Đánh giá mức độ sao chép mRNA và khả năng biểu hiện protein HIP ở mô ung thư vú

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 47-54 Đánh giá mức độ chép mRNA khả biểu protein HIP mô ung thư vú Đặng Thị Tuyết Minh1, Lê Thị Phượng2,* Trường Cao đẳng Y tế Hà Đông Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương Nhận ngày 15 tháng năm 2014 Chỉnh sửa ngày 28 tháng năm 2014; Chấp nhận đăng ngày 14 tháng năm 2014 Tóm tắt: Nhiều nghiên cứu khoa học khẳng định tăng cường tổng hợp HIP biểu mức độ RNA protein Đặc biệt tăng cường tổng hợp liên quan chặt chẽ tới giai đoạn phát triển, tình trạng biệt hố mức độ ác tính dòng tế bào Để đánh giá mức độ chép mRNA biểu protein HIP theo giai đoạn phát triển thể tế bào học khác mô ung thư vú, tách chiết RNA tống số từ 62 mẫu mô (47 mẫu ung thư 15 mấu mô u xơ vú); tổng hợp cDNA kỹ thuật chép ngược (reverse transcript-polymerase chain reaction/RT-PCR); sau đó, đánh giá mức độ chép mRNA biểu protein HIP kỹ thuật RT-PCR bán định lượng kỹ thuật Western blot Kết cho thấy, mức độ biểu mRNA protein HIP khác biệt cách rõ rệt mô ung thư u xơ vú, đặc biệt khác phụ thuộc vào giai đoạn phát triển thể loại tế bào học khác ung thư Từ khóa: Biểu hiện, HIP/L29, chép, RT-PCR, ung thư vú Mở đầu∗ ung thư vú, bao gồm loại ung thư: 178.480 ca ung vú xâm lấn (invasive breast cancer) 60.030 ca ung thư không lan tỏa (in situ), ước đoán khoảng 40.460 bệnh nhân chết Ở Việt Nam, theo ghi nhận bệnh viện K năm 2010, tỷ lệ mắc ung thư vú 30/100000 phụ nữ Hà Nội thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ 20/100000 [1] Bệnh này, phát sớm điều trị kịp thời, phương pháp kéo dài thời gian hồn tồn khỏi bệnh tiết kiệm chi phí điều trị nhiều Ung thư vú xuất phát triển ác tính tế bào biểu mơ lót bên lịng ống tiểu thùy tuyến vú Đây loại ung thư đứng hàng đầu phụ nữ độ tuổi 4060, nhiên năm gần bệnh xuất phụ nữ trẻ độ tuổi 20-30 với tần số tăng dần Theo thống kê Tổ chức Ung thư Mỹ (Society, 2008), tỷ lệ mắc 92,04/100000 dân châu Âu 67,48/100000 dân toàn giới Năm 2007, Mỹ có khoảng 238.510 phụ nữ chẩn đoán Heparan sulfate interacting protein (HIP) protein màng tế bào có khả gắn đặc hiệu chọn lọc với heparin/heparan sulfate, thơng qua tham gia vào trình tương tác tế bàotế bào [2, 3] Quá trình đóng vai trị quan _ ∗ Tác giả liên hệ ĐT: 84-982181195 E-mail: phuongsinh@ymail.com 47 48 Đ.T.T Minh, L.T Phượng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 47-54 trọng phát triển, biệt hoá di chuyển tế bào HIP tổng hợp nhiều dịng tế bào biểu mơ, nội mạc, khơng phát dòng tế bào sợi tổ chức liên kết Nhiều nghiên cứu rằng, HIP tăng cường tổng hợp dòng tế bào mô ung thư mức độ mRNA protein [2, 4-7] Trong nghiên cứu tiến hành đánh giá mức độ chép mRNA biểu hiện bán định lượng mẫu cDNA nhóm thể tế bào học (thể tuỷ thể tiểu thùy, thể ống thể nhầy) giai đoạn II (hình 3) Thể tủy HIP 504 bp Thể tiểu thùy Thể ống 10 11 12 Thể nhày 13 14 15 16 M GAPDH 504 bp Để đánh giá biểu HIP theo giai đoạn khác nhau, tiến hành đo đậm độ vạch HIP theo giai đoạn I, II, II UTV thể ống sử dụng phần mềm chuyên dụng chemidoc iQ 76S00503, mức độ chép HIP giai đoạn vẽ đồ thị Kết hình cho thấy, giá trị đậm độ vạch tăng dần theo giai đoạn ung thư Điều gợi ý rằng, HIP tăng cường chép mẫu ung thư so vỡi mẫu lành