Phương pháp đo hoạt độ enzyme

Giới thiệu các phương pháp đo hoạt độ enzyme.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TÀI LIỆU THỰC TẬP CÔNG NGHỆ ENZYME – PROTEIN

BÀI 1: CHUẨN BỊ HÓA CHẤT

1 Pha hóa chất chuẩn bị cho định hoạt tính enzyme protease:

- Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hòa tan 5,9690g Na2HPO4.12H2O trong

nước vừa đủ 250 ml

- Dung dịch KH2PO4 1/15M : hòa tan 0,9072 g KH2PO4 trong nước

vừa đủ 100 ml

- Dung dịch đệm Sorensen pH 7,6: trộn chung dung dịch Na2HPO4

1/15M với dung dịch KH2PO4 1/15M đến khi pH đạt 7,6

- Dung dịch casein 1%: pha 1g Casein trong 100 ml dung dịch đệm

Sorensen

- Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5 g TCA trong nước cho đủ 100 ml

- Dung dich NaOH 0,5N: hòa tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500

ml

- Thuốc thử Folin ( pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:5)

- Dung dich HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ

250 ml

- Dung dịch Tyrosine 20 µM/l : khuấy nghiền 1,8119 g Tyrosin trong

dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 500 ml

- Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 µM/l trong dung dịch HCl 0,2N: pha

loãng 5 ml dung dịch Tyrosine 20 µM/l trong dung dịch HCl 0,2N thành 100 ml

2 Pha hóa chất chuẩn bị cho định hoạt tính enzyme phytase:

- Dung dịch cơ chất acid phytic 0,2% (m/v ) trong đệm sodium

acetae 0,1M pH5 : cân 1g sodium phytat trong 500ml sodium axetat 0,1M dùng acid acetic đậm đặc để chỉnh về pH5

- Dung dịch phospho mẫu 0,01M: cân 0,136g KH2PO4 hòa với nước thành 100ml

- Dung dịch phospho 500 nmo/ml: hút 5ml dung dịch phospho 0,01M,

- Dung dịch FeSO4 5%: cân 5g FeSO4 hòa với nước cất lạnh thành 100ml ( kí hiệu dung dịch b) Pha trong điều kiện lạnh và dùng liền sau khi pha ( dung dịch FeSO4 phải trong suốt, không màu hoặc có màu vàng rất nhạt, nếu có màu vàng đậm thì phải pha lại)

- Dung dịch thuốc thử phosphat (dùng trong ngày): hỗn hợp giữa dung dịch a và b tỷ lệ a:b = 4:1

- Dung dịch TCA ( acid trichloro acetic) 5% : cân 25g TCA hòa với nước thành 500ml

3 Pha hóa chất chuẩn bị cho xác định phương pháp Lowry

- Dung dịch Albumin 1% : pha 1 g Albumin trong 100 ml nước cất

- Dung dịch NaOH 0,1N: pha 4 g NaOH trong 1000 ml nước cất

- Dung dịch trisodium citrate 1% : pha 1 g trisodium citrate trong 100 ml nước cất

- Dung dịch A: hòa tan 2g Na2CO3 trong NaOH 0,1N thành 100 ml

- Dung dịch B: hòa tan 0,5g CuSO4.5H2O trong dung dịch trisodium citrate 1% thành 100 ml

- Dung dịch C: hỗn hợp dung dịch A và dung dịch B theo tỷ lệ 49:1 (Pha trước khi dùng 30 phút)

- Thuốc thử Folin

4 Pha hóa chất chuẩn bị cho xác định phương pháp Bradford

- Thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue vào 50 ml etanol 96, them 100

ml H3PO485% dẫn nước đến 1000 ml

- Dung dịch protein chuẩn :

Cân 10 mg Albumin hòa tan vào 100 ml trong bình định mức 100, ta được dung dịch protein 100µg/ml

Bài 2 : PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME VI SINH VẬT THÔ

TỪ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY BỀ MẶT

1 Chuẩn bị mơi trường và giữ giống vi sinh vật

Giống VSV sử dụng trong thí nghiệm là : Aspergillus niger,

Trichoderma….

