Sự sao chép Heparansulphat Interacting Protein (HIP) ở mô ung thư vú doc

TCNCYH 38 (5) - 2005 SỰ SAO CHÉP HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN (HIP) Ở MÔ UNG THƯ VÚ Phan Tôn Hoàng 1 , Tạ Thành Văn 2 1 Khoa Hóa sinh - Bệnh Viện Bạch Mai 2 Bộ môn Hóa - Hóa sinh - Trường Đại học Y Hà Nội t t t I Heparansulfat Interacting Pro ein (HIP) được tổng hợp với nhiều mức độ khác nhau ở các dòng tế bào và mô đặc biệt ở dòng tế bào ung thư. Điều đó cho phép chúng tôi đưa ra giả thiết: HIP được tăng cường ổng hợp ở cả mức độ mRNA và pro ein tại mô ung thư vú. Mục tiêu: Thiết kế mồi HIP và đánh giá mức độ sao chép (mRNA) của HIP ở mô ung thư vú đối chiếu kết quả của các phương pháp xét nghiệ m cận lâm sàng khác. Phương pháp: Tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA và khuếch đại gen mã hóa H P sử dụng mồi đặc hiệu. Kết quả: Mồi HIP đã khuếch đại đặc hiệu gen mã hóa HIP. mRNA của HIP được sao chép với một lượng đáng kể trong mô ung thư vú trong khi không phát hiện được ở mô u xơ. Kết quả xét nghiệm sinh học phân tử này tương ứng với các kết quả xét nghiệm XQ và tế bào học. Kết luận: Mồi HIP do chúng tôi thiết kế đã khuếch đại thành công gen mã hóa HIP và sự sao chép mRNA của HIP được tăng cường trong mô ung thư vú. Từ khóa: HIP/L29; ung thư vú; RNA thông tin. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Các protein gắn ái lực với heparin/heparansulfat trên bề mặt màng tham gia điều hòa nhiều chức năng quan trọng của tế bào như: phát triển, biệt hóa và di căn [1]. Năm 1996, Liu và cộng sự lần đầu tiên đã tổng hợp được chuỗi ADN bổ sung (cDNA) của heparansulfat interacting protein (HIP) nhờ kỹ thuật sao chép ngược (RT - PCR) sử dụng các cặp mồi được thiết kế từ trình tự mã hoá acid amine của các phân đoạn HIP [6]. cDNA của HIP mã hoá phân t ử protein có chiều dài 159 acid amin với trọng lượng phân tử vào khoảng 18kDa, pI là 11,75. Sử dụng kỹ thuật Northern blot, các tác giả đã xác định mRNA của HIP có chiều dài là 1,3kb [6]. Năm 1997, cũng chính nhóm các tác giả này đã xây dựng mô hình nghiên cứu thực nghiệm in vitro để nghiên cứu chức năng sinh học của HIP như: (1) Tham gia quá trình liên kết tế bào - tế bào; (2) Gắn đặc hiệu và chọn lọc với Heparin/Heparansulfate (HP/HS) và (3) Tham gia điều hoà quá trình đông máu. HIP còn có khả năng tham gia quá trình điều hoà liên kết tế bào - tế bào để thông qua đó tác động đến quá trình di căn. HIP được tổng hợp ở nhiều mức độ khác nhau tuỳ thuộc vào từng dòng tế bào cũng như từng loại mô. Các kết quả nghiên cứu cho thấy HIP được tổng hợp nhiều ở các dòng tế bào nội mạc, biểu mô, trong khi không phát hiện được ở dòng tế bào sợi và tổ chức liên kết [6]. Với việc sử dụ ng dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại của bệnh nhân ghép tạng sử dụng cyclosporin A (CsA) trong mô hình nghiên cứu thực nghiệm in vitro, Tạ Thành Văn và cộng sự cho thấy HIP có khả năng điều hoà sự lưu trữ và giải phóng yếu tố phát triển tế bào để thông qua đó tham gia vào quá trình điều hoà sự phát triển và biệt hoá của tế bào [2, 3, 7]. Wang Y và cộng sự (1999) đã chỉ ra rằng mHIP và HIP protein được tă ng cường tổng hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư đại tràng. Đồng thời sự tăng cường tổng hợp này tuỳ thuộc vào các giai đoạn phát triển và biệt hoá của khối u [8]. Sự khác biệt về mức độ tổng hợp HIP đã cho phép tác giả đề nghị một khả năng là dùng HIP như là một dấu ấn đánh giá mức độ phát triển bất thường của tế bào trong giai đoạn tiền ung thư đại tràng. Cũng trong thời gian này nhóm các tác giả người ý cũng đã phát hiện ra rằng cả gen mã hoá HIP và HIP protein cũng được tăng cường tổng hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư tuyến giáp trạng. Lượng mARN và HIP protein đều được xác định là phụ thuộc vào quá trình phát triển và biệt hoá của tế bào ung thư giáp trạng [4]. Carson D và cộng sự, tác giả của việc phát hiện ra HIP đã công bố: Sự tổng hợp của HIP liên quan đến các dòng tế bào ung thư vú người đặc biệt là các dòng tế bào có độ ác tính và di căn cao [5]. Cho đến nay, hầu hết các kết quả nghiên cứu đều chứng minh rằng HIP được tăng cường tổng hợp ở một số dòng tế bào và mô ung thư ở cả 5 TCNCYH 38 (5) - 2005 mức độ mARN và protein. Hơn nữa, mức độ thể hiện HIP phụ thuộc vào giai đoạn phát triển và biệt hoá của tế bào ung thư. Điều đó cho phép chúng tôi đưa ra giả thiết rằng HIP có thể được sử dụng như là một dấu ấn để đánh giá mức độ phát triển biệt hoá của một số dòng tế bào giúp cho việc chẩn đoán sớm mộ t số loại hình ung thư. Chính vì vậy công trình nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu: 1. Thiết kế mồi HIP, xác định mức độ sao chép (mRNA) của HIP ở mô ung thư vú sử dụng kỹ thuật sao chép ngược (RT - PCR). 2. Đối chiếu kết quả mRNA của HIP với các kết quả xét nghiệm cận lâm sàng: XQ và tế bào học. II. ĐỐI TƯỢNG, HOÁ CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu và tiêu chuẩn chọn bệnh nhân Gồm 3 trường hợp bị ung thư vú giai đoạn 3 đã được chẩn đoán xác định của lâm sàng, cận lâm sàng (mô bệnh học, XQ, hoá sinh) tại bệnh viện K Trung ương. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: bệnh nhân chỉ bị ung thư vú, không mắc bất kỳ loại hình bệnh tật, ung thư nào khác. 2. Hoá chất Các hoá chất tách chiết RNA tổng số gồm: Isogen, chloroform, isopropanol, ethanol, diethyl - pyrocarbonat (DEPC) được mua từ Walko. Các hoá chất dùng để tổng hợp cDNA như random primer, dNTP 10mM, PCR 5x buffer, dithionthritol 0,1M (DTT), Moloney Murine Leukemia Virus - Reverse Trancriptase (MMLV - RT), RNase out, được mua từ Invitrogen. Cặp mồi để khuếch đại gen HIP và GAPDH được mua từ Invitrogen. 3. Phương pháp nghiên cứu 3.1. Lấy mẫu và tách chiết RNA tổng số - Lấy mẫu: Ngay sau khi bệnh nhân được phẫu thuật cắt bỏ khối u, bệnh phẩm được chuyển đến khoa Giải phẫu bệnh, làm chẩn đoán mô bệnh học xác định ung thư trong khoảng thời gian 30 - 45 phút. Mẫu được lấy vào lọ vô trùng, bảo quản ở - 80 0 C. - Tách chiết RNA tổng số: nghiền 120 - 150 mg bệnh phẩm với 1ml Isogen để trong cối sứ tạo thành hỗn hợp dịch đồng nhất. Dịch nghiền sau đó được chuyển sang ống eppendorf để ở nhiệt độ phòng 5 phút, ly tâm ở 