men thu hoạch sinh khối với lượng carotenoid tạo cao Như vậy, việc sử dụng SVTH: Lê Uyên Nhàn 36 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông phương pháp xác định hoạt tính protease khoảng 45 phút nhanh so với phương pháp đếm tổng số tế bào xác định hàm lượng carotenoid (24 giờ) Từ cho thấy phương pháp xác định hoạt tính protease phương pháp thích hợp để xác định sơ thời đểm kết thúc trình lên men kết đối chiếu kiểm tra lại qua phương pháp đếm tổng số tế bào phương pháp UV-VIS Do vậy, chọn thời điểm kết thúc lên men thời điểm hoạt tính protease đạt cực đại 3.4 Khảo sát thơng số thích hợp nồi lên men Thử nghiệm khảo sát thơng số thích hợp nồi lên men gồm có: lượng chủng đầu vào, pO2, tốc độ khuấy Thời điểm kết thúc lên men xác định hoạt tính protease đạt cực đại, song song tiến hành kiểm tra hàm lượng carotenoid mật độ tế bào để so sánh Thời gian bắt đầu khảo sát thời điểm kết thúc lên men trước hoạt tính protease đạt cực đại, nghĩa khảo sát thời điểm 10 trở Hình 3.5 Bảng điều khiển hệ thống lên men 3.4.1 Lượng chủng đầu vào Khảo sát lượng chủng đầu vào 1%, 5%, 10% với tốc độ khuấy 250 vịng/phút, pO2 50% Kết trình bày Bảng 3.5, Bảng 3.6, Bảng 3.7 SVTH: Lê Uyên Nhàn 37 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông Bảng 3.5 Lượng chủng đầu vào % Thời gian (h) Carotenoid (µg/ml) Protease (U/ml) Log10 tế bào (CFU/ml) 10 0,197 0,753 8,49 11 0,327 0,859 8,92 12 0,406 1,357 8,87 13 0,632 1,846 9,26 14 0,670 2,832 9,48 15 0,711 4,023 9,47 16 0,804 4,569 9,36 17 0,878 4,969 9,35 18 0,868 4,880 8,76 19 0,857 4,382 8,74 Bảng 3.6 Lượng chủng đầu vào % Thời gian (h) Carotenoid (µg/ml) Protease (U/ml) Log10 tế bào (CFU/ml) 10 0,454 2,083 9,06 11 0,551 2,352 9,14 12 0,652 3,094 9,34 13 0,820 3,379 9,40 14 0,817 3,159 9,47 15 0,809 3,355 9,35 Bảng 3.7 Lượng chủng đầu vào 10 % Thời gian (h) 10 11 12 13 14 SVTH: Lê Uyên Nhàn Carotenoid (µg/ml) 0,563 0,753 0,831 0,820 0.788 Protease (U/ml) 7,326 7,356 8,574 8,101 7,836 Log10 tế bào (CFU/ml) 9,33 9,33 9,30 9,27 9,24 38 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông Nhận xét: Từ kết khảo sát nhận thấy, thông số lượng chủng đầu vào 1% cho hàm lượng carotenoid đạt cực đại vào thời điểm 17 (0,878 µg/ml) Lượng chủng đầu vào 5% 10% cho hàm lượng carotenoid cực đại gần thời gian lên men 13 12 Nếu so sánh tính kinh tế hiệu đạt hai lượng chủng đầu vào 5% 10% thơng số lượng chủng % thích hợp thời gian ni cấy ngắn, tiết kiệm chi phí mơi trường dễ kiểm soát lượng chủng vào so với bổ sung chủng 10 % 3.4.2 Tốc độ khuấy Khảo sát lượng tốc độ khuấy 150 vòng/phút, 250 vòng/phút, 500 vòng/phút với lượng chủng đầu vào %, pO2 50 % Kết trình bày Bảng 3.8, Bảng 3.9, Bảng 3.10 Bảng 3.8 Tốc độ khuấy 150 vòng/phút Thời gian Carotenoid Protease Log10 tế bào (h) (µg/ml) (U/ml) (CFU/ml) 10 0,308 1,088 8,45 11 0,438 2,197 8,49 12 0,544 2,849 8,65 13 0,600 3,037 8,85 14 0,692 3,648 9,05 15 0,736 4,032 9,16 16 0,764 4,513 9,26 17 0,816 4,627 9,20 18 0,759 3,999 9,14 19 0,764 4,105 9,12 SVTH: Lê Uyên Nhàn 39 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông Bảng 3.9 Tốc độ khuấy 