Tổng quan về phương pháp tinh sạch Protein

Tổng quan về phương pháp tinh sạch Protein

Tinh sạch Protein

I Giới thiệu chung

Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thểxác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trongnhững cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó.Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện với những proteintinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như

các đơn vị chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếu xạ tia X

Vì vậy, quá trình tinh sạch protein không ngừng được cải tiến để đạt được độtinh sạch cao nhất nhưng nhìn chung một quá trình tinh sạch protein cũng cần

đi qua các bước căn bản sau:

1 Nhận biết protein mục tiêu

2 Ly trích protein từ tế bào

3 Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, và liên

kết ái lực

4 Phân tách protein bằng điện di trên gel

5 Xác định trọng lượng và khối lượng của protein

II Nhận biết protein mục tiêu

Kết quả của sự tinh sạch là một mẫu protein chỉ chứa đúng một loại phân tử, ởđây là một loại protein mà nhà sinh hóa quan tâm Mẫu protein này chỉ là mộtphân đoạn chiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tế bào haymột cơ quan riêng biệt lấy của thực vật hay động vật Để xác định được proteinmục tiêu từ hỗn hợp protein, nhà sinh hóa cần thực hiện một thử nghiệm dựavào đặc tính của protein đó Nếu protein mục tiêu là một enzyme thì thửnghiệm sẽ được thực hiện dựa trên hoạt tính của enzyme đó Cụ thể như vớienzyme lactate dehydrogenase, một enzyme có vai trò trong việc sản xuất nănglượng từ glucose cũng như tổng hợp glucose từ lactate, để xác định enzyme này

thì dựa trên phản ứng của nó trong tế bàoSau đó, dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 340nm củaNicotinamide adenine dinucleotide (NADH), ta có thể đo được lượng ánh sángđược hấp thụ ở bước sóng 340nm trong một đơn vị thời gian để xác định hoạttính của enzyme lactate dehydrogenase Trên thực tế việc tìm ra một thửnghiệm hiệu quả thường rất khó, nhưng nếu có được một cách thử nghiệm càngđặc hiệu thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả Tuy nhiên, để chắc chắn quátrình tinh sạch hoạt động tốt, chúng ta còn cần một thông số là lượng protein cótrong hỗn hợp được thử nghiệm Hiện nay có rất nhiều phương pháp phát hiệnnhanh và chính xác nồng độ protein Dựa vào 2 thông số thực nghiệm là hoạttính enzyme và nồng độ protein, ta có thể xác định hoạt tính riêng của enzymetức là tỉ lệ hoạt tính enzyme với hàm lượng protein có trong mẫu thử nghiệm

Hoạt tính riêng càng cao thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả hay nói cáchkhác, mục tiêu của việc tinh sạch là làm tăng tối đa hoạt tính riêng.

III Ly trích protein từ tế bào

Khi đã tìm ra thử nghiệm phù hợp và chọn được nguồn protein, chúng ta cầnphân đoạn dịch tế bào thành nhiều phần và xác định xem phần nào chứa nhiềuprotein mục tiêu Quá trình tìm phân đoạn mục tiêu được phát triển bằng sựmày mò qua từng thí nghiệm Bước đầu tiên là phá vỡ màng tế bào, tạo thànhhỗn hợp đồng chất Sau đó phân đoạn hỗn hợp bằng ly tâm, dịch nổi chứa phân

tử có trọng lượng thấp, những phân tử có trọng lượng cao hơn lắng xuống đáyống ly tâm Dịch nổi lại được ly tâm lần nữa với lực mạnh hơn để tạo cặn vàdịch nổi mới Tiến trình này, được gọi là ly tâm phân đoạn, sẽ tạo được nhiềuphân đoạn khác nhau với tỉ trọng giảm dần, mỗi phân đoạn này chứa hàng trămphân tử protein khác nhau, sẽ được tinh sạch sau khi đã qua thử nghiệm hoạttính Thông thường, một phân đoạn có hoạt tính cao sẽ là nguồn vật liệu cho

các kỹ thuật tinh sạch hiệu quả

IV Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích,

và liên kết ái lực

Hàng ngàn protein đã được tinh sạch ở dạng có hoạt tính dựa trên những đặctính căn bản như độ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực Thôngthường, một hỗn hợp protein sẽ trải qua nhiều giai đoạn phân tách, mỗi giaiđoạn dựa trên một đặc tính nhất định, để cuối cùng là một protein tinh sạch Ởmỗi bước phân tách, thử nghiệm xác định hoạt tính và xác định nồng độ proteinđều được thực hiện Lượng đáng kể protein tinh sạch, khoảng vài miligram, cóthể giúp ta biết được cấu trúc không gian ba chiều và cơ chế phản ứng của nó

