TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG ************ NGHIÊN CỨU THU NHẬN TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực ThS PHẠM VĂN PHÚC ĐẶNG THỊ KIM NGÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 1/2010 LỜI CẢM ƠN Sau tháng trau dồi kiến thức rèn luyện, cuối luận văn tốt nghiệp tơi đạt kết định Có thành hơm nay, ngồi cố gắng thân, tơi cịn nhận nhiều quan tâm hỗ trợ từ nhiều phía Với tất lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn đến: Ban Giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng, thầy cô Khoa Khoa Học Ứng Dụng, người tận tình dạy dỗ suốt năm học trường Những kiến thức mà thầy cô truyền đạt tảng vững cho suốt thời gian thực luận văn Thầy Phan Kim Ngọc, người gieo vào tơi niềm đam mê u thích ngành Cơng nghệ sinh học người động vật Em xin cám ơn thầy tạo điều kiện thuận lợi để em đạt kết tốt Và hết em xin cám ơn quan tâm ấm áp thầy giúp em vơi bớt lo âu thời gian thực đề tài Thầy Phạm Văn Phúc, người trực tiếp hướng dẫn khoa học giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận Thầy theo dõi sát kịp thời dẫn dắt hỗ trợ để thực đề tài cách thuận lợi Thầy Nguyễn Thanh Tâm, người hết lịng bảo tận tình dìu dắt tơi từ thao tác Bên cạnh kiến thức khoa học, thầy cịn ln quan tâm động viên, giúp tơi dễ dàng hịa nhập vào môi trường thực tốt đề tài Em xin cám ơn chị Bích Ngọc, chị Mỹ Linh, chị Quỳnh Anh, chị Hải Hà, anh Minh Hoàng thầy cơ, cán trẻ Phịng thí nghiệm Tế bào gốc, trường Đại học Khoa học tự nhiên Tp Hồ Chí Minh, người quan tâm giúp đỡ nhiều quãng thời gian thực đề tài Các anh chị dẫn tận tình hỗ trợ tơi điều kiện tốt để thực tốt đề tài Nhóm bạn sinh viên trường Đại học Quốc tế, Đại học Bách Khoa Đại học Sư Phạm Tp.HCM chung vai sát cánh, chia sẻ cho khó khăn niềm vui suốt thời gian thực đề tài i Các bạn sinh viên lớp 09SH1N, người bạn thân mến quan tâm giúp đỡ năm học trường Xin cám ơn bạn kịp thời bên cạnh an ủi dộng viên, giúp tơi có thêm niềm tin để vượt qua trở ngại trình thực đề tài Cuối cùng, xin gửi đến Ba Mẹ lòng biết ơn to lớn Con cám ơn Ba Mẹ sinh thành, nuôi dưỡng dành cho tình u thương bao la tận ngày hơm Ba Mẹ chỗ dựa tinh thần vững cho giúp có đủ nghị lực niềm tin để vượt qua khó khăn sống Tơi xin chân thành cám ơn người! i TĨM TẮT Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THU NHẬN TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI GVHD: ThS Phạm Văn Phúc – Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp.Hồ Chí Minh SVTH: Đặng Thị Kim Ngân – 09SH1N Thời gian nghiên cứu: 03 tháng, từ tháng 09/2009 đến 12/2009 Địa điểm nghiên cứu: PTN Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc – Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp Hồ Chí Minh Mục đích tiến hành đề tài: - Thiết lập quy trình thu nhận nguồn tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người - Nghiên cứu môi trường nuôi cấy dịng tế bào tiền thân nội mơ hiệu Tóm tắt bố trí thí nghiệm: - Mẫu máu cuống rốn cung cấp từ Ngân hàng Tế bào gốc MekoStem Bệnh viện Phụ sản Hùng Vương Tp.HCM tiến hành thu nhận tế bào đơn nhân khảo sát nuôi môi trường để thu tế bào tiền thân nội mô + Thu nhận tế bào đơn nhân + Nuôi cấy chọn lọc môi trường khảo sát + Phân tích marker bề mặt tế bào Kết đạt được: - Bước đầu xây dựng quy trình thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người - Nghiên cứu môi trường nuôi cấy tế bào tiền thân nội mô ứng viên tối ưu môi trường khảo sát ii MỤC LỤC Bìa Trang tựa Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt iv Danh sách hình v Danh sách bảng vi Danh sách biểu đồ vii Danh sách sơ đồ viii CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU