KHẢO sát các điều KIỆN SINH TỔNG hợp CELLULASE từbacillus amyloliquefaciens d19

Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số 49,2021 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ Bacillus amyloliquefaciens D19 NGUYỄN NGỌC ẨN1, NGUYỄN LÊ HIỀN HÒA1, TRẦN NGUYỄN DIỄM LINH1, BÙI THỊ LUYẾN2, NGUYỄN THANH HẢI2, NGUYỄN THỊ DIỆU HẠNH1, PHẠM TẤN VIỆT1 Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, phamtanviet@iuh.edu.vn Tóm tắt Cellulase enzyme thu nhận chủ yếu từ vi sinh vật, có tác dụng thủy phân cellulose thành phân tử đường có cấu trúc đơn giản ứng dụng nhiều xử lý môi trường nhiều lĩnh vực công nghiệp khác công nghiệp giấy, may mặc, thực phẩm,… Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase chủng Bacillus amyloliquefaciens D19 Kết cho thấy sau nuôi cấy chủng vi khuẩn môi trường có pH ban đầu 5,0 bao gồm thành phần 0,5% rơm, 1% bột đậu nành (w/v), 1% NaCl (w/v), 0,5% cao nấm men (w/v) sau 48 điều kiện lắc 150 vòng/phút nhiệt độ 37°C, hoạt tính enzyme đạt cao 879,47 UI/ml Kết làm tiền đề cho nghiên cứu khảo sát điều kiện bảo quản chế phẩm cellulase thô thu nhận từ chủng vi khuẩn này, nghiên cứu lên men qui mô pilot, qui mô công nghiệp để thu cellulase với số lượng lớn, nghiên cứu sâu nhằm sản xuất chế phẩm enzyme thương mại ứng dụng cellulase cho nhiều mục đích khác thực tiễn Từ khóa Bacillus amyloliquefaciens, cellulase, enzyme ngoại bào, phân hủy cellulose ENHANCED PRODUCTION OF CELLULASE FROM Bacillus amyloliquefaciens D19 Abstract Cellulase is an enzyme mainly produced by microorganisms, which hydrolyzes cellulose into monosaccharide and is widely used in environmental treatment and many different industrial sectors such as industrial paper, garment, food, In this study, we have found suitable culture conditions including substrate source, nitrogen source, carbon source, initial pH, and culture temperature for Bacillus amyloliquefaciens D19 cellulase biosynthesis cellulase biosynthesis The results showed that after culturing this strain in medium supplemented with 0,5% straw, 1% soy flour (w/v), 1% NaCl (w/v), 0,5% yeast extract (w/v) in 48 hours at shaking conditions 150 rpm, 37°C, initial pH 5,0, the highest enzyme activity obtained was 879,47 UI/ml This result will pave the way for further studies such as investigating the storage conditions of raw cellulase products obtained from this strain of bacteria, conducting fermentation studies on pilot and industrial scale to obtain cellulase in large quantities and quality, production of commercial enzyme products or applications of cellulase for a variety of practical purposes Key words Bacillus amyloliquefaciens, cellulase, exoenzyme, cellulose degradation GIỚI THIỆU Cellulose tổng hợp chủ yếu thực vật, thành phần tạo nên độ cứng cho vách tế bào Bên cạnh đó, cellulose cịn tạo vi khuẩn, hay cịn gọi Bacterial Cellulose (BC) thơng qua q trình polymer hóa phân tử glucose thành chuỗi β-1,4-glucan Một lượng lớn cellulose tích lũy ngày đất sản phẩm từ thực vật, cành hoa rụng xuống, cối chết đi, phần người thải dạng rác thải nông nghiệp rơm rạ, rác thải thực phẩm, rác thải công nghiệp sinh hoạt giấy vụn, mùn cưa,… Các chất thải không sử dụng không tái chế gây ô nhiễm môi trường [1] Bên cạnh đó, việc phân hủy cellulose tác nhân lý hóa cần phải có tác động nhiều loại hóa chất khơng thơng dụng điều kiện nhiệt độ áp suất cao, nhiều thời gian [2, 3] Cellulase enzyme sản xuất chủ yếu vi sinh vật, có khả xúc tác cách hiệu trình phân giải cellulose thành monosaccharide "đường đơn" β-glucose thành oligosaccharide polysaccharide ngắn