250 vòng/phút Thời gian Carotenoid Protease Log10 tế bào (h) (µg/ml) (U/ml) (CFU/ml) 10 0,454 2,083 9,06 11 0,551 2,352 9,14 12 0,652 3,094 9,34 13 0,820 3,379 9,4 14 0,817 3,159 9,47 15 0,809 3,355 9,35 Bảng 3.10 Tốc độ khuấy 500 vòng/phút Thời gian (h) Carotenoid (µg/ml) Protease (U/ml) Log10 tế bào (CFU/ml) 10 0,189 0,900 8,77 11 0,255 1,805 8,89 12 0,307 2,238 9,10 13 0,345 2,441 9,18 14 0,357 2,767 9,16 15 0,367 4,105 9,19 16 0,464 4,389 9,33 17 0,496 6,861 9,45 18 0,567 6,950 9,47 19 0,642 7,170 9,46 20 0,735 7,130 9,45 21 0,767 7,848 9,44 22 7,600 7,660 9,44 Nhận xét: Tốc độ khuấy ảnh hưởng đến trình sinh sản tích lũy carotenoid tế bào chủng HU36 Khi tăng tốc độ khuấy giúp gia tăng thơng khí, tăng lượng oxi hịa tan giúp tế bào phân chia nhanh Ở tốc độ khuấy 150 vòng/phút cho thời gian tế bào đạt cực đại 14 250 vòng/phút 10 Tuy nhiên, tốc độ khuấy 500 vòng/phút thời gian tế bào đạt cực đại 12 SVTH: Lê Uyên Nhàn 40 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông tăng tốc độ khuấy cao tạo lực học lớn làm ảnh hưởng đến việc phát triển tế bào Bên cạnh đó, chúng tơi nhận thấy tốc độ khuấy có ảnh hưởng lớn đến tích lũy carotenoid tế bào Thời gian hàm lượng carotenoid đạt cực đại tốc độ khuấy 150 vòng/phút 17 (0,816 µg), 250 vịng/phút 13 (0,82 µg) 500 vịng/phút 21 (0,767 µg) Như vậy, tốc độ khuấy 250 vịng/phút thích hợp để thu sinh khối giàu carotenoid thời gian ngắn 3.4.3 pO2 Khảo sát pO2 25 %, 50 %, 75% với lượng chủng đầu vào khảo sát 5% tốc độ khuấy 250 vịng/phút Kết trình bày Bảng 3.11, Bảng 3.12, Bảng 3.13 Bảng 3.11 pO2 25% Thời gian Carotenoid Protease Log10 tế bào (h) (µg/ml) (U/ml) (CFU/ml) 10 0,1381 1,023 8,78 11 0,168 1,430 9,10 12 0,251 1,536 9,25 13 0,353 1,626 9,30 14 0,427 2,376 9,47 15 0,457 3,510 9,43 16 0,670 4,227 9,34 17 0,767 5,353 9,37 18 0,750 5,312 9,05 19 0,755 5,310 8,99 Bảng 3.12 pO2 50% Thời gian (h) 10 11 12 13 14 15 SVTH: Lê Uyên Nhàn Carotenoid (µg/ml) 0,454 0,551 0,652 0,820 0,817 0,809 Protease (U/ml) 2,083 2,352 3,094 3,379 3,159 3,355 Log10 tế bào (CFU/ml) 9,06 9,144 9,343 9,4 9,47 9,352 41 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông Bảng 3.13 pO2 75% Thời gian Carotenoid Protease Log10 tế bào (h) (µg/ml) (U/ml) (CFU/ml) 10 0,395 3,983 8,74 11 0,541 7,089 9,02 12 0,590 8,924 9,13 13 0,619 9,324 9,10 14 0,690 9,772 9,12 15 0,793 10,139 9,09 16 0,787 9,161 9,08 Nhận xét: Dựa vào bảng số liệu, thông số pO2 = 50 % cho thời gian nuôi cấy nhanh (10 giờ) so với pO2 = 25 % (17 giờ) Điều giải thích thiếu oxi phá vỡ trao đổi chất tế bào, làm ảnh hưởng tới việc tích lũy carotenoid tế bào Tuy nhiên, tăng lượng oxi lên cao (75%) lại làm chậm trình lên men Vì chủng HU36 chủng phân lập từ phân người (theo Le , nên nhu cầu lượng oxi cần thiết cho phát triển việc tích lũy carotenoid tế bào thấp so với chủng vi khuẩn phân lập từ đất từ biển Bên cạnh đó, hàm lượng carotenoid đạt pO2 = 50 % cao (0,82 µg/ml) Vì vậy, thơng số pO2 = 50 % thích hợp thời gian ni cấy ngắn, tiết kiệm chi phí SVTH: Lê Un Nhàn 42 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông 3.5 Quy trình ni