ĐỀ TÀI 1.3 Ý NGHĨA ĐỀ TÀI CHƯƠNG 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TẾ BÀO GỐC 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Đặc điểm 2.1.3 Phân lo ại 2.1.4 Ứng dụng 2.2 SINH HỌC CUỐNG RỐN iii 2.2.1 Cấu trúc phát triển cuống rốn 2.2.2 Một số thông tin tế bào máu cuống rốn 2.2.3 Những ưu từ tế bào gốc máu cuống rốn 10 2.3 TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ MÁU CUỐNG RỐN 11 2.3.1 Định nghĩa 11 2.3.2 Đặc điểm tế bào tiền thân nội mô 11 2.3.3 Nguồn tế bào tiền thân nội mô 12 2.3.4 Ứng dụng 13 2.4 NUÔI CẤY TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN 14 2.4.1 Điều kiện nuôi cấy 14 2.4.2 Môi trường dinh dưỡng 16 2.5 PHƯƠNG PHÁP FLOW CYTOMETRY 18 2.5.1 Lược sử nghiên cứu 18 2.5.2 Nguyên tắc hoạt động 19 2.5.3 Thiết bị flow cytometry 20 2.5.4 Phương pháp phân loại tế bào dựa phát huỳnh quang (FACS) 21 2.5.5 Ứng dụng 22 CHƯƠNG VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 23 3.1 VẬT LIỆU 23 3.1.1 Mẫu vật 23 3.1.2 Dụng cụ 23 3.1.3 Thiết bị 23 iii 3.1.4 Hóa chất mơi trường thí nghiệm 25 3.2 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 27 3.2.1.Thu nhận tế bào đơn nhân phương pháp ly giải hồng cầu 28 3.2.2.Thu nhận tế bào đơn nhân phương pháp ly tâm đẳng tỉ trọng với Percoll 37 CHƯƠNG KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 40 4.1 KẾT QUẢ THU NHẬN TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ ỨNG VIÊN B ẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY CHỌN LỌC TRONG MÔI TRƯỜNG 40 4.1.1 Hiệu bám dính, tăng sinh tế bào môi trường khảo sát 40 4.1.2 Tỉ lệ % tế bào đơn nhân dương tính với marker CD34 mơi trường nuôi cấy chọn lọc 57 4.2 KẾT QUẢ THU NHẬN TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ ỨNG VIÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH TẾ BÀO CD34 + BẰNG FLOW CYTOMETRY 65 4.2.1 Kết xác định tế bào dương tính với marker CD34 65 4.2.2 Hiệu bám dính tăng sinh c tế bào CD34 + môi trường khảo sát 66 4.3 SO SÁNH HIỆU QUẢ THU NHẬN TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ ỨNG VIÊN GIỮA PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY CHỌN LỌC TRONG MÔI TRƯỜNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TÁCH TẾ BÀO CD34 + BẰNG FLOW CYTOMETRY 78 CHƯƠNG KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 81 5.1 KẾT LUẬN 81 5.2 ĐỀ NGHỊ 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 Phụ lục iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AS Adult Stem Cell Tế bào gốc trưởng thành EBM-2 Endothelial Basal Medium-2 Môi trường EBM-2 EBSS Earle's balanced salt solution Dung dịch muối cân EC Embryonic Carcinoma Tế bào khối u phôi EG Embryonic Germ Cell Tế bào mầm phôi EPC Endothelial Progenitor Cell Tế bào tiền thân nội mô ES Embryonic Stem Cell Tế bào gốc phôi FACS Fluorescence-Activated Cell Sorting Phương pháp phân loại tế bào dựa vào phát huỳnh quang FBS Fetal Bovine Serum Huyết bào thai bò FSC Forward Scattered Light Ánh sáng tán xạ theo phương tới FITC Fluorescein Isothiocyanate Thuốc nhuộm huỳnh quang FITC GVHD Graft Versus Host Desease Bệnh mảnh ghép chống lại ký chủ HAEC Human Aortic Endothelial Cell Tế bào nội mô động mạch chủ người HBSS Hank's Buffered Salt Solution Dung dịch muối đệm ICM Inner Mass Cell Khối tế bào bên IGF Insulin-like Growth Factor MSC Mesenchymal Stem Cell Tế bào gốc trung mô myES My Embryonic Stem Cell Tế bào gốc phôi tự thân PBS Phosphate Buffer Saline Dung dịch đệm photphat SSC Forward Scattered Light Ánh sáng tán xạ theo phương bên iv DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Tế bào gốc tế bào tiền thân Hình 2.2 Chiến lược cấy ghép tế bào gốc Hình 2.3 Chiến lược dùng