Vì vậy, sản lượng toàn phần là một điểm quan trọng của quá trình tinh sạch.Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa bằng muối, màng bán dẫn, sắc ký

IV.1 Tủa bằng muối

Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng này gọi

là tủa bằng muối (salting out) Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ muốinhất định Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phân đoạnprotein Ví dụ như fibrinogen tủa ở nồng độ muối ammonium sulfate 0.8 Mtrong khi phải đến nồng độ 2.4 M, albumin mới kết tủa Hiện tượng này được

sử dụng để tăng nồng độ của một dung dịch protein loãng chứa các phân đoạn

có hoạt tính của các bước tinh sạch trước Nếu cần thiết, lượng muối có thể

được loại bỏ bằng sự thẩm tách

IV.2 Sự thẩm tách

Protein có thể được phân tách bằng sự thẩm tách thông qua màng bán dẫn,

chẳng hạn màng cellulose với nhiều lỗ Những phân tử có cấu trức không giannhất định lớn hơn dường kính của lỗ sẽ bị giữ lại bên trong túi thẩm tách, trongkhi đó, những phân tử nhỏ hơn và các ion sẽ đi qua các lỗ đó ra ngoài túi Kỹthuật này dùng để loại bỏ muối hay tách những phân tử nhỏ, nhưng với kỹ thuật

này không phân biệt được các loại protein với nhau

IV.3 Sắc ký

Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì

nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng

ngay cho việc định lượng và định danh

Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách Trong đó, tùy vàoloại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho

pha cố định và pha di động

Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là sắc

ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion chromagraphy), sắc

ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử (ion exchange chromagraphy), sắc

ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác (affinitychromagraphy) và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử nhưng có

độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid chromagraphy)

IV.3.1 Sắc ký lọc gel

Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào kích thước phân

tử Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymerkhông tan nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạngcabohydrate) hay polyacrylamide Sephadex, Sepharose, và Bio-gel là nhữngloại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn

là 100µm (0.1mm) Những phân tử nhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt,trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt Vì vậy,những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoàitrước Phân tử có kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào được bêntrong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn những phân tử nhỏ sẽ phải đi qua

đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng

IV.3.2 Sắc ký trao đổi ion

Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang mộtđiện tích tương ứng với điểm pH đó Dựa vào điện tích thực của chúng tại mộtđiểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein Phương pháp này gọi

là phương pháp sắc ký trao đổi ion Trong phương pháp này, pha tĩnh là nhữnghạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân

tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, nếu hạt mang điện âm(như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký

trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương.Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose(DEAE-cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tửmang điện tích âm Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cộttrong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích những proteinnày, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử proteintương tác với các hạt mang điện tích Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, tathêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri

sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những proteinmang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về

điện tích

Hình 2: minh họa cơ chế giữa protein trong hệ sắc ký trao đổi ion

(a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion âm với dung dịch đệm

Protein tích điện âm cũng ion dương tương tác với nó(b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những ion âm tương tác với hạt

cũng như hạt thay thế những ion dương tương tác với protein

IV.3.3 Sắc ký ái lực

Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinhsạch protein Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với nhữngnhóm hóa học chuyên biệt Ví dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật, cóthể được tinh sạch khi cho qua cột mang những phân tử glucose bằng liên kếtcộng hóa trị Concanavalin A gắn vào cột bởi vì nó có ái lực cao với glucose,trong khi đó những protein khác thì không Concanavalin A có thể được táchgiải khỏi cột khi ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào Phân tử đườngtrong dung dịch sẽ gắn với Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối

với cột

Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã,những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình

tự DNA Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa những trình tự DNA đặc hiệuđược gắn vào thể mang; những protein có ái lực cao với trình tự DNA sẽ bắtvào các trình tự và được giữ lại Trong thí dụ này, yếu tố phiên mã sẽ đượcphóng thích khi rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao Ngoài ra, hiệnnay người ta dựa vào tính đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tinhsạch kháng nguyên hay kháng thể Nhìn chung, sắc ký ái lực có thể được dùng