Môi trường PGA ( dung giữ giống vi sinh vật) sau khi pha chế và đã hấp khử trùng, lấy ra và để nghiêng 450 cho đến khi thạch đông cứng lại Sử dụng que cấy móc đã thanh trùng cấy chuyền theo từng điểm hay gõ vào thành ống cho bào tử bung ra khắp bề mặt thạch

Giống sau khi cấy, nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong thời gian 7 ngày, sau đó bảo quản ở 40 C Sau thời gian 2 tháng cấy chuyền giữ giống một lần để bảo đảm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật

Môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym amylase

Trấu 55 g

Bột bắp 5 gBã khoai mì 5 g Đường 4 g(NH4)2HPO4 0,1 g

CaCl2 0,1 g

Nước bổ sung để đạt thủy phần là 50-60%

Hấp khử trùng ở 121 oC trong 45 phút

Môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase

Tương tự môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym amylase nhưng thay 5g bột bắp thành 5g bã mía Hấp khử trùng ở

1210C trong 45 phút

Môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym pectinase

Tương tự môi trường bán rắn khảo sát sinh tổng hợp enzym amylase nhưng thay 5g bột bắp và 5 g bã khoai mỳ thành 10g bột cà rốt Hấp khử trùng ở 1210C trong 45 phút

Môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym protease

Tương tự môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym amylase nhưng thay 5g bột bắp thành 5g bột đậu nành Hấp khử trùng ở 1210C trong 45 phút

Cách pha môi trường

Lần lượt cho các chất khoáng hoà tan trong nước cất trước khi trộn chung nếu không sẽ tạo kết tủa không tan Trộn đều hỗn hợp với nhau, cho thêm nước sao cho độ ẩm là 50 - 60%

Cho 15g môi trường đã trộn vào các erlen 100ml, hấp khử trùng ở

1210C, trong 45 phút Sau khi hấp khử trùng, các erlen chứa môi trường bán rắn được để nguội

2 Phương pháp cấy vi sinh vật vào mơi trường bán rắn

Giống nấm mốc được giữ trong ống thạch nghiêng được cấy vào trong các erlen Cho 10ml nước cất vô trùng vào ống thạch nghiêng, hòa đều Dùng que cấy móc cà nhẹ lên bề mặt thạch để lấy hết bào tử, đánh nhẹ cho bào tử ở dạng huyền phù Tiến hành đếm bào tử bằng phòng đếm hồng cầu Cho vào các erlen chứa 15g môi trường một thể tích dịch huyền phù sao cho đạt mật độ bào tử là 105 - 106 bào tử / 1g môi trường ( 2ml) Nuôi cấy

ở nhiệt độ phòng 28 0 - 32 0 C, độ ẩm 50 - 60 %

3 Phương pháp tách chiết dịch enzym thô từ canh trường nuôi cấy

Sau thời gian nuôi cấy nấm mốc, dịch chứa enzym amylase, cellulase, pectinase, protease thô được tách chiết bằng phương pháp sau:

Cho vào mỗi erlen (chứa 15g canh trường) 100 ml nước cất Lắc 1 giờ, đem lọc qua vải, dịch lọc ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút Thu lấy dịch ly

tâm rồi định mức 100ml Ta thu được dịch enzym thô và đem xác định hoạt độ amylase, cellulase, pectinase, protease

Dứa xanh tươi đem gọt vỏ, lấy phần thịt, lõi, mắt cho vào máy xay sinh tố xay nát( không cho thêm nước).Đổ ra trên vải màn, vắt thật kỹ, lấy nước, đem ly tâm 4000 vòng/phút để loại bỏ chất xơ

2.Tinh sạch bằng Ethanol

 Nguyên tắc

Các dung môi có hằng số điện môi nhỏ (acetol, ethanol…) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường , làm giảm độ hòa tan của những phân tử protein và xảy ra kết tủa Do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme bằng cách sấy nhẹ dưới quạt gió

 Cách tiến hành

Thu dịch chiết enzyme từ canh trường: Cân 1g bột xay nhuyễn trên rồi bổ sung thêm nước cất cho đủ 100 ml, ta được dịch enzyme pha loãng 100 lần Nghiền, lắc cho enzyme trong canh trường tan đều trong nước rồi ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút và thu dịch lỏng phía trên

Làm lạnh đồng thời dịch chiết enzyme và ethanol ở nhiệt độ 0 – 4oC Tiến hành tủa ở tỷ lệ VddE : Vethanol là 1:2 Cho từ từ ethanol vào dung dịch enzyme và khuấy đều, giữ lạnh trong 40 phút, ly tâm 4000 vòng /phút trong 10 phút, thu lấy kết tủa

3.Tinh sạch bằng acetol

Thu dịch chiết enzyme từ canh trường: Cân 1g bột xay nhuyễn trên rồi bổ sung thêm nước cất cho đủ 100 ml, ta được dịch enzyme pha loãng 100 lần Nghiền, lắc cho enzyme trong canh trường tan đều trong nước rồi ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút và thu dịch lỏng phía trên

Làm lạnh đồng thời dịch chiết enzyme và acetol ở nhiệt độ 0 – 4oC Tiến hành tủa ở tỷ lệ VddE : Vacetol là 1:3 Cho từ từ acetol vào dung dịch enzyme và khuấy đều, giữ lạnh trong 40 phút, ly tâm 4000 vòng /phút trong 10 phút, thu lấy kết tủa

