Nghiên cứu khả năng kháng phân bào thực nghiệm của một số bài thuốc cổ truyền hoặc dân gian ở mức độ tế bào và phân tử bài báo

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ IN VITRO CỦA MỘT SỐ BÀI THUỐC CỔ TRUYỀN Nguyễn Thụy Vy(1), Nguyễn Thái Hoàng Tâm(1), Trần Ngọc Khả Vy(1), Vũ Thị Thu Thủy(1), Nguyễn Thị Bay(2), Hồ Huỳnh Thùy Dương(1) (1) Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, Bộ môn Di truyền, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, ĐHQG TP.HCM (2) Khoa Y học Cổ truyền, Đại học Y Dược TP.HCM MỞ ĐẦU Việt Nam có y dược học cổ truyền lâu đời với nhiều danh y tiếng Chu Văn An, Tuệ Tĩnh, Hải Thượng Lãn Ông,… Theo đánh giá WHO, giống Trung Quốc, Hàn Quốc Triều Tiên, y học cổ truyền (YHCT) thực phần hệ thống Y tế Việt Nam, với khoảng 30% bệnh nhân điều trị YHCT [10] Các thuốc cổ truyền nhiều nhóm nghiên cứu giới quan tâm nghiên cứu công cụ đại Kết thu nhận cho thấy nhiều thuốc thuốc cổ truyền đánh giá cách khoa học, thuyết phục kho tàng tự nhiên cần khai thác cho trị liệu dạng ung thư [2, 4, 5, 8, 9] Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều cơng trình cơng bố chế hoạt động thuốc cổ truyền dân gian có nhiều thuốc truyền miệng, sử dụng rộng rãi Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành đánh giá độc tính tế bào dịch chiết nước từ thuốc cổ truyền, Song sâm địa thược thang (Codonopsis spp., Rehmannia glutinosa, Scrophularia buergeriana, Hedyotis diffusa, Scutellaria barbata), Nhị trần thang gia vị (Typhonium trilobatum, Poria cocos, Glycyrrhiza spp., Scutellaria barbata), Hoàng liên giải độc thang (Coptis chinensis, Phellodendron chinense, Scutellaria baicalensis, Paeonia lactiflora, Gardenia jasminoides), Tiêu tích nhuyễn kiên phương (Hedyotis diffusa, Scutellaria barbata, Paeonia lactiflora, Ostrea gigas) dòng tế bào ung thư người gồm ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF-7 ung thư phổi NCI-H460 Từ khóa: thuốc cổ truyền, gây độc tế bào, Hoàng liên giải độc thang NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu: Các thành phần dược liệu thuốc Khoa Y học Cổ truyền, Đại học Y dược TP.HCM cung cấp (bảng 1) Bảng Thành phần thuốc cổ truyền nghiên cứu Bài thuốc Thành phần Song sâm địa thược thang Codonopsis pilosula (15g), Rehmannia glutinosa (30g), Scrophularia bucrgeriana (30g), Hedyotis diffusa (30g), Scutellaria barbata (30g) (BT1) Nhị trần thang gia vị (BT2) Cirus reticulata (20g), Typhonium trilobatum (30g), Poria cocos (30g), Glycyrrhiza spp (10g), Scutellaria barbata (30g) Hoàng liên giải độc thang Coptis chinensis (30g), Phellodendron chinense (30g), Scutellaria baicalensis (30g), Paeonia lactiflora (20g), Gardenia jasminoides (20g) (BT3) Tiêu tích nhuyễn kiên phương (BT4) Hedyotis diffusae (30g), Scutellaria barbata (30g), Palonia lactiflora (30g), Ostrea gigas (30g) Hóa chất: Các hóa chất sử dụng nuôi cấy tế bào động vật bao gồm môi trường Eagle’s minimum essential medium (E’MEM), L-glutamine, HEPES, amphotericin