tế bào gốc liệu pháp gen Hình 2.4 Hình thái tế bào tiền thân nội mô 11 Hình 2.5 Các nguồn gốc EPC 12 Hình 2.6 Nguyên tắc hoạt động Flow Cytometry 20 Hình 2.7 Phân loại tế bào cách sử dụng bảng tích điện 22 Hình 3.1 (a) Bình ni, (b) Màng lọc vơ trùng 0,2µm, (c) Đĩa giếng 23 Hình 3.2 (a) Autoclave, (b) Tủ ni tế bào, (c) Kính hiển vi đảo ngược, (d) Tủ cấy vơ trùng, (e) Máy ly tâm, (f) Máy FACS- Calibur 24 Hình 3.3 Các thao tác minh họa quy trình thu nhận tế bào đơn nhân 29 Hình 3.4 Các thao tác minh họa quy trình thay mơi trường sau khoảng 24h, 48h, 72h 31 Hình 3.5 Hình thái tế bào tiền thân nội mơ ứng viên 33 Hình 3.6 Các thao tác minh họa quy trình phân tích tế bào Flow Cytometry 36 Hình 3.7 Các thao tác minh họa quy trình thu nhận tế bào đơn nhân phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng với Percoll 38 Hình 4.1 Vạch tế bào đơn nhân thu phương pháp ly giải hồng cầu 40 Hình 4.2 Tế bào bám dính ni mơi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS sau 24h 41 Hình 4.3 Tế bào bám dính nuôi môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS + GF sau 24h 44 Hình 4.4 Tế bào bám dính ni môi trường EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS sau 24h 47 v Hình 4.5 Tế bào bám dính ni mơi trường EBM-2 bổ sung 15% FBS/KS + GF sau 24h 50 Hình 4.6 Tế bào bám dính mơi trường giếng sau 48h ni c 52 Hình 4.7 Tế bào bám dính mơi trường giếng sau 72h ni c 55 Hình 4.8 Tế bào bám dính mơi trường giếng sau 72h nuôi c 56 Hình 4.9 Kết kiểm tra marker CD34 ni cấy tế bào tiền thân nội mô ứng viên môi trường (M199 bổ sung 15%FBS/KS) 58 Hình 4.10 Tế bào đơn nhân môi trường (M199 bổ sung 15%FBS/KS) 59 Hình 4.11 Tế bào đơn nhân mơi trường (M199 bổ sung 15%FBS/KS+GF) 59 Hình 4.12 Kết kiểm tra marker CD34 nuôi c tế bào tiền thân nội mô ứng viên môi trường (M199 bổ sung 15%FBS/KS + GF) 60 Hình 4.13 Tế bào đơn nhân môi trường (EBM-2 bổ sung 15%FBS/KS) sau ngày nuôi cấy 61 Hình 4.14 Tế bào đơn nhân mơi trường (EBM-2 bổ sung 15%FBS/KS + GF) sau ngày nuôi cấy 61 Hình 4.15 Kết kiểm tra marker CD34 + nuôi cấy tế bào tiền thân nội mô ứng viên môi trường (EBM-2 bổ sung 15%FBS/KS) 62 Hình 4.16 Kết kiểm tra marker CD34 + nuôi cấy tế bào tiền thân nội mô ứng viên môi trường (EBM-2 bổ sung 15%FBS/KS + GF) 64 Hình 4.17 Kết tách tế bào dương tính với market CD34 65 Hình 4.18 Tế bào bám dính ni cấy mơi trường M199 bổ sung 15%FBS/KS sau 24 68 Hình 4.19 Tế bào bám dính ni cấy mơi trường M199 bổ sung 15%FBS/KS + GF sau 24h 69 Hình 4.20 Tế bào bám dính ni cấy môi trường EBM-2 bổ sung 15%FBS/KS sau 48 70 Hình 4.21 Tế bào bám dính ni cấy mơi trường EBM-2 bổ sung 15%FBS/KS + GF sau 72h 72 v MÔI TRƯỜNG 3: EBM-2, 15%FBS/KS MẪU THỊ TRƯỜNG 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 G1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 TỔNG CỘNG 17 24h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 13 MẪU 48h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 2 0 1 1 0 0 0 0 24h G2 G3 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 4 4 G1 1 0 0 0 0 0 3 0 0 MẪU 48h G2 G3 0 7 3 1 0 0 0 0 1 19 11 87 26 75 G1 0 0 1 0 4 72h G2 0 1 0 0 0 0 0 G3 9 10 3 10 G1 0 0 0 0 0 0 0 74 19 130 33 24h G2 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 G3 0 0 11 6 4 4 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 48h G2 G3 0 0 0 0 0 17 1 0 10 0 1 0 0 2 111 12 76 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 1 0 12 MÔI TRƯỜNG 3: EBM-2, 15%FBS/KS MẪU THỊ TRƯỜNG 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 TỔNG CỘNG MẪU G1 2 0 1 0 1 24h G2 G3 1 3 2 0 2 0 1 2 1 1 0 0 G1 4 4 13 11 13 20 24 22 18 11 11 12 11 17 18 10 8 48h G2 0 0 0 1 0 1 0 1 G3 0 