4 Tinh sạch bằng muối (NH4)2SO4

Muối(NH4)2SO4 bão hòa có nồng độ 77,8% ( ở nhiệt độ 300C) Cho từ từ lượng muối vào dung dịch enzyme cho đến nồng độ 80 % bão hòa và khuấy đều, giữ lạnh trong 60 phút, ly tâm 4000 vòng /phút trong 10 phút, thu lấy kết tủa

5 Tinh sạch bằng muối NaCl

Muối NaCl bão hòa có nồng độ 25% ( ở nhiệt độ 300C) Cho từ từ lượng muối NaCl vào dung dịch enzyme cho đến nồng độ 80 % bão hòa và khuấy đều, giữ lạnh trong 60 phút, ly tâm 4000 vòng /phút trong 10 phút, thu lấy kết tủa

BÀI 4:

XÁC ĐỊNH ENZYME PROTEASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ANSON

1 Nguyên lý của phương pháp

Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo sản phẩm là các đoạn peptide ngắn hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác định lượng tyrosine và tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin.

2 Đối tượng áp dụng của phương pháp

Phương pháp này áp dụng để xác định hoạt độ enzyme trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, chế phẩm sinh học

- Dung dịch đệm Sorensen pH 7,6: trộn chung 88,5 ml dung dịch

Na2HPO4 1/15M với 11,5 ml dung dịch KH2PO4 1/15M đến khi pH đạt 7,6

- Dung dịch casein 1%: pha 1g Casein trong 100 ml dung dịch đệm

Sorensen

- Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5 g TCA trong nước cho đủ 100 ml

- Dung dich NaOH 0,5N: hòa tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500

ml

- Thuốc thử Folin ( pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:4)

- Dung dich HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ

250 ml

- Dung dịch Tyrosine 20 µM/l : khuấy nghiền 1,8119 g Tyrosin trong

dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 500 ml

- Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 µM/l trong dung dịch HCl 0,2N: pha

loãng 5 ml dung dịch Tyrosine 20 µM/l trong dung dịch HCl 0,2N thành 100 ml

3.3 Chuẩn bị đường chuẩn

3.3.1 Chuẩn bị dung dịch tyrosin chuẩn

- Từ dung dịch tyrosin chuẩn 1 µM/l , xây dựng đường chuẩn với dung dịch tyrosin có nồng độ từ 0,2 - 1,0 µM/l

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

Dung dịch tyrosine chuẩn (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0

Lượng tyrosine tương ứng

(µM)

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 5,0

Dung dịch HCl 0,2N (ml) 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 5,0Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3

Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nmỐng số 6 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN)

Vẽ đường chuẩn tyrosine tương quan tương quan giữa lượng tyrosine (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN - ODKC )

4 Phương pháp tiến hành

4.1 Chiết mẫu

Mẫu cân chính xác 10g ( đối với mẫu rắn) hoặc 10 ml (đối với mẫu lỏng) cho vào becher, định mức vừa đủ 100ml bằng nước cất đem lắc trên máy lắc trong vòng 15 phút Đem ly tâm lạnh với 4000 vòng/ phút trong 10 phút, thu dịch, bỏ bã (đối với mẫu lỏng không cần ly tâm, chỉ lắc để đồng nhất mẫu)

4.2 Tiến hành

Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử khôngDung dịch hóa chất Ống nghiệm

Thử thật Thử khôngDung dịch casein 1% (ml) 5 5

Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 1

Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 20 phút

Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới

Lấy 2 ống nghiệm mới khác,cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử thật và cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không

Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm ΔOD = ODTT – ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra được µM tyrosine

4.3 Tính kết quả

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm ( 35,5oC: pH 7,6 … ) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1 µM tyrosine trong đường chuẩn

Với:

Hđ Protease : hoạt độ enzyme protease ( UI/g)

V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml)

v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)

t : thời gian thủy phân (phút)

m : khối lượng mẫu enzyme đem đi xác định hoạt tính (g)

L: độ pha loãng enzyme

µM tyrosine: lượng µM tyrosine trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

Bài 5 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PHYTASE (PHƯƠNG PHÁP

FISE VÀ SUBBAROW)

1 Nguyên tắc

Khi cho phosphate tác dụng với ammonium molybdat sẽ tạo ra phosphomolybdat có màu vàng Khi khử phosphomolybdat, màu vàng sẽ chuyển thành màu xanh molybdat Độ đậm của màu sắc tỉ lệ với hàm lượng phospho trong mẫu

Hđ Protease (UI/g)

µM tyrosine * V * L

t * m * v

=

Phản ứng được minh họa như sau:

2(MoO2.4MoO3) + H3PO4 + 4H2O (MoO2.4MoO3)2 H3PO4 H2OCác chất khử thường sử dụng là SnCl2, hydrazin, acit ascorbic, FeSO4, quinon, oxalat, sulfit Các chất khử có thể sử dụng đơn độc hay phối hợp với nhau

Ví dụ: phối hợp giữa sulfit và quinon

Khi cho phytase tác dụng với cơ chất phytate sẽ giải phóng ra phosphate Dựa vào hàm lượng phosphate sinh ra này để đánh giá hoạt tính của enzyme phytase

2 Hóa chất

- Dung dịch cơ chất sodium phyta 0,2% (m/v ) trong đệm sodium axetae 0,1M pH5 : cân 1g sodium phytat trong 500ml sodium acetat 0,1M dùng acid acetic đậm đặc để chỉnh về pH5

- Dung dịch phospho mẫu 0,01M: cân 0,136g KH2PO4 hòa với nước thành 100ml

- Dung dịch phospho 500 nmo/ml: hút 5ml dung dịch phospho 0,01M, pha thành 100ml

- Dung dịch ammonium molybdat 1,5% (w/v) trong H2SO4 5,5% ( kí hiệu dung dịch a)

+ Hút 28ml H2SO4 đđ (98%) pha với nước thành 500ml, được dung dịch

- Dung dịch thuốc thử phosphat (dùng trong ngày): hỗn hợp giữa dung dịch a

Lấy một loạt ống nghiệm sạch, tiến hành pha dung dịch phospho với nồng độ theo bảng sau:

Dung dịch phospho 500nmol/ml 0 1 2 3 4 5

Nồng độ phospho (nmol/ml) 0 100 200 300 400 500Thuốc thử phosphat (ml) 5 5 5 5 5 5

Lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng (30oC), đem đo mật độ quang ở bước sóng 700nm Dựng đồ thị biễu diễn sự biến thiên của mật độ quang (ΔOD) theo nồng độ phospho (nmol/ml)

 Phản ứng enzyme:

Cân m(g) chế phẩm enzyme nghiền và hòa với V (ml) nước cất, lắc trên máy lắc 45 phút để enzyme hòa tan hoàn toàn vào nước, lọc qua giấy lọc ta thu được dịch enzyme thô Xác định hoạt tính phytase trong dịch enzyme này

Thực hiện phản ứng enzyme và phản ứng màu như sau:

a: nồng độ phospho suy ra từ đường chuẩn (nmol)

V: thể tích dung dịch phospho trước khi cho thuốc thử (5ml)

L: độ pha loãng enzyme

0,5: thể tích enzyme cho vào phản ứng

m: khối lượng chế phẩm enzyme phân tích

so màu để xác định hàm lượng protein

 Hóa chất

Dung dịch Albumin 1% : pha 1 g Albumin trong 100 ml nước cất

Dung dịch NaOH 0,1N: pha 4 g NaOH trong 1000 ml nước cất

Dung dịch trisodium citrate 1% : pha 1 g trisodium citrate trong 100 ml nước cất

Dung dịch A: hòa tan 2g Na2CO3 trong NaOH 0,1N thành 100 ml.

Dung dịch B: hòa tan 0,5g CuSO4.5H2O trong dung dịch trisodium citrate 1% thành

ở bước sóng 750nm

Tiến hành dựng đường chuẩn với trục X là nồng độ protein và trục Y là ΔOD (ΔOD = ODi – ODo ) Dựa vào đường chuẩn này ta xác định được nồng độ protein trong dung dịch mẫu

Xác định hàm lượng protein trong dung dịch nghiên cứu

Tiến hành tương tự như phần xây dựng đồ thị chuẩn

 Cách tính

Dựa vào đường chuẩn Albumin, ta suy ra được nồng độ protein của mẫu

Hàm lượng protein có trong 1g mẫu được tính theo công thức:

mg protein/g =

m

n

*10

*

a -3

Với: a*10-3 : nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (mg/ml)

n : độ pha loãng mẫu

m : khối lượng mẫu sử dụng (g)

Bài 7 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN BẰNG

PHƯƠNG PHÁP BRADFORDNguyên tắc:

Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi cho Coomassie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid

Hóa chất:

Thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue vào 50 ml etanol 96, them 100 ml

H3PO485% dẫn nước đến 1000 ml

Dung dịch protein chuẩn :

Cân 10 mg Albumin hòa tan vào 100 ml trong bình định mức 100, ta được dung dịch protein 100µg/ml

Tiến hành thí nghiệm :

Xây dựng đường chuẩn:

Từ đường chuẩn suy ra hàm lượng protein cần phân tích

Bài 8: SẮC KÝ LỌC GEL SEPHADAX_G50

1 Bước đầu tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.

Thực hành

• Dụng cụ và thiết bị

o Phễu đổ gel

o Bình hút chân không