B, penicillin G, streptomycin, sulforhodamine B (SRB) (Sigma), huyết bào thai bị (FBS) (Gibco), dụng cụ dùng ni cấy tế bào (Nunc) Chuẩn bị dịch chiết nước: Dược liệu cân theo tỷ lệ khối lượng thuốc cắt nhỏ, trộn đều, ngâm với nước cất lần phút chắt toàn nước Thêm lượng nước vào  dược liệu cho nước ngập qua mặt dược liệu khoảng 2-3 cm Đun dược liệu đến sôi để nhiệt độ 700 80 C liên tục 90 phút Sau đó, dịch chiết chắt Tiếp tục thêm lượng nước vào dược liệu, đun đến sôi để nhiệt độ 70-800C liên tục 90 phút, chắt lấy dịch chiết Cô cách thủy dịch chiết lần nhiệt độ 70-800C đến đạt dịch chiết 1:1 (1 g dược liệu/ml dịch chiết) Dịch chiết sau ly tâm 4000g 15 phút để loại cặn, lọc qua màng lọc 0,2 micron sử dụng ngày Nuôi cấy tế bào: Các dòng tế bào ung thư sử dụng đề tài Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ (NCI – Frederick, MD, USA) cung cấp Tế bào ni mơi trường E’MEM có bổ sung L-glutamine (2 mM), HEPES (20 mM), amphotericin B (0,025 µg/ml), penicillin G (100 UI/ml), streptomycin (100 µg/ml), 10% (v/v) FBS ủ 370C, 5% CO2 Thử nghiệm SRB xác định độc tính tế bào: Tế bào ni đĩa 96 giếng mật độ ban đầu 104 tế bào/giếng dòng HeLa, MCF-7 7,5.10 tế bào/giếng dòng NCI-H460 Sau ủ 24 giờ, tế bào xử lý với dịch chiết nồng độ khác 48 với giếng chứng giếng có tế bào khơng xử lý Sau đó, tế bào cố định Trichloro acetic acid 50% 40C, giếng rửa với nước lần Tế bào nhuộm với SRB 0,2% (trong acetic acid) 20 phút nhiệt độ phòng, giếng rửa với acetic acid 1% lần Lượng SRB lại giếng hòa tan dung dịch Tris-base 10 mM mật độ quang giếng đo máy đọc đĩa (Synergy HT, Biotek) bước sóng 492 620 nm Tỉ lệ ức chế tăng trưởng tính theo cơng thức: (OD giếng chứng – OD giếng có dịch chiết)/OD giếng chứng Tất thí nghiệm lặp lại ba lần [7] KẾT QUẢ - THẢO LUẬN Đầu tiên, để đánh giá khả gây độc tế bào ung thư thuốc, tiến hành thử nghiệm SRB với dịch chiết thu nồng độ 10% (v/v) (tương đương với nồng độ thuốc hòa tan thể [1]) dòng tế bào ung thư HeLa, MCF-7 NCI-H460 Sau 48 ủ, thuốc ức chế mạnh tăng trưởng dòng tế bào ung thư HeLa, MCF-7 NCI-H460 với tỉ lệ (%) thể bảng Bảng Tỉ lệ (%) ức chế tăng trưởng thuốc nồng độ 10% (v/v) dòng tế bào ung thư BT1 BT2 BT3 BT4 HeLa 79,9  0,8 83,0  0,5 78,6  1,0 82,6  3,1 NCI-H460 82,1  1,3 73,9  1,5 79,3  1,6 86,9  0,6 MCF-7 85,1 0,7 89,0  0,5 88,3  0,7 88,2 1,9 BT1 A BT2 BT3 B BT4 BT1 BT2 BT3 BT4 100 Tỉ lệ (% ) ức chế tăng trưởng Tỉ lệ (%) ức chế tăng trưởng 100 80 60 40 20 80 60 40 20 0 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 0.0 10.