0 2 0 1 0 0 0 3 G1 3 0 0 1 1 1 1 1 72h G2 G3 2 1 1 0 0 0 15 2 4 5 1 2 13 G1 0 0 0 0 0 1 1 2 0 0 0 24h G2 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 5 9 11 0 1 1 1 0 0 0 48h G2 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 G3 0 1 0 2 0 2 0 0 1 G1 0 0 2 13 3 72h G2 14 3 3 2 10 14 12 10 18 14 12 G3 3 6 3 6 16 45 34 290 22 29 36 87 13 15 85 28 106 184 140 33 69 MÔI TRƯỜNG 4: EBM-2, 15%FBS/KS + GF MẪU THỊ TRƯỜNG 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 TỔNG CỘNG G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 13 MẪU 48h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 MẪU 48h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 1 0 0 0 0 0 2 0 0 13 24h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 1 0 0 0 0 2 0 0 27 48h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MÔI TRƯỜNG 4: EBM-2, 15%FBS/KS + GF THỊ TRƯỜNG 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 TỔNG CỘNG MẪU G1 1 0 2 2 0 0 0 0 3 1 24h G2 4 10 10 5 14 5 15 7 11 G3 0 1 1 2 0 1 11 G1 8 10 9 13 13 12 17 11 48h G2 0 2 1 2 2 0 MẪU G3 1 2 1 1 0 0 2 0 0 0 4 G1 1 2 0 1 1 1 0 72h G2 11 0 0 2 0 G3 0 1 0 0 10 10 12 G1 3 0 3 0 3 1 2 1 24h G2 0 2 0 5 3 3 4 2 G3 0 1 1 1 21 1 1 0 1 G1 10 7 3 3 10 11 10 7 6 48h G2 0 1 1 3 2 0 2 3 G3 2 0 0 0 0 0 0 0 1 G1 1 1 1 1 0 0 72h G2 2 2 11 4 11 G3 5 2 7 7 5 10 0 34 199 50 217 49 27 31 64 99 45 66 41 162 42 21 33 113 123 PHỤ LỤC MÔI TRƯỜNG 1: M199 MẪU THỊ TRƯỜNG 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 TỔNG CỘNG G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MẪU 48h G2 G3 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 2 1 0 2 0 0 0 0 29 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 11 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 17 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 MẪU 48h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 12 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24h G2 G3 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 20 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 48h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 16 G1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 10 13 MÔI TRƯỜNG 1: M199, 15%FBS/KS MẪU THỊ TRƯỜNG 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 TỔNG CỘNG G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24h G2 G3 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 37 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MẪU 48h G2 G3 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 3 0 21 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 12 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 48h G2 G3 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 19 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 MÔI TRƯỜNG 2: M199, 15%FBS/KS + GF MẪU THỊ TRƯỜNG 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 TỔNG CỘNG G1 0 0 0 0 0 02 0 0 02 0 0 0 0 24h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MẪU 48h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 17 10 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 13 G1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 24h G2 G3 0 1 0 0 0 0 1 1 0 2 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 10 15 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MẪU 48h G2 G3 0 0 1 2 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 16 18 G1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24h G2 G3 0 1 1 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 31 16 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 48h G2 G3 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 20 19 G1 