để tách một protein vốn có khả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóavới nhóm này hay những chất dẫn xuất của nó được gắn trên một cái cột, sau

đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại để loại bỏ nhữngprotein không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng dungdịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết Sắc ký

ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein và

phân tử được dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao

IV.3.4 Sắc ký lỏng cao áp

Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả

năng phân tách protein được cải thiện đáng kể Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã

có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khảnăng phân tách được tăng lên đáng kể Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơnnên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp

Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh

V Phân tách protein bằng điện di trên gel

Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xácđịnh hoạt tính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, cònmột cách là làm hiện hình các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều

này được thực hiện nhờ kỹ thuật điện di

V.1Điện di một chiềuMột phân tử có mang điện tích sẽ di chuyển trong điện trường Hiện tượng này,được đặt tên là điện di, giúp hướng tới một kỹ thuật rất mạnh để phân táchprotein và các đại phân tử khác như DNA và RNA Vận tốc di chuyển (v) củamột protein (hay bất kỳ phân tử nào) trong điện trường phụ thuộc vào lực điện

trường (E), điện tích thực của protein (z) và hệ số ma sát (f)

(1)Lực điện Ez kéo phân tử mang điện tích tới điện cực trái dấu bị cản trở bởi lựckéo của độ nhớt fv tăng lên do sự ma sát giữa phân tử đang chuyển động vớimôi trường Lực ma sát phụ thuộc vào cả khối lượng, hình dạng của phân tửđang di chuyển lẫn độ nhớt (η) của môi trường Với một khối cầu có bán kính) của môi trường Với một khối cầu có bán kính

là r, ta có

(2)Điện di luôn được thực hiện trên gel (hay trên vật thể rắn như giấy) bởi vì gelgiống như một cái ray phân tử sẽ làm tăng sự phân tách Những phân tử nhỏhơn kích thước lỗ gel sẽ có thể di chuyển xuyên qua gel, trong khi đó nhữngphân tử lớn hơn lỗ gel thì gần như không di chuyển Những phân tử có kíchthước trung bình di chuyển trong gel với nhiều vận tốc khác nhau điện di đượcthực hiện trên một bảng polyacrylamide mỏng, thẳng đứng Hướng của dòng

điện từ trên xuống

Gel polyacrylamide, được tạo thành từ sự polymer hóa acrylamide và sự liênkết chéo của methylenebisacrylamide, được chọn làm môi trường cho điện di vì

nó có tính trơ về mặt hóa học và được tạo hình nhanh chóng Điện di là mộtcách lọc qua gel mà theo đó tất cả các phân tử, không xét về kích thước, sẽ bịtác động một lực để di chuyển trong cùng một chất nền Gel ở đây có thể xem

tương đương với một hạt trong cột lọc gel

Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trênacrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính Hỗn hợp protein được hòa tan trong

dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽphá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay dithiothreitol cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nốidisulfide Phức hợp SDS với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ

lệ thuận với khối lượng của protein Điện tích âm có được do gắn với SDS lớnhơn rất nhiều điện tích của bản thân protein ban đầu; vì thế, điện tích ban đầucủa protein không ảnh hưởng đáng kể đến điện tích của phức hợp Phức hợpSDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di Khi điện di kết thúc, nhữngprotein trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy các băng bằng cách nhuộm vớibạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue Những đánh dấu phóng xạ

có thể được phát hiện bằng cách đặt một tấm phim chụp x quang lên miếng gel,

quá trình này gọi là phóng xạ tự ghi

Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ởphía đầu, gần vị trí nạp mẫu Tính di động của phần lớn các chuỗi polypeptidedưới những điều kiện như thế tỉ lệ với khối lượng của chúng Tuy nhiên, cũng

có vài protein giàu carbohydrate và protein màng không tuân theo mối tươngquan này SDS-PAGE có độ phân tách cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy cao.Chỉ với lượng nhỏ khoảng 0.1ug (~2pmol) protein đã cho vạch rất rõ khinhuộm với Coomassie blue và thậm chí ít hơn (~0.02ug) vẫn có thể được pháthiện khi nhuộm bằng bạc Những protein chênh lệch về khối lượng khoảng 2%(ví dụ: 40 kD và 41 kD hay khác nhau khoảng 10 acid amin) có thể phân biệt