không tạo phụ phẩm độc hại [4] Sự phân hủy cellulose có tầm quan trọng đáng kể kinh tế, giúp chuyển hóa thành phần cellulose thực vật thành sản phẩm dễ tiêu thụ sử dụng [5] Do đó, cellulase xem loại enyzme sử dụng © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 68 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ Bacillus amyloliquefaciens D19 phổ biến ứng dụng rộng rãi thực tế xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp, xử lý môi trường, sản xuất nhiên liệu sinh học, ứng dụng ngành công nghiệp công nghiệp thực phẩm, làm giấy, may mặc… nhằm gia tăng hiệu suất xử lý chất lượng sản phẩm Việt Nam nước có nơng nghiệp truyền thống q trình cơng nghiệp hóa, đại hóa, vậy, để có kinh tế phát triển bền vững, vừa gia tăng số lượng chất lượng sản phẩm số ngành công nghiệp sản xuất, vừa giải vấn đề ô nhiễm môi trường gây lượng rác thải hữu (đa số có thành phần cellulose) việc nghiên cứu sản xuất lượng lớn cellulase điều tất yếu Trong đó, vi sinh vật nguồn sản xuất cellulase tiềm khả sinh sản, phát triển với tốc độ nhanh sinh tổng hợp lượng lớn enzyme ngoại bào có hoạt tính cao Thêm vào đó, nghiên cứu sản xuất cellulase từ Bacillus amyloliquefaciens mối quan tâm nhiều nhà khoa học giới [6-8] Chính vậy, tiến hành khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase từ chủng B amyloliquefaciens D19 nhằm đáp ứng nhu cầu ứng dụng thực tiễn enzyme VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens D19 phân lập từ đất Thành phố Hồ Chí Minh, định danh mức phân tử phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA phịng thí nghiệm Cơng nghệ động vật (Trường Đại học Konkuk, Seoul, Hàn quốc) với cặp mồi sử dụng 27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' [9] Kết định danh công bố nghiên cứu trước [10] Kết giải trình tự so sánh với sở liệu 16S-rRNA vi khuẩn có sẵn National Center for Biotechnology Information (NCBI) để xác định đến mức độ loài Chủng vi khuẩn lưu lưu giữ Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Tp HCM điều kiện -20C hoạt hoá 12 môi trường Luria-Bertani broth (LB broth) 37C trước thực nghiên cứu 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phương pháp xây dựng đường cong tăng trưởng vi khuẩn Chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens D19 từ sưu tập giống hoạt hố 12 mơi trường LB broth 37C, lắc 150 vòng/phút 16 điều kiện 37ºC Giống hoạt hóa ml mơi trường LB, sau tiếp tục cấy vào 50 ml môi trường LB lỏng có bổ sung 1% CMC, lắc 150 vịng/phút 16 37ºC Sau đó, 10 ml giống tăng sinh cấy vào 100 ml mơi trường LB lỏng có bổ sung 1% CMC, lắc 150 vòng/phút giá trị OD600nm dịch huyền phù xác định sau giờ, liên tục 24 để khảo sát đường cong tăng trưởng Đường cong tăng trưởng phân tích vẽ phần mềm GraphPad Prism [11] 2.2.2 Phương pháp xác định khả sinh tổng hợp cellulase vi khuẩn B amyloliquefaciens D19 cấy theo phương pháp cấy điểm đĩa thạch LB có bổ sung 0,5% CMC Chủng nuôi ủ 37ºC 72 Sau 72 giờ, lugol trải bề mặt đĩa thạch quan sát vòng phân giải Khả sinh tổng hợp cellulase đánh giá độ lớn vòng phân giải A = D-d với D đường kính vịng phân giải (mm) d đường kính khuẩn lạc (mm) Độ lớn vịng phân giải lớn phản ánh hoạt tính enzyme mạnh ngược lại [12] 2.2.3 Phương pháp khảo sát điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ B amyloliquefaciens D19 Ảnh hưởng loại chất cảm ứng lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens D19 khảo sát loại ngun liệu có thành phần cellulose rơm, trấu, bã mía, mùn cưa, xơ dừa, CMC Mơi trường nuôi cấy sử dụng LB lỏng (10 g/L tryptone, g/L yeast extract, 10 g/L NaCl, 20 g/L agar, pH 7,0) có bổ sung 1% CMC (w/v) Rơm, trấu, bã mía, xơ dừa, mùn cưa sử dụng để thay CMC nghiệm thức khác Mỗi chất cảm ứng xay nhuyễn bổ sung vào môi trường LB lỏng với tỉ lệ 1% (w/v) Khuẩn lạc chủng D19 hoạt hóa, sau tăng sinh 37℃ điều kiện ni cấy lắc (150 vòng/phút) Mật độ tế bào xác định phương pháp đo OD bước sóng 600 nm đạt giá trị khoảng 0,8 cấy vào mơi trường ni cấy với tỉ lệ 1% Q trình lên men thu nhận enzyme thực điều kiện nhiệt độ 37℃, 150 vòng/phút Sau 12 nuôi cấy, dịch enzyme thô thu nhận cách ly tâm tách tế bào khỏi dịch ni cấy © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ Bacillus amyloliquefaciens D19 69 với vận tốc 13000 rpm 10 phút 4℃ xác định hoạt tính Loại chất cảm ứng cho hoạt tính cellulase dịch enzyme thô cao chọn để để tiến hành thử nghiệm Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng D19 khảo sát chất cảm ứng thích hợp chọn từ thí nghiệm trước với giá trị nồng độ khác 0% 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4% (w/v) Q trình ni cấy thu dịch enzyme thô tiến hành tương tự Nồng độ chất cảm ứng cho hoạt tính cellulase dịch enzyme thô cao chọn để thực thử nghiệm xác định nguồn nitrogen thích hợp Các nguồn nitrogen vô lẫn hữu NaNO3, (NH2)2CO, NH4NO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, peptone, bột đậu nành, bột trùn quế bổ sung thay cho tryptone thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen lên sinh tổng hợp cellulase Các muối NaNO3, (NH2)2CO, NH4NO3, (NH4)2SO4, NH4Cl quy đổi theo tỉ lệ 1% (w/v) hàm lượng nguyên tố nitrogen có mơi trường, cịn peptone, bột đậu nành, bột trùn quế bổ sung với lượng 1g/100 ml môi trường Chủng D19 nuôi cấy dịch enzyme thô thu nhận thí nghiệm Nguồn nitrogen cho hoạt tính cellulase dịch enzyme thơ cao chọn để xây dựng môi trường sinh tổng hợp cellulase vi khuẩn Ngồi ra, chúng tơi cịn khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon khác lên sinh tổng hợp cellulase B amyloliquefaciens D19 để chọn lọc nguồn carbon thích hợp Mơi trường ni cấy có chứa chất cảm ứng với nồng độ thích hợp nguồn nitrogen chọn từ kết thí nghiệm trước làm mẫu đối chứng, nghiệm thức khác bổ sung thêm 0,5% (w/v) nguồn carbon D-Glucose, Sucrose, Arabinose, Maltodextrin Việc nuôi cấy thu nhận enzyme thô tiến hành tương tự thí nghiệm Bên cạnh thành phần môi trường chất cảm ứng, nguồn nitrogen nguồn carbon, điều kiện nuôi cấy pH ban đầu nhiệt độ có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase chủng D19 Do đó, thí nghiệm tiến hành với môi trường nuôi cấy pha chế theo kết chọn thí nghiệm trước có điều chỉnh giá trị pH ban đầu khác 3,0-9,0 Nhiệt độ khảo sát giá trị 25℃, 30℃, 37℃, 40℃, 45℃ Q trình ni cấy thu dịch enzyme thơ tiến hành thí nghiệm trước 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase Hoạt tính cellulase xác định theo phương pháp Bernfeld Phương pháp dựa sở cho đường khử (sản phẩm thủy phân cellulose) phản ứng với thuốc thử 3,5-acid dinitrosalicylic (DNS) có màu vàng tạo thành 3-amino,5-nitro salicylic acid có màu đỏ cam hấp thụ cực đại bước sóng 540 nm Cường độ màu sản phẩm phản ứng tỷ lệ thuận với lượng đường khử tạo nhờ hoạt động xúc tác cellulase Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau ly tâm loại bỏ tế bào cho phản ứng với dung dịch CMC 1% 30 phút, sau thuốc thử DNS thêm vào để xác định lượng đường khử giải phóng Đơn vị hoạt tính (UI) cellulase xác định lượng enzyme cần thiết để xúc tác cho phản ứng phân giải cellulose tạo thành micromole đường khử thời gian phút [13] 2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu Giá trị kết thí nghiệm trung bình lần lặp lại Số liệu thơ tính