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 Nồng độ (% v/v) dịch chiết Nồng độ (% v/v) dịch chiết BT1 BT2 BT3 BT4 100 Tỉ lệ (%) ức chế tăng trưởng C 80 60 40 20 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 -20 Nồng độ (% v/v) dịch chiết Hình Tác động ức chế tăng trưởng thuốc dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa (A), ung thư phổi NCI-H460 (B) ung thư vú MCF-7 (C) sau 48  Chúng tiếp tục khảo sát tăng trưởng dòng tế bào ung thư sau 48 tác động dịch chiết nồng độ khác để xác định giá trị IC50 Kết cho thấy dịch chiết ức chế tăng sinh tế bào ung thư theo nồng độ (hình 1) Trong đó, dịch chiết nước BT3 (Hồng liên giải độc thang) có hoạt tính mạnh với IC50 thấp từ 2-6 lần so với IC50 dịch chiết lại (bảng 3) Bài thuốc Hoàng liên giải độc thang số cơng trình nghiên cứu gần chứng minh có khả ức chế tăng sinh dịng tế bào ung thư gan Hep-G2 ung thư tủy U266 thơng qua cảm ứng q trình chết theo chương trình (apoptosis) [3, 6] Bảng Giá trị IC50 (% v/v) dịch chiết nước thuốc dòng tế bào ung thư BT1 BT2 BT3 BT4 HeLa 3,01  0,10 4,38  0,29 1,47  0,02 3,06  0,26 NCI-H460 3,74  0,26 6,80  0,31 1,39  0,09 4,49  0,22 MCF-7 1,43  0,02 2,77  0,13 0,36  0,01 0,93  0,01 Ngoài ra, kết bảng cho thấy dòng tế bào MCF-7 thể đáp ứng với dịch chiết nhạy so với dòng tế bào lại với IC50 tất dịch chiết dòng tế bào thấp từ 2-4 lần so với IC50 dòng tế bào lại Các thí nghiệm thực nhằm tìm hiểu chế kháng ung thư thuốc Hoàng liên giải độc thang đáp ứng tế bào MCF-7 KẾT LUẬN Những kết bước đầu chứng minh khả kháng ung thư in vitro thuốc cổ truyền khảo sát mở nghiên cứu sâu chế tác động thuốc TÀI LIỆU THAM KHẢO Campbell M.J., Hamilton B., Shoemaker M., Tagliaferri M., Cohen I., & Tripathy D., 2002 Antiproliferative activity of Chinese medicinal herbs on breast cancer cells in vitro Anticancer Research, 22:3843-3852 Deng H., Nakajima K., Ma X., Hasumi K., Akatsuka T., & Wago H., 2001 Anti-tumour activity of traditional chinese medicine, Ekki-Youketsu-Fusei-Zai, and its effects on immunocyte functions J Saitama Med School, 28:109-115 Hsu Y.L., Kuo P.L., Tzeng T.Z., Sung S.C.,Yen M.H., Lin L.T & Lin, C.C., 2008 Huang-lian-jie-du-tang, a traditional Chinese medicine prescription, induces cell-cycle arrest and apoptosis in human liver cancer cells in vitro and in vivo Journal of Gastroenterology and Hepatology, 23:290-299 Kim J.B., Koo H.N., Joeng H.J., Lyu Y.S., Park S.G., Won J.H., Kim Y.K., Hong S.H., & Kim H.M., 2005 Induction of apoptosis by Korean medicine Gagam-whanglyun-haedotang through activation of caspase-3 in human leukemia cell line, HL-60 Journal of Pharmacological Sciences, 97:138-145 Lian Z., Niwa K., Gao J., Tagami K., Mori H., & Tamaya T., 2003 Association of cellular apoptosis with anti-tumor effects of the Chinese herbal complex in endocrine-resistant cancer cell line Cancer Detection and Prevention, 27:147-154 Ma Z., Otsuyama K., Liu S., Abroun S., Ishikawa H., Tsuyama N., Obata M., Li F.J., Zheng X., Maki Y., Miyamoto K & Kawano M.M., 2005 Baicalein, a component of Scutellaria radix from Huang-Lian-Jie-Du-Tang (HLJDT), leads to suppression of proliferation and induction of apoptosis in human myeloma cells Blood, 105: 3312-3318 Nguyễn Thái Hoàng Tâm, Nguyễn Thụy Vy, Tất Tố Trinh , Nguyễn Thị Tuyết Giang, Nguyễn Ngọc Hạnh, Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2007 Chuẩn hóa thử nghiệm Sulforhoddamin B (SRB) để xác định tính gây độc tế bào hợp chất tự nhiên Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Nxb KH&KT, Quy Nhơn, 809-811 Sun A., Chia J.S., Chiang C.P., Hsuen S.P., Du J.L., Wu C.W., & Wang W.B., 2005 The Chinese Herbal Medicine Tien-Hsien Liquid Inhibits Cell Growth and Induces Apoptosis in a Wide Variety of Human Cancer Cells The Journal of Alternative and Complementary Medicine, 11:245-256 Thabrew M.I., Mitry R.R., Morsy M.A., & Hughes R.D., 2005 Cytotoxic effects of a decoction of Nigella sativa, Hemidesmus indicus and Smilax glabra on human hepatoma HepG2 cells Life Sciences, 77:1319-1330 10 WHO, 2002 WHO Traditional Medicine Strategy 2002-2005 WHO, Geneva LỜI CẢM ƠN Đề tài nhận tài trợ từ Chương Trình Y tế (2008-2010) Sở Khoa học Công nghệ TP.HCM  SUMMARY IN VITRO ANTICANCER ACTIVITY OF FOUR TRADITIONAL REMEDIES (1) (1) (1) (1) Nguyen Thuy Vy , Nguyen Thai Hoang Tam , Tran Ngoc Kha Vy , Vu Thi Thu Thuy , (2) (1) Nguyen Thi Bay , Ho HuynhThuy Duong (1) Lab of Molecular Biology, Department of Genetics, Faculty of Biology, University of Science, Vietnam National University - Ho Chi Minh City (2) Faculty of Traditional Medicine, University of Medicine & Pharmacy HCM City ABSTRACT Decoctions of traditional remedies, Song sâm địa thược thang (Codonopsis spp., Rehmannia glutinosa, Scrophularia buergeriana, Hedyotis diffusa, Scutellaria barbata), Nhị trần thang gia vị (Typhonium trilobatum, Poria cocos, Glycyrrhiza spp., Scutellaria barbata), Hoàng liên giải độc thang (Coptis chinensis, Phellodendron chinense, Scutellaria baicalensis, Paeonia lactiflora, Gardenia jasminoides), Tiêu tích nhuyễn kiên phương (Hedyotis diffusa, Scutellaria barbata, Paeonia lactiflora, Ostrea gigas) were evaluated for their antiproliferative effect on three human cancer cell lines, HeLa, MCF-7, and NCI-H460 Overall, all the decoctions demonstrated growth inhibitory activity on all of the cancer cell lines Decoction of Hoang lien giai doc thang showed the highest activity, and the breast cancer cell lines MCF-7 tended to be more sensitive to most of the decoctions compared with other cell lines These results indicate the potential use of these remedies as antineoplastic agents and suggest further studies on investigating their mechanism(s) of action Keywords: traditional remedy, cytotoxicity, Hoang lien giai doc thang  ... ung thư thuốc Hoàng liên giải độc thang đáp ứng tế bào MCF-7 KẾT LUẬN Những kết bước đầu chứng minh khả kháng ung thư in vitro thuốc cổ truyền khảo sát mở nghiên cứu sâu chế tác động thuốc TÀI... SRB xác định độc tính tế bào: Tế bào ni đĩa 96 giếng mật độ ban đầu 104 tế bào/ giếng dòng HeLa, MCF-7 7,5.10 tế bào/ giếng dòng NCI-H460 Sau ủ 24 giờ, tế bào xử lý với dịch chiết nồng độ khác 48... dòng tế bào MCF-7 thể đáp ứng với dịch chiết nhạy so với dòng tế bào lại với IC50 tất dịch chiết dòng tế bào thấp từ 2-4 lần so với IC50 dòng tế bào lại Các thí nghiệm thực nhằm tìm hiểu chế kháng