NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NÁM BỆNH THỰC VẬT CỦA 84CILLUSSPP & ỨNG DỤNG THU NHẬN CHẾ PHẨM

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM BỆNH THỰC VẬT CỦA BACILLUS SPP & ỨNG DỤNG THU NHẬN CHẾ PHẨM Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực ThS NGUYỄN NHƯ NHỨT NGUYỄN THỊ THÀNH ĐÔ Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 01 năm 2011 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực luận văn, em không ngừng nhận giúp đỡ quan tâm gia đình, thầy bạn bè Điều động lực giúp em phần đấu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng TP Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học ứng dụng Bộ Môn Công nghệ sinh học tất q thầy tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học trường Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến Ths Nguyễn Như Nhứt, người tận tình bảo, hướng dẫn, góp ý khơng ngừng quan tâm, động viên em suốt trình thực luận văn tốt nghiệp Xin cảm ơn quý Công ty TNHH Gia Tường tạo điều kiện tốt cho em thực luận văn tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Ngọc Yến, chị Ánh Nguyệt, chị Hồng Thơm, anh Bang Hoài, anh Ngọc Hùng, anh Văn Q, anh Hồnh Qn, anh Văn Tuấn anh Duy Luận, tất anh chị làm việc Chi nhánh Bình Dương – Cơng ty TNHH Gia Tường nhiệt tình giúp đỡ bảo em suốt thời gian thực khóa luận Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ người thân gia đình hết lịng quan tâm, động viên tạo điều kiện tốt để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Mặc dù cố gắng hồn thiện luận văn tất nhiệt tình lực mình, nhiên khơng thể tránh khỏi sai sót, mong nhận đóng góp q báu q thầy bạn Một lần em xin chân thành cảm ơn tất q thầy cơ, bạn gia đình Sinh viên thực tập Nguyễn Thị Thành Đơ i TĨM TẮT NGUYỄN THỊ THÀNH ĐƠ, Đại học Tơn đức Thắng, tháng 2/2011, đề tài nghiên cứu “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM BỆNH THỰC VẬT BACILLUS SPP VÀ ỨNG DỤNG THU NHẬN CHẾ PHẨM.” Giáo viên hướng dẫn: ThS NGUYỄN NHƯ NHỨT Bệnh hại trồng tiếp tục gây hại nghiêm trọng đến mùa màng Việt Nam nước khu vực Đông Nam Á Nhiều bệnh nấm đất gây ảnh hưởng trực tiếp đến trồng, làm giảm suất chất lượng nông sản dẫn đến thu nhập người nông dân giảm đáng kể Ở nước ta, bệnh hại trồng kiểm soát cách áp dụng nhiều biện pháp khác nhau, biện pháp hóa học xem hữu hiệu Tuy nhiên, loại thuốc hóa học gây tác hại đáng kể đến người, môi trường xung quanh…, nên xu hướng dùng tác nhân sinh học vi sinh vật hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tự nhiên để kiểm sốt dịch bệnh hại trồng Dó đó, chúng tơi tiến hành khảo sát khả đối kháng nấm bệnh gây hại trồng chủng Bacillus Những kết đạt được: o Khảo sát đối kháng chủng Bacillus, hầu hết chủng Bacillus đối kháng với nấm bệnh Qua thí nghiệm, chúng tơi chọn lọc chủng có khả đối kháng cao với nấm bệnh o Sau chọn lọc chủng, tiến hành khảo sát điều kiện ni cấy có ảnh hưởng đến khả tăng sinh chủng Bacillus Thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy chủng Bacillus chọn lọc: dịch chiết cám gạo 10% 1000ml, saccharose 1,5%; (NH4)2SO4 0,075%; peptone 0,09% o Thu nhận chế phẩm, tiến hành đánh giá hiệu đối kháng chế phẩm quy mơ phịng thí nghiệm Đề tài giúp cho nhà nghiên cứu sản xuất có chiến lược tạo chế phẩm điều kiện bảo quản quy mô sản xuất lớn ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH xi DANH MỤC BIỂU ĐỒ xiii CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược số bệnh hại trồng nấm bệnh trồng 2.1.1 Một số bệnh hại trồng 2.1.1.1 Cây công nghiệp 2.1.3.2 Cây ăn 2.1.3.3 Rau ăn trái rau gia vị 2.1.2 Một số loài nấm bệnh trồng 2.1.2.1 Sclerotium rolfsii 2.1.2.2 Rhizoctonia 2.1.2.3 Phytophthora 11 2.1.2.4 Fusarium 12 2.2 Các biện pháp kiểm soát bệnh hại trồng 13 2.2.1 Biện pháp kiểm soát hóa học 13 2.2.2 Biện pháp kiểm soát sinh học 14 2.3 Sơ lược vi khuẩn Bacillus 16 2.3.1 Vị trí phân loại 16 2.3.2 Môi trường sống 16 2.3.