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 0 C, loại bỏ lớp lipít trên cùng, lấy phần dung dịch. Thêm 0,2ml chloroform, lắc nhẹ nhàng 15 giây. Tủa DNA sẽ xuất hiện, để ở nhiệt độ phòng 2 - 3 phút, ly tâm 15.000 vòng/phút ở 4 o C trong 15 phút, hút lấy phần dung dịch trên cùng. Phần dung dịch này chứa RNA tổng số và được chuyển sang ống Eppendorf khác. Thêm 0,5ml Isopropanol, lắc nhẹ nhàng 15 giây, để yên ở nhiệt độ phòng 5 - 10 phút. Tủa RNA xuất hiện, ly tâm 15.000 vòng/phút ở 4 o C trong 5 phút. Giữ lại phần cặn ở đáy ống, loại bỏ phần dung dịch. Rửa tủa bằng ethanol 75%, ly tâm thu hồi tủa và hoàn tan bằng 20µl nước cất có DEPC (DEPC - water), thu được dung dịch RNA tổng số và bảo quản ở -70 o C. 3.2. Kỹ thuật tổng hợp ngược cDNA (RT- PCR) cDNA được tổng hợp từ RNA tổng số với sự tham gia của enzym sao mã ngược MMLv - RT, mồi ngẫu nhiên (Random Primer) được pha loãng 20 lần, dNTP 10mM, DTT 0,1M, enzym ức chế phân huỷ RNA (RNAase out), PCR 5x buffer và nước cất dùng cho PCR có DEPC. - Tiến hành: Cho vào 1 ống eppendorf sạch: RNA tổng số: 5 µg DEPC - water: 1 µl Trộn nhẹ nhàng, ủ 65 o C trong 5 phút, trong đá lạnh 1 phút sau đó thêm: Random primer: 2 µl dNTP 10mM: 5 µl Để ở nhiệt độ phòng 10 phút, trong đá lạnh 1 phút sau đó thêm: PCR 5X buffer: 4 µl DTT 0,1M: 1 µl RNAase out: 1 µl MMLV-RT: 1 µl Tổng thể tích phản ứng là: 20µl. Quy trình nhiệt độ cần thiết cho quá trình tổng hợp cDNA trên máy PCR như sau: 37 0 C: 55 phút; 70 0 C: 15 phút và 4 0 C để bảo quản tạm thời, và sản phẩm cDNA được bảo quản dài ngày ở -20 o C. 6 TCNCYH 38 (5) - 2005 3.3. PCR khuếch đại gen mã hóa HIP ở mô ung thư vú Sau khi tổng hợp xong cDNA, gen mã hóa GAPDH được sử dụng như là chất nội chuẩn để đánh giá chất lượng sản phẩm cDNA và làm thước đo chuẩn cho nồng độ cDNA sẽ được dùng trong phản ứng PCR để khuếch đại gen mã hóa HIP. Chu trình nhiệt độ của phản ứng PCR như sau: 94 0 C trong 5 phút; 94 0 C trong 30 giây; 55 0 C trong 20 giây; 72 0 C trong 20 giây; 72 0 C trong 5 phút và với 35 chu kỳ. Sản phẩm sau phản ứng PCR được điện di trên gel agrose 1,5%, sử dụng Hae III làm marker chuẩn. Nồng độ cDNA cho phản ứng khuếch đại gen mã hóa HIP sẽ được ước định đảm bảo cho nồng độ gen GAPDH trong mỗi mẫu thử tương đương nhau dựa vào đậm độ của vạch điện di GAPDH của mỗi mẫu thử. Mồi HIP được thiết kế có trình tự như sau: Mồi xuôi: 5' GCT TAT GGT GCA GAC ATG G 3', và mồi ngược: 5' CGA AGT CTC ATC TAT AGA GAC 5'. Với cặp mồi này đoạn gen của HIP với chiều dài 420 bp sẽ được khuếch đại. Nhiệt độ gắn mồi (Tm) của HIP được xác định trong khoảng 58 0 C - 60 0 C và chu kỳ (35 chu kỳ) nhiệt của phản ứng PCR là: 94 0 C trong 5 phút; 94 0 C trong 30 giây; 58 0 C trong 20 giây; 72 0 C trong 20 giây; 72 0 C trong 5 phút; và 4 0 C để bảo quản tạm thời. Sản phẩm phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1,5 sử dụng Hae III làm macker chuẩn. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng Bệnh nhân được thăm khám lâm sàng xác định kích thước khối u, tính chất khối u, sau đó được chỉ định làm xét nghiệm thông thường về hoá sinh máu và nước tiểu nhằm phát hiện các bệnh phối hợp khác. Các kết quả xét nghiệm máu và nước tiểu đều bình thường cho thấy những bệnh nhân trong nghiên cứu này không mắc những bệnh lý khác. Trong khi đó kết quả chẩn đ oán giải phẫu bệnh cho thấy trong số 3 trường hợp có 1 trường hợp ung thư biểu mô tuyến và hai trường hợp ung thư biểu mô ống (hình 1). Hình ảnh XQ khẳng định cả ba trường hợp ung thư đều ở giai đoạn 3 với các dấu hiệu xâm lấn mô xung quanh (chưa xâm lấn da) kèm theo hiện tượng vôi hóa (hình 2). (A) (B) Hình 1. Hình ảnh tế bào học của ung thư vú. Ung thư biểu mô thể ống xâm nhập (A) và ung thư biểu mô tuyến di căn hạch (B), hình ảnh phóng đại 100 lần. (A) (B) Hình 2. Hình ảnh XQ của ung thư vú. Khối u có đường kính lớn hơn 5 cm, ranh giới không rõ ràng, xâm lấn các tổ chức xung quanh kèm theo vôi hoá ác tính (A và B). 7 TCNCYH 38 (5) - 2005 2. Đánh giá sản phẩm quá trình sao chép (mRNA) của HIP ở mô ung thư vú Gen mã hóa GAPDH được khuếch đại và được sử dụng như là chất nội chuẩn để đánh giá chất lượng sản phẩm cDNA và làm căn cứ để tính nồng độ cDNA sẽ được dùng trong phản ứng PCR để khuếch đại gen mã hóa HIP. Trọng lượng phân tử của sản phẩm khuếch đại GAPDH khoảng 350 bp cho thấy việc tách chiế t RNA tổng số từ mô ung thư vú và kỹ thuật RT - PCR thành công cho kết quả tốt đảm bảo tiêu chuẩn cho phản ứng khuếch đại gen mã hóa HIP ở phản ứng tiếp theo (hình3). Hình 3. Kết quả PCR khuếch đại gen mã hóa GAPDH. Gen mã hóa GAPDH được sử dụng như một gen nội chuẩn. Kết quả cho thấy sản phẩm cDNA ốt, đảm bảo cho phản ứng khuếch đại gen mã hóa HIP. 1, mẫu bệnh phẩm u xơ vú; 2 - 4 mẫu bệnh phẩm ung thư; và 5, nước cất. t , Nồng độ cDNA trong phản ứng khuếch đại gen mã hóa HIP sẽ được ước định đảm bảo cDNA mã hóa GAPDH trong mỗi mẫu thử phải tương đương nhau. Kết quả cho thấy mRNA của HIP được tăng cường sao chép (giếng 1 - 6) ở mô ung thư vú trong khi không phát hiện được ở mẫu bệnh phẩm u xơ (giếng 7 và 8), (hình 4). Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi HIP T, nước cất; M, marker chuẩn; 1 và 2; 3 và 4; 5 và 6 là mẫu ung thư vú với nồng độ cDNA: 1 và 1,5µl. 7 và 8 là mẫu cDNA của mô u xơ cũng ở hai nồng độ 1 và 1,5µl. Mũi tên chỉ là gen HIP. IV. BÀN LUẬN Ung thư vú phát sinh từ các tế bào biểu mô của các ống tuyến vú (sinh sữa và dẫn sữa) là chủ yếu. Ung thư vú liên quan chặt chẽ với các tuyến nội tiết nên được gọi là bệnh phụ thuộc nội tiết. Nguyên nhân chính gây ra ung thư vú hiện nay chưa được khẳng định. Để chẩn đoán và phát hiện ung thư vú nhiều phương pháp và các kỹ thuật đã và đang áp dụng trong đó phải k ể đến: thăm khám lâm sàng, chẩn đoán mô bệnh học, chẩn đoán hình ảnh và chẩn đoán hoá sinh. Ngày nay các kỹ thuật chẩn đoán gen đang được nghiên cứu áp dụng trong ung thư. Các kỹ thuật chẩn đoán gen không chỉ giới hạn ở việc xác định sự có mặt các gen gây ung thư mà còn xác định sự biến đổi bất thường của quá trình sao chép các gen đích cụ thể. Chính sự thay đổi bất thường này là bi ểu hiện rối loạn sớm nhất của quá trình bệnh lý học ung thư trước khi thể hiện ra ở mức độ tế bào để có thể chẩn đoán được bằng các kỹ thuật tế bào học. Chính vì vậy, các kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân tử có tác dụng phát hiện sớm, chính xác bệnh lý ung thư để có thể áp dụng những biện pháp điều trị can thiệ p sớm nhất và hiệu quả. Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy HIP là một protein màng gắn đặc hiệu với HS thông qua đó tham gia điều hòa các quá trình lưu giữ, giải phóng các protease và yếu tố phát triển tế bào. HIP chỉ được tổng hợp ở các dòng tế bào nội mạc biểu mô mà không phát hiện thấy ở các dòng tế bào sợi và tổ chức liên kết. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng 3 mẫu mô ung th ư vú ở giai đoạn 3 và 1 mẫu u xơ để đối chứng. Kết quả xét nghiệm hóa sinh máu và nước tiểu giúp loại trừ một số trường hợp bệnh lý khác. RNA tổng số được tách chiết từ các mẫu mô tươi theo một quy trình chuẩn và sau đó sử dụng để tổng hợp cDNA. Kết quả PCR sử dụng mồi GAPDH đã khuếch đại thành công đoạn gen mã hoá GAPDH có chiều dài 350 bp cho thấ y sản phẩm cDNA thu được tốt và có thể sử dụng để đánh giá mức độ sao chép của HIP. Trong phản ứng khuếch đại gen mã hóa HIP, lượng cDNA được ước định sao cho gen mã hóa 8 TCNCYH 38 (5) - 2005 GAPDH phải được tương đương nhau đối với tất cả các mẫu ung thư và u xơ. Sử dụng mồi HIP do nhóm chúng tôi thiết kế, gen mã hóa HIP đã được khuếch đại thành công và đặc hiệu. Kết quả cho thấy mRNA của HIP được tăng cường tổng hợp ở cả 3 mẫu mô ung thư vú trong khi không phát hiện được ở mô u xơ. Kết quả này tương ứng với các kết quả th ăm khám lâm sàng và cận lâm sàng. Hình ảnh XQ khẳng định đây là các trường hợp ung thư ác tính, ranh giới không rõ, có biểu hiện xâm lấn và vôi hóa. Kết quả chẩn đoán tế bào học cho thấy đây là các trường hợp ung thư biểu mô tuyến và biểu mô thể ống. Phát hiện này phù hợp với các kết quả nghiên cứu của tác giả nước ngoài trong đó mức độ sao chép mRNA của HIP phụ thuộc vào từng dòng tế bào và mứ c độ ác tính của chúng. Kết quả nghiên cứu bước đầu này cho phép chúng tôi đi sâu hơn nữa nhằm khẳng định mRNA của HIP đặc hiệu với mô ung thư vú và mức độ sao chép phụ thuộc vào từng giai đoạn phát triển của khối u. Hướng nghiên cứu này có ý nghĩa thực tiễn vô cùng quan trọng bởi hai lý do: (1) Phát triển phương pháp chẩn đoán sớm ung thư vú nhờ kỹ thuật sinh học phân tử; (2) T ạo kháng thể kháng HIP nhằm ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch hàng loạt (Tissue Array) để chẩn đoán sàng lọc nhanh, hàng loạt cho các mô sinh thiết vú góp phần chẩn đoán sớm ung thư bởi lẽ sự thay đổi về gen và protein bao giờ cũng là sự thay đổi sớm nhất trước khi xuất hiện sự thay đổi hình thái tế bào. V. KẾT LUẬN Những kết quả thu được từ nghiên cứu cho chúng tôi rút ra kết luận: 1. Tách chiết RNA tổng số từ mô ung thư vú và tổng hợp thành công cDNA. 2. Thiết kế thành công mồi HIP, sử dụng mồi HIP để xác định mức độ sao chép ở mô ung thư vú. 3. Kết quả thu được cho thấy mRNA của HIP được tăng cường sao chép trong mô ung thư vú và tương ứng với các kết quả XQ và tế bào học. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tạ Thành Văn (1998). Heparin: Sự tương tác với Protein. Tạp chí nghiên cứu Y học 6, 69 - 72. 2. Tạ Thành Văn (2004). Phân lập và nghiên cứu sự đáp ứng của dòng tế bào sợi từ mô lợi phì đại với bFGF và heparin. Y học Việt Nam 299, 38 - 43. 3. Tạ Thành Văn và M.C. Farach- Carson (2004). Tổng hợp và nghiên cứu tác dụng của protein tái tổ hợp (rHIP) trên sự phát triển dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại. Tạp chí nghiên cứ u Y học 6, 55 - 60. 4. De Nigris, F., Visconti, R., Fusco, A., et al. (1998). Overexpression of the HIP gene coding for a heparin/heparan sulfate - binding protein in human thyroid carcinomas. Cancer Res. 58, 4745 - 4751. 5. Jacobs, A. L., Julian, J. A., Sahin, A. A., and Carson, D. D. (1997). Heparin/Heparansulfate interacting protein expression and functions in human breast cancer cells and normal breast epithelia. Cancer research 57, 5148 - 5154. 6. Liu. S., Smith, E. Scott; Julian, J.; Rohde, H.L; Karin, J. Norman., and Carson, D. D. (1996). cDNA Cloning and expression of HIP, a novel cell surface heparan sulfate/heparin - binding protein of human uterine Epithelial cells and cell lines. Journal of biological chemistry. 271, 11817 - 11823. 7 Van-Thanh, T., Carson, D.D., Farach - Carson, M.C. et al. (2002). Heparansulfate interacting protein (HIP/L29) negatively regulates growth responses to basic fibroblast growth factor in gingival fibroblasts. Journal of Dental Research 81, 247 - 252. 8. Wang, Y., Cheong, D., Chan, S., Chuan Hooi, S. (1997). Heparin/heparan sulfate interacting protein gene expression is up - regulated in human colorectal carcinoma and correlated with differentiation status and metastasis. Cancer Res. 59, 2989 - 2994. Summary 9 TCNCYH 38 (5) - 2005 HEPARANSULFAT INTERACTING PROTEIN (HIP) TRANSCRIPT IN BREAST CANCER TISSUES Heparan sulfate interacting protein (HIP/L29) was first identified from a human uterine adenocarcinoma cell line. HIP is expressed at different levels in a variety of human cell line and normal tissues. In addition, HIP was found to be up expressed in some cancer cell lines including thyroid, breast cancer cell lines and HIP expression was tightly depended on malignant level of each cancer cell types and colon cancer cell line and tissues. Objectives: To evaluate HIP transcript in breast cancer tissue. Methods: total RNA extraction and RT - PCR for HIP mRNA determination. Results: HIP transcript was up regulated in breast cancer tissue and correlated with clinical data. Conclusion: HIP transcript was up regulated in breast cancer tissue. This finding provides preliminary data to develop a new technique for fast screening of breast cancer as new method for early cancer diagnosis. Keywords: HIP/L29; breast cancer; transcript 10 . TCNCYH 38 (5) - 2005 SỰ SAO CHÉP HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN (HIP) Ở MÔ UNG THƯ VÚ Phan Tôn Hoàng 1 , Tạ Thành Văn 2 1 . hóa HIP và sự sao chép mRNA của HIP được tăng cường trong mô ung thư vú. Từ khóa: HIP/L29; ung thư vú; RNA thông tin. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Các protein gắn