được bằng SDS-PAGE

Vì vậy, SDS-PAGE giúp chúng ta đánh giá kết quả của quá trình tinh sạch Vớinhững phân đoạn đầu tiên, kết quả là dãy gồm rất nhiều protein Nhưng quamỗi bước tinh sạch, số lượng protein sẽ giảm và sẽ có một băng ngày càng

đậm Vạch đó tương ứng với protein mục tiêu

V.2Điện di dựa vào điểm đẳng điện

Các protein còn có thể được phân tách bằng điện dựa vào tỉ lệ giữa số acidamin có tính acid và số acid amin có tính base của chúng Điểm đẳng điện củamột protein (pI) là điểm pH mà ở đó điện tích thực của nó bằng 0 Tại điểm pHnày, tính di động của protein trong điện trường cũng bằng 0 bởi vì z trong côngthức (1) bằng 0 Mỗi một protein có một pI riêng; ví dụ như pI của cytochrome

C, một protein vận chuyển ion có tính base cao, là 10.6, trong khi pI củaalbumin huyết thanh, một protein có tính acid trong máu, là 4.8 Giả định chomột hỗn hợp protein chạy trong điện trường trong một miếng gel với mộtkhuynh độ pH, không có sự hiện diện của SDS Mỗi protein sẽ di chuyển chođến khi nó đến vị trí mà tại đó pH bằng pI của nó Dựa vào hiện tượng này, ta

có phương pháp phân tách protein dựa vào điểm đẳng điện của protein để tạoKhuynh độ pH, trước hết là cho vào gel một hỗn hợp polyampholyte (nhữngpolymer nhỏ đa điện tích) có nhiều giá trị pI, sau đó điện di hỗn hợp này Điện

di dựa vào điểm đẳng điện phân tách protein nhanh với khả năng phân biệt

được sự chênh lệch pI khoảng 0.01 hay những protein khác nhau chỉ một đơn

vị điện tích cũng có thể được phân tách bằng phương pháp này

V.3Điện di hai chiều

Đây là một phương pháp có khả năng phân tách cao do sư kết hợp SDS-PAGEvới điện di dựa vào điểm đẳng điện Mẫu protein đầu tiên sẽ được chạy điện didựa vào điểm đẳng điện sau đó, đặt khoảng gel có chứa protein vừa được điện

di lên tấm gel SDS-polyacrylamide theo phương nằm ngang Protein sẽ chịumột điện trường theo chiều dọc Kết quả là một mô hình các điểm được phântách hai chiều, chiều ngang theo điểm đẳng điện, chiều dọc theo khối lượng.Khả năng phân tách của phương pháp này được chứng minh khi hơn một ngànprotein của vi khuẩn E coli có thể được phân tách trong một lần chạy điện di.Những protein được phân tách từ tế bào ở các điều kiện sinh lý khác nhau cóthể phân tách được bằng phương pháp này, sau đó cường độ của tính hiệu sẽđược xác định Với cách này, những protein cụ thể sẽ được thấy ở dạng mạnhhay yếu tùy vào tình trạng sinh lý Tuy nhiên, phương pháp này có một hạn chế

là có rất nhiều protein được phân tách nhưng lại phân biệt rõ Để khắc phục hạn

chế này, người ta kết hợp điện di hai chiều với kỹ thuật khối phổi

V.4Đánh giá kết quả tinh sạch protein

Sau mỗi bước tinh sạch, những thông số sau cần được ghi nhận để có thể đánh

giá quá trình tinh sạch protein:

- Protein tổng số: lượng protein có trong một phân đoạn Thông số này tínhbằng cách nhân nồng độ một phần của phân đoạn với tổng thể tích của phân