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý 16 2.3.4 Một số ứng dụng Bacillus spp 18 2.3.5 Các đặc tính sinh học có ích Bacillus 20 2.3.5.1 Điều hòa tăng trưởng hấp thu dinh dưỡng vật chủ 21 iii 2.3.5.2 Kiểm sốt nguồn bệnh thực vật-vi khuẩn, nấm, trùng tuyến trùng 23 2.3.5.3 Sự kích thích chế phịng thủ cho chủ thơng qua việc kích thích chuỗi phản ứng kháng 26 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .28 3.1 Vật liệu 28 3.1.1 Chủng giống nghiên cứu 28 3.1.2 Vật liệu sử dụng 29 3.2 Dụng cụ, thiết bị 29 3.3 Các môi trường nuôi cấy 29 3.3.1 Môi trường PGA (MT1) 29 3.3.2 Môi trường cao thịt – peptone 29 3.3.3 Môi trường nước chiết giá đậu – đường peptone (MT3) 30 3.3.4 Môi trường tăng sinh (MT4) 30 3.4 Phương pháp 30 3.4.1 Phương pháp định lượng đạm tổng số 30 3.4.2 Phương pháp bảo quản giống thạch nghiêng 30 3.4.3 Phương pháp tăng sinh Bacillus môi trường 31 3.4.4 Phương pháp khảo sát khả đối kháng Bacillus 31 3.4.4.1 Nguyên tắc 31 3.4.4.2 Cách tiến hành 31 3.4.4.3 Cách xác định hiệu đối kháng Bacillus 32 3.4.5 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn phương pháp đo OD600nm phương pháp đếm khuẩn lạc 32 3.4.5.1 Xác định số lượng tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc 32 3.4.5.2 Phương pháp đo OD600nm 33 3.4.6 Phương pháp thu nhận dịch chiết chất 33 3.4.7 Phương pháp nuôi cấy lỏng để thu nhận sinh khối Bacillus 33 3.5 Các phương pháp nghiên cứu 34 3.5.1 Phương pháp chọn lọc chủng Bacillus có khả đối kháng tốt với nấm bệnh 34 iv 3.5.1.1 Nuôi cấy Bacillus trước 34 3.5.1.2 Cấy đối kháng đồng thời 34 3.5.1.3 Cấy đối kháng nấm bệnh trước 34 3.5.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng số điều kiện lên q trình tăng sinh Bacillus mơi trường lỏng 35 3.5.2.1 Ảnh hưởng loại dịch chiết chất riêng lẻ 35 3.5.2.2 Ảnh hưởng nguồn carbon bổ sung 35 3.5.2.3 Ảnh hưởng nồng độ nguồn carbon bổ sung 35 3.5.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitrogen vô bổ sung 35 3.5.2.5 Ảnh hưởng nồng độ nguồn nitrogen vô bổ sung 35 3.5.2.6 Ảnh hưởng nguồn nitrogen hữu bổ sung 36 3.5.2.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 36 3.5.2.8 Thu nhận chế phẩm dịch tăng sinh bước đầu thử nghiệm đánh giá hiệu đối kháng chế phẩm 36 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 38 4.1 Khảo sát hiệu đối kháng chủng Bacillus chủng nấm bệnh môi trường PGA 38 4.1.1 Hiệu đối kháng nấm bệnh chủng Bacillus nuôi cấy trước so với nấm bệnh 38 4.1.2 Khảo sát hiệu đối kháng nuôi cấy đồng thời chủng Bacillus nấm bệnh 44 4.1.3 Khảo sát hiệu đối kháng nuôi cấy nấm bệnh trước 49 4.2 Khảo sát ảnh hưởng thành phần mơi trường chọn lọc điều kiện thích hợp cho tạo tế bào vi khuẩn Bacillus 56 4.2.1 Ảnh hưởng loại dịch chiết chất riêng lẻ 56 4.2.2 Ảnh hưởng nguồn carbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy 58 4.2.3 Ảnh hưởng nồng độ saccharose 59 4.