tính phụ thuộc vào giai đoạn phát triển ung thư Chúng tiến hành đo đậm độ vạch HIP theo thể tế bào học UTV giai đoạn II sử dụng phần mềm chuyên dụng, mức độ chép HIP thể tế bào học thể hình 300 Đậm độ vạch HIP Hình Kết phản ứng RT- PCR gen HIP GAPDH mơ u vú lành tính mơ ung thư: 1-7: Sản phẩm khuếch đại từ cDNA mơ u vú lành tính; 8-14: mơ ung thư; MK: thang chuẩn DNA 100 bp Hình Kết phản ứng RT-PCR gen HIP GAPDH thể loại tế bào ung thư vú khác nhau: Thể tủy (1-3); thể tiểu thuỳ (4-8); thể ống ( 9-13) thể nhày (14-16); MK : Thang DNA chuẩn 100 bp 250 200 150 100 50 ThĨ tủ ThĨ tiĨu th ThĨ èng ThĨ nhμy Hình So sánh chép HIP thể tế bào học khác giai đoạn Đ.T.T Minh, L.T Phượng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 47-54 Kết hình cho thấy, có khác biệt mức độ chép HIP thể tế bào ung thư khác giai đoạn II HIP tăng cuờng chép cao thể nhày thấp thể tuỷ Bảng Các giai đoạn khác thể tế bào học mô u lành mô ung thư Thể tủy Thể tiểu thùy Thể nhày II II II Tổng 47 Ký hiệu mẫu 1- 7- 22 23 36 37- 39 40 44 45 47 47 Tổng số n % 36 77 10 Để đánh giá mức độ biểu protein HIP mô u xơ so với mô ung thư theo giai đoạn thể loại tế bào học khác ung thư vú giai đoạn, sử dụng kỹ thuật Western blot Sử dụng quy trình kỹ thuật mơ tả phần phương pháp, thu vạch protein HIP đặc hiệu có trọng lượng phân tử 24 kDal Chúng tiếp tục sử dụng phương pháp Western blot để đánh giá biểu protein HIP theo giai đoạn khác (giai đoạn I, II, III) theo thể tế bào học khác (thể tủy, thể tiểu thùy, thể ống, thể nhày) giai đoạn II Vạch HIP đặc hiệu tương ứng với 24 kDal phát hình hình M 10 11 47 100 Đánh giá mức độ biểu protein HIP mô u xơ so với mô ung thư theo giai đoạn thể tế bào học khác Quan sát kết hình cho thấy, vạch protein HIP đậm nét mô ung thư vú, mờ nhiều mô u xơ Điều cho phép chúng tơi đưa nhận định ban đầu rằng: protein HIP tăng cường tổng hợp mơ ung thư vú M Hình Hình ảnh Western blot đánh giá mức độ biểu protein HIP mô ung thư mô u xơ vú M: Marker; 1-3: u xơ; 4-9: mẫu ung thư Hình Hình ảnh kết Western blot đánh giá mức độ biểu protein HIP mô ung thư thể ống theo giai đoạn M: Marker; 1-3: mẫu K giai đoạn 3; 4-6: mẫu K giai đoạn 2; 7-8: mẫu K giai đoạn 1; 9-11: mẫu lành Đậm độ vạch protein HIP theo giai đoạn thể tế bào học khác đo phần mềm chuyên dụng tính giá trị trung bình cộng vẽ đồ thị Đậm độ vạch Protein HIP STT Phân loại Giai đoạn Số mô bệnh lượng học I Thể ống II 16 xâm nhập III 14 51 0.2 0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 U xơ GĐ I GĐ II GĐ III Hình So sánh biểu HIP mô lành tính mơ ung thư thể ống giai đoạn khác 52 Đ.T.T Minh, L.T Phượng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 30, Số (2014) 47-54 Kết hình cho thấy, mức độ biểu protein HIP khơng có khác biệt u xơ ung thư mà tăng dần theo giai đoạn ung thư Tuy nhiên, khác biệt chưa thực rõ ràng 10 11 M Hình Hình ảnh Western blot đánh giá mức độ biểu protein HIP thể tế bào ung thư vú khác giai đoạn II M: Marker protein; 1-2: thể ống; 3-5: thể tuỷ; 6-8: thể tiểu thuỳ; 9-11: thể nhày Đậm độ vạch protein HIP Kết hình cho thấy, vạch protein HIP khác theo thể tế bào học ung thư vú Vạch protein rõ UTV thể nhày thấp thể tuỷ 0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 U x¬ ThĨ tủ ThĨ tiĨu th ThĨ èng ThĨ nhμy Hình So