tốn biểu đồ vẽ phần mềm Microsoft Excel 2010 Kết xử lý thống kê phần mềm Stagraphics XVI với hàm ANOVA, mức rủi ro α = 0,05 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái đại thể, vi thể khả sinh tổng hợp cellulase chủng B amyloliquefaciens D19 Nhằm khẳng định chủng vi khuẩn nghiên cứu B amyloliquefaciens không bị tạp nhiễm, chủng D19 kiểm tra hình thái khuẩn lạc, nhuộm Gram nhuộm bào tử Khuẩn lạc chủng D19 môi trường LB 37℃ 48 có kích thước 0,3-0,5 cm, bề mặt khơ, màu trắng đục, trịn, rìa khơng đều, có nhiều nếp nhăn gồ cao lõm tâm tạo thành hình lỗ trịn (Hình 1A) Kết nhuộm Gram chứng minh chủng vi khuẩn hình que thuộc nhóm Gram dương cịn giữ màu với tím tinh thể (Hình 1B) Khả hình thành nội bào tử chủng vi khuẩn xác nhận phương pháp nhuộm với malachite green safranin với nội bào tử bắt màu xanh tế bào sinh dưỡng bắt màu đỏ (Hình 1C) © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 70 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ Bacillus amyloliquefaciens D19 Hình 1: Hình thái khuẩn lạc chủng B amyloliquefaciens D19 sau 48 nuôi ủ môi trường LB 37℃ (A) Hình ảnh nhuộm Gram độ phóng đại X1000 (B) Hình ảnh nhuộm bào tử độ phóng đại X1000 (C) Khả phân giải cellulose D19 sau 72 nuôi ủ môi trường LB agar có bổ sung 0,5% CMC (D) Chủng B amyloliquefaciens D19 cấy chấm điểm mơi trường LB agar có bổ sung 1% CMC (w/v) ủ 37℃ vòng 72 quan sát vòng phân giải nhờ thuốc thử Lugol Sự phân hủy CMC đĩa thạch chủng B amyloliquefaciens D19 cho đường kính vịng phân giải có độ lớn 3,1±0,2 cm (Hình 1D) Kết tương đối cao so với chủng vi khuẩn Bacillus sp (2,38 cm) nghiên cứu tác giả Mai Thi cộng năm 2017 [14] Điều cho thấy chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens D19 có tiềm lớn việc thu nhận cellulase có hoạt tính cao 3.3 Đường cong tăng trưởng chủng B amyloliquefaciens D19 Tốc độ phân chia tế bào hoạt động trao đổi chất vi sinh vật (VSV) giai đoạn tăng trưởng khác Do đó, nhằm xác định tuổi giống thích hợp chủng D19 dùng cho thí nghiệm khảo sát thành phần điều kiện nuôi cấy, khảo sát đường cong tăng trưởng chủng vi khuẩn môi trường LB lỏng có bổ sung 1% CMC (w/v), lắc 150 vòng/phút, 37℃ vòng 24 xác định mật độ tế bào bước sóng 600 nm sau Đường cong tăng trưởng phân tích vẽ phần mềm GraphPad Prism (Hình 2) với giá trị R2=0,9933 Hình 2: Đường cong tăng trưởng B amyloliquefaciens D19 môi trường LB + 1% CMC Kết cho thấy sau 12 nuôi cấy, chủng vi khuẩn bắt đầu vào pha cân Giai đoạn cuối pha tăng trưởng theo hàm mũ (pha log) đầu pha cân thời điểm mật độ vi sinh vật đạt cao với hoạt động trao đổi chất mạnh, mốc thời gian 12 sau tăng sinh chọn để làm tuổi giống áp dụng cho thí nghiệm sau 3.4 Ảnh hưởng chất cảm ứng lên sinh tổng hợp cellulase B amyloliquefaciens D19 Các enzyme ngoại bào sinh tổng hợp mạnh mẽ điều kiện có diện chất cảm ứng Chính vậy, chất cảm ứng đóng vai trị quan trọng việc kích thích sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cellulase Trong thí nghiệm này, CMC, rơm, trấu, bã mía, xơ dừa, mùn cưa sử dụng làm chất cảm ứng sinh tổng hợp cellulase từ chủng B amyloliquefaciens D19, kết thể Hình © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ Bacillus amyloliquefaciens D19 71 Hình Hoạt tính cellulase dịch ni cấy B amyloliquefaciens D19 mơi trường có bổ sung chất cảm ứng khác theo thời gian (A) thời điểm 60 nuôi cấy (B) Kết cho thấy chủng B amyloliquefaciens D19 có khả sinh tổng hợp cellulase ảnh hưởng loại chất cảm ứng Tuy nhiên, hoạt tính cellulase thu nhận từ thí nghiệm với rơm đạt cao tất thời điểm (Hình 3A) Ngoại trừ mơi trường có chất cảm ứng xơ dừa, 60 thời