cấy chủng HU36 nồi lên men Chủng HU36 Phân lập DSM 30oC, 24 Môi trường lên men; lít Tăng sinh cấp 30 C, 200 vòng/phút, 12 o Tiệt trùng 121oC, 50 phút Tăng sinh cấp 30 C, 200 vòng/phút, 12 o Lên men 30oC, pO2 50%, pH 7, 250 vòng/phút Thu sinh khối protease đạt cực đại 3.6 Bàn luận 3.6.1 Các yếu tố sinh trưởng HU36 phát triển tối ưu điều kiện nhiệt độ 30 oC pH môi trường TSM Kết tương tự với kết Suresh cộng (2004) với nhiệt độ phát triển tối ưu từ 15oC đến 37oC pH từ đến Nhưng HU36 phát triển nồng độ muối thấp so với chủng Sd/3T Chủng Sd/3T phát triển tối ưu nồng độ muối 2,0 % Điều giải thích nguồn phân lập HU36 Sd/3T khác nên khả thích nghi với nồng độ muối hai chủng khác Dựa vào kết khảo sát ứng dụng để khảo sát thông số lên men tối ưu chủng vi khuẩn HU36 để nhân sinh khối với số lượng lớn hướng đến việc sản xuất probiotic đề tài nghiên cứu SVTH: Lê Uyên Nhàn 43 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông 3.6.2 Phương pháp xác định thời điểm kết thúc lên men Trong phương pháp sử dụng để khảo sát, phương pháp xác định hoạt tính protease cho kết ổn định xác Chúng ta nhận thấy thay đổi hoạt tính theo xu hướng cụ thể ổn định qua mốc thời gian khảo sát Qua kết cho thấy hoạt tính protease bắt đầu tăng từ thời điểm t10 sau nhân giống vào nồi lên men đến thời điểm cụ thể vào khoảng t11-t12 có xu hướng ổn định Bên cạnh đó, phương pháp quét phổ UV-VIS phương pháp đếm trải sử dụng kiểm định qua mốc thời gian để thấy tương quan hoạt tính protease hàm lượng carotenoid tổng số tế bào trình lên men Từ đó, chúng tơi nhận thấy ba phương pháp cho kết tương tự thời điểm số lượng tế bào, hàm lượng carotenoid với hoạt tính protease đạt cao ổn định trình lên men Đối với phương pháp khảo sát hoạt tính amylase chúng tơi nhận thấy chủng B.indicus có khả sinh amylase thấp không ổn định qua thời gian Do đó, phương pháp khơng sử dụng việc khảo sát thời điểm kết thúc trình lên men 3.6.3 Thơng số lên men thích hợp Để đạt hiệu lên men cao chủng B.indicus, thông số lượng chủng đầu vào, nồng độ oxi, tốc độ khuấy cần khảo sát để tiến hành lên men đạt hiệu tối ưu Đây yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến phát triển vi khuẩn trình sinh trưởng Dựa vào ba phương pháp chọn lọc khảo sát thông số lên men tối ưu chủng HU36 chủng đầu vào %, tốc độ khuấy 250 vòng/phút pO2 50 % SVTH: Lê Uyên Nhàn 44 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình làm thực nghiệm, rút số kết luận sau: - Chủng HU36 - Bacillus indicus cung cấp từ phịng thí nghiệm Vi Sinh Cơng Nghệ Dược có đặc điểm hình thái hình dạng theo mô tả từ báo khoa học cơng bố - Chủng vi khuẩn sinh trưởng tốt nhiệt độ 30oC, pH mơi trường lên men thích hợp thử nghiệm phịng thí nghiệm Vi Sinh Cơng Nghệ Dược Xác định điều kiện lên men tốt kinh tế cho chủng vi khuẩn ứng với thông số lên men sau: Lượng chủng đầu vào 5% (OD600 = 2), tốc độ khuấy 250 vòng/phút, pO2 50% - Tổng số tế bào thu sau lên men vào khoảng x 109 đến x 109 CFU/ml - Hàm lượng carotenoid tế bào vi khuẩn sau mẻ lên men thu khoảng 0,82 µg/ml 4.2 Đề nghị Trong thời gian chúng tơi có số đề nghị sau: - Ứng