sánh biểu HIP theo thể tế bào học khác giai đoạn Quan sát hình cho thấy, có khác biệt biểu protein HIP thể tế bào học khác tăng cường biểu protein HIP thể ống thể nhày cao nhiều so với thể tuỷ thể tiểu thuỳ Thảo luận Ung thư vú loại ung thư hay gặp có xu hướng ngày gia tăng phụ nữ nước ta Bệnh phát sinh chủ yếu từ tế bào biểu mô ống tuyến vú Việc điều trị ung thư gây tốn kinh tế cho bệnh nhân, cho xã hội mã làm ảnh hưởng tới chất lượng sống người phụ nữ UTV phát sớm điều trị kịp thời tỷ lệ sống thường cao Để chẩn đoán ung thư vú nhiều phương pháp áp dụng khám lâm sàng, chẩn đốn hình ảnh, hố sinh mơ bệnh học Các phương pháp nhiều thể hạn chế việc phát chẩn đoán ung thư giai đoạn sớm Việc nghiên cứu ứng dụng phương pháp sinh học phân tử để chẩn đoán sớm ung thư vú cần thiết Trong nghiên cứu với việc sử dụng kỹ thuât RT- PCR bán định lượng kỹ thuật western blot nhận thấy mức độ chép mRNA biểu protein HIP khác biệt cách rõ rệt mô ung thư mô u xơ Phân loại theo thể tế bào học khác ung thư vú cho thấy HIP chép biểu cao mô ung thư thể nhày, thấp thể ống, thể tiểu thùy thấp thể tủy Các mẫu mô ung thư giai đoạn khác chép biểu HIP mức độ khác Như vậy, HIP tăng cường tổng hợp mơ ung thư vú đặc biệt dịng ung thư biểu mơ thể ống có độ di ác tính cao Kết chúng tơi phù hợp với kết nghiên cứu trước Các tác giả phát mức độ mRNA protein, HIP tăng cường chép tổng hợp dòng tế bào ung thư biểu mơ tuyến biểu mơ thể ống Cịn dịng tế bào sợi mô lành, đặc biệt mô u xơ, nơi mà dòng tế bào sợi chiếm ưu thế, HIP tổng hợp mức độ thấp không phát [5-7] Một câu hỏi đặt ra: Cơ chế phân tử tượng gì? Những nghiên cứu Carson DD cộng phát rằng: chuột bị phá hủy gen HIP (HIP-/-) có tượng suy nhược Đ.T.T Minh, L.T Phượng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 47-54 toàn thân, thể trọng thấp, suy dinh dưỡng, toàn quan thể nhỏ, chuyển hóa thấp Điều chứng tỏ HIP thành phần quan trọng nhóm protein gắn với ribosom (ribosomal protein L29) có vai trị quan trọng điều hịa q trình phiên mã, tạo phức hợp ribosom hoàn chỉnh Khi HIP bị giảm tổng hợp bị loại bỏ hồn tồn ảnh hưởng trầm trọng đến trình phiên mã hậu tạo cho cá thể có kiểu gen HIP-/- có mức độ sinh tổng hợp protein tất tế bào quan bị giảm nghiêm trọng Kết chẩn đoán kỹ thuật gen tương ứng với kết thăm khám lâm sàng cận lâm sàng (mô bệnh học) Đặc biệt nghiên cứu này, chứng chép biểu protein HIP phụ thuộc vào thể tế bào học giai đoạn tiến triển ung thư vú nghiên cứu Đây sở khoa học có ý nghĩa cho nghiên cứu nhằm ứng dụng HIP marker có giá trị để góp phần chẩn đốn sớm ung thư vú, loại hình ung thư phổ biến mà việc phát sớm can thiệp sớm đóng vai trị vơ quan trọng điều trị tiên lượng bệnh Những kết nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ chế phân tử vai trò HIP ung thư mở triển vọng ứng dụng HIP không marker ung thư mà cịn là đích đầy hứa hẹn cho liệu pháp phân tử trị liệu cho số loại hình ung thư có ung thư tuyến vú mà việc ngăn chặn q trình hoạt hóa HIP khâu then chốt 53 Kết luận Từ kết nghiên cứu cho phép rút số kết luận: Mức độ biểu protein HIP khác biệt cách rõ rệt mô ung thư u xơ vú Mức độ biểu protein HIP phụ thuộc vào giai đoạn thể loại tế bào học khác ung thư vú Sự tăng cường biểu HIP tương đồng với mức độ chép mRNA Tài liệu tham khảo [1] Nguyễn