điểm dịch ni cấy có hoạt tính cellulase cao với hoạt tính enzyme thu 501,34±14,38 UI/ml, 431,66±27,08 UI/ml, 396,32±13,25 UI/ml, 371,84±10,46 UI/ml, 331,74±16,19 UI/ml, 194,42±7,79 UI/ml tương ứng với chất cảm ứng rơm, trấu, CMC, bã mía, mùn cưa xơ dừa theo thứ tự từ cao đến thấp (Hình 3B) Như vậy, khả cảm ứng sinh tổng hợp cellulase xơ dừa mùn cưa thấp Trong nghiên cứu Mangalanayaki Aruna năm 2017, cellulase thu nhận chủng Bacillus subtilis phân lập Ấn Độ cho hoạt tính thấp sau ni cấy mơi trường có chất xơ dừa mùn cưa [15] Ngược lại cảm ứng rơm, cellulase thu nhận cho hoạt tính cao chất cịn lại cao gấp 2,5 lần so với xơ dừa Điều giải thích rơm có cấu trúc cellulose thưa lỏng lẻo với thành phần hemicellulose khoảng 10% lignin mùn cưa xơ dừa có cấu trúc cellulose dày cứng với thành phần lignin chiếm đến 30-40% Kết tương đương với nghiên cứu Ashita Dhillon cộng năm 2000 cho thấy rơm nguyên liệu cảm ứng thích hợp cho tổng hợp cellulase chủng Bacillus circulans AB [16] Ngoài ra, giới có số nghiên cứu sử dụng rơm để thu nhận enzyme nghiên cứu Varsha Goyal cộng năm 2014 ni cấy chủng Bacillus sp 313SI mơi trường có chứa rơm để thu nhận CMCase [17] Rơm loại phế phụ phẩm nông nghiệp chiếm tỷ lệ cao, đặc biệt nước có nên nơng nghiệp lúa nước lâu đời Việt Nam Chính vậy, với khả sinh tổng hợp cellulase có hoạt tính cao nhờ chất cảm ứng rơm, B amyloliquefaciens D19 chủng vi khuẩn tiềm năng, góp phần quan trọng việc sản xuất cellulase thương mại với chi phí tiết kiệm Thêm vào đó, rơm nguồn chất rẻ dồi cho nhiều ngành cơng nơng nghiệp, ứng dụng cellulase để sản xuất nhiên liệu sinh học từ rơm mục tiêu quan trọng, góp phần cho phát triển bền vững môi trường [18] Từ lý trên, rơm chọn chất cảm ứng thích hợp cho việc sinh tổng hợp cellulase B amyloliquefaciens D19 để tiến hành khảo sát 3.5 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng lên sinh tổng hợp cellulase chủng B amyloliquefaciens D19 Chất cảm ứng có nồng độ khác ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase vi khuẩn Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành thay đổi nồng độ rơm bổ sung vào môi trường nuôi cấy với tỷ lệ 0%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4% để xác định ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến sinh tổng hợp cellulase B amyloliquefaciens D19 kết thể Hình © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 72 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ Bacillus amyloliquefaciens D19 Hình 4: Hoạt tính cellulase dịch ni cấy B amyloliquefaciens D19 mơi trường có bổ sung rơm với nồng độ khác theo thời gian (A) thời điểm 48 nuôi cấy (B) Kết cho thấy hoạt tính cellulase nồng độ khác có khác biệt rõ ràng Tuy nhiên, hoạt tính cellulase khơng tuyến tính theo tăng nồng độ chất cảm ứng (Hình 4A) Enzyme cho hoạt tính cao 607,39±12,99 UI/ml sau 48 nuôi cấy bổ sung 0,5% chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy Hoạt tính giảm dần tăng nồng độ chất cảm ứng lên 1%, 2%, 3% 4% Kết mật độ rơm mơi trường nhiều làm thu hẹp môi trường sống vi sinh vật, ngồi có tỷ trọng thấp, rơm cịn ảnh hưởng đến đảo trộn mơi trường độ thơng khí mơi trường, từ làm giảm khả trao đổi chất sinh trưởng vi sinh vật Tương tự nghiên cứu Yogita Lugani cộng năm 2015 cho thấy tăng nồng độ chất cảm ứng CMC lên 1,5%, 2% 2,5% hoạt tính enzyme thu từ chủng Bacillus sp Y3 bị giảm rõ rệt [19] Đồng thời, kết nghiên cứu tương đương với nồng độ 0,75% rơm mà Goyal cộng năm 2014 sử dụng để thu nhận CMCase [17] Bên cạnh đó, kết phân tích thống kê cho thấy khác biệt đáng kể hàm lượng rơm 0,5% so với nồng độ khác (p