đoạn đó

- Hoạt tính tổng: hoạt tính của enzyme trong phân đoạn đó Thông số này đượctính bằng cách nhân hoạt tính của enzyme có trong lượng mẫu được xét nghiệm

với tổng thể tích của phân đoạn đó

- Hoạt tính riêng: bằng hoạt tính tổng chia cho protein tổng số

- Yield: hoạt tính còn lại sau mỗi bước tinh sạch được thể hiện bằng phần trămhoạt tính của dịch chiết thô với hoạt tính trong dịch chiết khởi đầu là 100%

- Mức tinh sạch: chỉ mức độ tinh sạch, được tính bằng cách chia hoạt tính riêng,được tính sau mỗi bước tinh sạch, với hoạt tính riêng của dịch chiết ban đầu.Qua theo nghiên cứu khảo nghiệm, người ta thấy rằng sau mỗi bước tinh sạch,mức độ tinh sạch tăng lên trong khi yield lại giảm Thật vậy, với kỹ thuật SDS-PAGE, nếu ta nạp một lượng mẫu nhất định vào mỗi giếng trên bản gel ứng vớimột bước tinh sạch, ta sẽ thấy số băng sẽ giảm tỉ lệ với mức độ tinh sạch trongkhi tỉ lệ lượng protein mục tiêu với tổng số protein hiện diện sẽ tăng

Vì vậy, đánh giá quá trình tinh sạch phải dựa cả vào 2 thông số mức độ tinhsạch và yield Một quá trình tinh sạch tốt sẽ có mức độ tinh sạch cao và chỉ sốyield thấp Nếu chỉ số yield cao còn mức độ tinh sạch thấp có nghĩa là còn

nhiều tạp nhiễm trong mẫu (nhiều protein ngoài protein mục tiêu) và làm phức

tạp việc giải thích thí nghiệm

VI Xác định khối lượng của protein

Phép ghi phổ khối lượng là một kỹ thuật dùng để phân tích trong hóa học hữu

cơ trong nhiều năm Tuy nhiên, cho đến gần đây, khả năng bay hơi quá thấpcủa protein đã làm mất tác dụng của phép ghi phổ khối lượng trong việc nghiêncứu các phân tử này Khó khăn này đã được khắc phục khi có những kỹ thuậtchuyển protein và những đại phân tử khác thành dạng khí được đưa vào ứngdụng là matrix-assisted laser desorption-ionization (MALDI) và electrosprayspectrometry Ở đây tập trung vào kỹ thuật MALDI Trong kỹ thuật này, nhữngion protein được phóng ra và sau đó được tăng tốc qua một điện trường Nhữngion này sẽ di chuyển qua một đường ống dài được hút chân không (flight tube),ion nhỏ nhất sẽ di chuyển nhanh nhất và đến đầu đọc trước nhất Vì vậy, dựavào thời gian bay (time of flight - TOF) trong điện trường ta có thể biết khốilượng của protein (hay chính xác hơn là tỉ lệ giữa khối lượng với điện tích).Với một lượng nhỏ phân tử sinh học, dù nhỏ đến khoảng vài picomole đến vàifemtomole, vẫn có thể phân tích được với cách này Một máy phổ ghi khốilượng dạng MALDI-TOF dược dùng phân tích hỗn hợp insulin và β-lactoglobulin kết quả khối lượng của 2 protein này lần lượt là 5733.9 và18,364, so với kết quả tính toán la 5733.5 và 18,388 Thí nghiệm này cho thấyMALDI-TOF thật sự là một kỹ thuật chính xác để xác định khối lượng protein

Kỹ thuật này còn được ứng dụng trong việc xác định dựa vào khối lượng củapeptide (peptide mass fingerprinting) kỹ thuật này đã mở rộng khả năng ứngdụng của điện di hai chiều Mẫu cần nghiên cứu được chiết và phân ra một cáchriêng biệt bằng các phương pháp hóa học hay enzyme học Khối lượng của cácphân đoạn protein được xác định bằng phương pháp khối phổ Cuối cùng, khốilượng của peptide được so với những số liệu đã có được tính trên máy vi tính