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MÔI TRƯỜNG 2: M199, 15%FBS/KS + GF MẪU THI TRƯỜNG 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 TỔNG CỘNG G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 24h G2 G3 0 0 1 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 27 21 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MẪU 48h G2 G3 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 G1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 24h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 14 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 48h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 17 PHỤ LỤC MÔI TRƯỜNG 1: M199 MẪU THỊ TRƯỜNG 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 TỔNG CỘNG G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24h G2 G3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 G1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 11 17 MẪU 48h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 G1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 24h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 10 MẪU 48h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 48h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 2 29 MÔI TRƯỜNG 1: M199, 15%FBS/KS MẪU THI TRUONG G1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 TỔNG CỘNG 24h G2 G3 G1 MẪU 48h G2 G3 G1 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 4 1 0 4 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 10 32 18 4 10 24h G2 G3 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 15 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 48h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 13 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MÔI TRƯỜNG 2: M199, 15%FBS/KS + GF MẪU G 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 24h G 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 G 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 THỊ TRƯỜNG 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 TỔNG CỘNG MẪU 48h G2 0 0 0 0 0 0 0 0 1 G 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 72h G G1 G3 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 24h MẪU 48h 72h 24h 48h 72h G1 G2 G3 G1 G2 G3 G1 G2 G3 G1 G2 G3 G1 G2 G3 G1 G2 G3 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 2 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 3 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 13 7 20 11 28 13 10 17 17 MÔI TRƯỜNG 2: M199, 15%FBS/KS + GF MẪU THI TRUONG 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 TỔNG CỘNG G1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 24h G2 G3 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 45 16 10 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 MẪU 48h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 24h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 G1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 48h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 12 72h G2 G3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 14 ... 3.1.4.1 Hóa chất PBS- (Khơng có ion Ca 2+ Mg 2+)/KS - NaCl 10 g - KCl 0,25 g - Na2 HPO4.12H2O 1,44 g - KH2PO4 0,25 g - Kháng sinh Gentamycine 1% - Nước cất hai lần đủ lít - pH 7,40 - Hấp vô trùng... Dung dịch Percoll 100 ml - Percoll 55ml - Nacl 1.5M 10ml - Nước cất 35ml - Bảo quản 4o C Trypsin/EDTA 0,25 % - Bột Trypsin 0,25 g - EDTA 0,093 g - PBS- 100 ml - Khử trùng: lọc (Màng lọc vơ... 30 phút - Bảo quản nhiệt độ phòng, sử dụng tối đa tháng Dung dịch li giải hồng cầu - NH4Cl 8,28 g - KHCO3 1g - EDTA 0,036 g - Nước cất đủ lít - pH 7,4 - Hấp khử trùng 121 0C, 30 phút - Bảo quản