Chấn Hùng, 2004 Ung thư học Nội khoa Nxb Y học Hồ Chí Minh [2] WHO Fact sheet NO 297 February 2006 [3] Liu S., Smith E Sott, Julian J., Rohde H L, Karin J Norman., Carson D D., 1996 cDNA Cloning and expression of HIP, a novel cell surface heparan sulfate/heparin-binding protein of human uterine Epithelial cells and cell lines Journal of Biological Chemistry, 271: 1181711823 [4] Jacobs A L., Julian J A., Sahin A A., Carson D D., 1997 Heparin/Heparan sulfate interacting protein expression and functions in human breast cancer cells and normal breast epithelia Cancer Research, 57: 5148-5154 [5] Liu S., Hoke D., Julian J., Carson D D., 1997 Heparin/Heparasulfate (HP/HS) Interacting protein suports cell attachment and selective, high affinity binding of (HP/HS) Journal of Biological Chemistry, 272: 25856 - 25862 [6] Nguyễn Thị Phương Ngọc, Trần Vân Khánh, Đào Kim Chi, Phạm thị Lý, Tạ Thành Văn, 2006 Tăng cường tổng hợp Heparansunfate interacting protein (HIP) mô ung thư tuyến tiền liệt, Tạp chí Dược học, 11A/2006 (số 367 năm 46): 127-132 [7] Phan thị Minh Phương, Trần Vân Khánh, Nguyễn thị Băng sương, Phạm thị Thu Vân, Trần thị Chính, Tạ Thành Văn, 2007 Tăng cường chép Heparansunfate interacting protein (HIP) mô ung thư tuyến giáp, Tạp chí Y học Việt Nam, 5: 25-29 54 Đ.T.T Minh, L.T Phượng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 47-54 Assessment of Copy Level of mRNA and Protein HIP Expression in Human Breast Cancer Tissues Đặng Thị Tuyết Minh1, Lê Thị Phượng2 Ha Dong Medical College Hai Duong Medical Technical University Abstract: Many scientific studies have confirmed that the synthetic enhancement of HIP is expressed at both level of the RNA and protein Especially, this synthetic enhancement is also closely related to the developmental stages, special condition and the level of individual malignant cell lines To assess the copy level of mRNA and HIP protein expression according to the developmental stages and different cells of breast cancer tissue, totally 62 tisue samples were RNA extracted (47 cancer samples and 15 tissue samples of breast fibroids); we accompanied cDNA by the reverse transcript technique (reverse transcript-polymerase chain reaction / RT-PCR), and then asessed the copy level of mRNA and HIP protein expression by techniques of semi-quantitative RT-PCR and Western blot The results showed that the expression levels of mRNA and protein HIP were obviously different between the fibroid tissue and breast cancer, particularly this difference depends on the developmental stages and other cytological categories of cancers Keywords: Expression; HIP/L29; Copy, RT-PCR; Breast Cancer  ... Western blot đánh giá mức độ biểu protein HIP mô ung thư mô u xơ vú M: Marker; 1-3: u xơ; 4-9: mẫu ung thư Hình Hình ảnh kết Western blot đánh giá mức độ biểu protein HIP mô ung thư thể ống theo giai... bào học khác ung thư vú cho thấy HIP chép biểu cao mô ung thư thể nhày, thấp thể ống, thể tiểu thùy thấp thể tủy Các mẫu mô ung thư giai đoạn khác chép biểu HIP mức độ khác Như vậy, HIP tăng cường... hoạt hóa HIP khâu then chốt 53 Kết luận Từ kết nghiên cứu cho phép rút số kết luận: Mức độ biểu protein HIP khác biệt cách rõ rệt mô ung thư u xơ vú Mức độ biểu protein HIP phụ thuộc vào giai