Kỹ thuật này cho kết quả khá tốt Ví dụ, trong số 150 protein của nấm menđược phân tách bằng điện di 2 chiều, kỹ thuật này đã giúp xác định được 80%

protein

VII Siêu ly tâm

Siêu ly tâm không chỉ là một phương pháp có thể phân tách một hỗn hợp thôcác thành phần của tế bào mà còn rất hiệu quả trong việc phân tách và phân tíchnhững phân tử sinh học Với phương pháp này, chúng ta không chỉ xác địnhđược khối lượng và tỉ trọng mà còn biết được cả hình dạng của một phân tửcũng như phân tích những tương tác giữa các phân tử Để có được những điểmnày, chúng ta cần một diễn tả một cách toán học là một phân tử bị tác động bởilực ly tâm như thế nào Dưới tác động của lực ly tâm, một phân tử sẽ di chuyểnqua một môi trường lỏng Để biết được tốc độ di chuyển của phân tử ta cần

phải tính hệ số lắng (s) theo công thức với m là khối lượng phân tử, v là thể tích từng phần (nghịch đảo của tỉ trọngphân tử), p là tỉ trọng của môi trường và f là hằng số lắng thường được biểuhiện là đơn vị Svedberg (S) bằng 10-3 s Giá trị S càng nhỏ, phân tử di chuyển

càng chậm

Vận tốc lắng của một phân tử phụ thuộc vào khối lượng của nó Một phân tử cócùng hình dạng cũng như tỉ trọng với các phân tử khác nhưng nặng hơn sẽ lắng

nhanh hơnHình dạng cũng ảnh hưởng đến vận tốc lắng vì nó tác động đến độ nhớt Hệ số

ma sát của một phân tử cuộn lại thì nhỏ hơn những phân tử cồng kềnh dù chúng

có cùng khối lượng Vì vậy, một phần tử dạng thẳng lắng chậm hơn những

phân tử hình cầu dù chúng có cùng khối lượng

Một phân tử đặc di chuyển mau hơn một phân tử ít đặc hơn bởi vì nghịch đảo

của lực đẩy đối với phân tử đặc nhỏ hơn

Vận tốc lắng còn phụ thuộc vào tỉ trọng của dung dịch (p) các phân tử lằng khi

p < 1, nổi khi p > 1 và không di chuyển khi p = 1

Một kỹ thuật tách protein dựa vào hệ số lắng khác nhau của các protein là kỹthuật ly tâm phân đoạn đầu tiên là tạo khuynh độ tỉ trọng trong một ống ly tâmbằng cách trộn 2 dung dịch có tỉ trọng khác nhau, một có tỉ trọng cao, một có tỉtrọng thấp Ví dụ, hỗn hợp sucrose 20% và sucrose 5% có khuynh độ tỉ trọng từ5% ở phía trên đến 20% ở đáy tube một lượng nhỏ dung dịch hổn hợp proteinđược nạp vào phía trên của khuynh độ về tỉ trọng khi máy quay, protein sẽ dichuyển theo khuynh độ và tách ra dựa trên hệ số lắng của chúng thời gian vàtốc độ ly tâm có được qua thực nghiệm Ta tạo một lỗ ở đáy ống ly tâm để thu

nhận các phân đoạn của protein

Khối lượng protein được xác định trực tiếp bằng trạng thái lắng cân bằng cónghĩa là mẫu được ly tâm ở vận tốc thấp đủ để sự lắng cân bằng với sự khuếchtán kỹ thuật này xác định khối lượng protein rất chính xác và có thể sử dụngcho protein không qua biến tính vì vậy cấu trúc bậc bốn của protein vẫn đượcbảo tồn Đây là điểm lợi thế của phương pháp này so với SDS-PAGE, chỉ địnhđược khối lượng của protein khi đã bị biến tính Với hai phương pháp này,SDS-PAGE cho ta biết khối lượng từng đơn phân, siêu ly tâm phân đoạn cho tabiết khối lượng của dạng đa phân, ta có thể kết hợp để biết có bao nhiêu đơn

phân trong một protein đa phân

Reference:

http://academics.vmi.edu/chem_aa/CH402/experiments/ion_exchange.htmhttp://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-1/ch5_ion-

exchange.jpgTinh sạch Protein

I Giới thiệu chung