dụng quy trình lên men khảo sát để sản xuất sinh khối HU36 giàu carotenoid làm probiotic - Nghiên cứu thu bào tử chủng HU36 với qui mô lớn dùng làm nguyên liệu cho thử nghiệm invivo với mục tiêu sản xuất thực phẩm chức SVTH: Lê Uyên Nhàn 45 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Lương Đức Phẩm Vi sinh công nghiệp 2000 [2] Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông Công nghệ sinh học Dược 2009: NXB [3] Y học Phạm Thành Hổ Nhập môn Công nghệ sinh học 2005: Nhà xuất Giáo [4] dục Phạm Thị Ánh Hồng Kỹ thuật sinh hóa 2003: Nhà xuất ĐH Quốc Gia TP.HCM Tài liệu tiếng Anh [5] Armstrong, G.A, J.E Hearst Carotenoids 2: Genetics andmolecular biology of carotenoid pigment biosynthesis Faseb J, 1996 10(2): p 228-237 [6] Duc Le, H, P D Fraser, N K Tam Carotenoids present in halotolerant Bacillus spore formers FEMS Microbiol Lett, 2006 255(2): p 215-24 [7] Gibson, T., Ruth E Gordon Bacillus, in Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, R E Buchanan, N E Gibbons, Editors 1975, Williams & Wilkins p 576-583 [8] Harwood, C., A Archibald Growth, maintenance and general techniques, in Molecular Biological Methods for Bacillus, C R Harwood, S M Cutting, Editors 1990, A Wily-Interscience p 1-26 [9] Martin, H D., C Ruck, M Schmidt, et al Chemistry of carotenoid oxidation and free radical reactions Pure Appl Chem., 1999 71(12): p 2253-2262 [10] McNulty, H., R F Jacob, R P Mason Biologic activity of carotenoids related to distinct membrane physicochemical interactions Am J Cardiol, 2008 101(10A): p 20D-29D [11] Rao, C S., T Sathish, P Brahamaiah Development of a mathematical model for Bacillus circulans growth and alkaline protease production kinetics Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2008 85(2): p 302 307 [12] Schmidt-Dannert, C Engineering novel carotenoids in microorganisms Current Opinion in Biotechnology, 2000 11: p 255-261 SVTH: Lê Uyên Nhàn 46 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông [13] Armstrong GA, JE Hearst Carotenoids 2: Genetics andmolecular biology of carotenoid pigment biosynthesis Faseb J, 1996 10(2): p 228-237 [14] K Suresh S, S R Prabagaran, Sengupta2, et al Bacillus indicus sp nov., an arsenic-resistantbacterium isolated from an aquifer in West Bengal,India International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2004 54: p 1369-1375 [15] Khaneja, R., L Perez-Fons, S Fakhry Carotenoids found in Bacillus Journal of Applied Microbiology, 2009 SVTH: Lê Uyên Nhàn 47 ... định hoạt tính enzym có thời gian thực tương đối nhanh) với mật độ tế bào hàm lượng carotenoid tạo nhằm tìm phương pháp thích hợp để xác định nhanh xác thời điểm kết thúc trình lên men SVTH:... hóa làm thương tổn cho thành động mạch, làm hư hao cơ, tiến sâu vào thành động mạch với tốc độ nhanh 20 – 30 lần tác động LDL Do vậy, bước quan trọng việc ngăn ngừa bệnh lý tim mạch phòng chống... định sau 24 giờ, phương pháp quang phổ hấp thụ cho kết sau 24 Vì sử dụng phương pháp để xác định nhanh thời điểm kết thúc lên men để dừng mẻ lên men hợp lý nhằm tiết kiệm chi phí Do thử nghiệm