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitrogen bổ sung 60 4.2.4.1 Ảnh hưởng nguồn nitrogen vô bổ sung 60 4.2.4.2 Ảnh hưởng nồng độ bổ sung (NH4)2SO4 62 4.2.4.3 Ảnh hưởng nguồn nitrogen hữu bổ sung 63 4.2.4.4 Ảnh hưởng nồng độ peptone 64 v 4.2.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 66 4.3 Đánh giá hiệu đối kháng chế phẩm dịch tăng sinh chủng Bacillus Bac36 69 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70 5.1 Kết luận 70 5.1.1 Khả đối kháng chủng Bacillus chủng nấm bệnh 70 5.1.2 Điều kiện nuôi cấy chủng Bacillus Bac36 để thu nhận chế phẩm sinh học đánh giá hiệu chế phẩm 70 5.2 Đề nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A : số tế bào vi khuẩn 1ml mẫu Bac : Bacillus BB : bột bắp BDĐN : bã dầu đậu nành CFU : conlony- forming unit CG : cám gạo CM : cám mì D : đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình đĩa đối kháng Dđc : đường kính khuẩn lạc trung bình đĩa đối chứng DDT : dichlorophenyltrichlorothane đc : đối chứng ĐC : đối chứng fi : độ pha loãng GĐ : giá đậu Glu : glucose I : hiệu đối kháng IR : induced resistance ISR : induced systemic resistance KBM : King’B agar KT : khoai tây Lac : lactose M : malt Man : mannose MT : môi trường ni : số lượng đĩa cấy độ pha loãng thứ i N : tổng số khuẩn lạc đĩa chọn NB : nấm bệnh NYA : nutrient broth-yeast extract agar PGA : Potato Glucose Agar PGPR : Plant Growth Promoting Rhizobacteria vii SA : Salicylic acid Sac : saccharose TB : trung bình Tp : thành phố V : thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa Xyl : xylose YMA : yeast extract malt viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Một số đặc điểm nguồn nấm bệnh bệnh Sclerotium rolfsii Bảng 2.2 Một số đặc điểm nguồn nấm bệnh bệnh Rhizoctonia Bảng 2.3 Một số đặc điểm nguồn nấm bệnh bệnh Phytophthora 11 Bảng 2.4 Một số đặc điểm nguồn nấm bệnh bệnh Fusarium 12 Bảng 3.1 Các giống Bacillus dùng nghiên cứu 28 Bảng 3.2 Các giống nấm bệnh dùng nghiên cứu 29 Bảng 4.1 Hiệu đối kháng 10 chủng Bacillus sau ủ ngày NB01 có hiệu đối kháng cao 38 Bảng 4.2 Hiệu đối kháng 10 chủng Bacillus sau ủ ngày NB02 có hiệu đối kháng cao 39 Bảng 4.3 Hiệu đối kháng 10 chủng Bacillus sau ủ ngày NB03 có hiệu đối kháng cao 40 Bảng 4.4 Hiệu đối kháng 10 chủng Bacillus sau ủ ngày NB04 có hiệu đối kháng cao 41 Bảng 4.5 Đánh giá tổng hợp hiệu đối kháng nấm bệnh chủng Bacillus có hiệu đối kháng cao 43 Bảng 4.6 Hiệu đối kháng đồng thời chủng Bacillus ủ đồng thời NB01 có hiệu đối kháng cao 44 Bảng 4.7 Hiệu đối kháng đồng thời chủng Bacillus ủ đồng thời NB02 có hiệu đối kháng cao 45 Bảng 4.8 Hiệu đối kháng đồng thời chủng Bacillus ủ đồng thời NB03 có hiệu đối kháng cao 46 Bảng 4.9 Hiệu đối kháng đồng thời chủng Bacillus ủ đồng thời NB04 có hiệu đối kháng cao 47 Bảng 4.10 Đánh giá tổng hợp hiệu đối kháng nấm bệnh chủng Bacillus chọn lọc 49 Bảng 4.11 Hiệu đối kháng nuôi cấy nấm bệnh trước chủng Bacillus chọn lọc NB01 50 Bảng 4.12 Hiệu đối kháng nuôi cấy nấm bệnh trước chủng Bacillus chọn lọc NB02 51 ix Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: ThS Nguyễn Như Nhứt 7,96 7,94 7,92 Log N 7,90 7,88 7,86 7,84 7,82 7,80 7,78 7,76 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Nồng độ saccharose (%) Biểu đồ 4.15 Ảnh hưởng nồng độ saccharose lên tăng sinh chủng Bac36  Nhận xét: Kết thu bảng 4.18 cho thấy nồng độ saccharose có ảnh hưởng đến trình tăng sinh chủng Bac36 Dựa vào biểu đồ 4.16, ta thấy nồng độ saccharose tăng từ 0,5 đến 1,5% mật độ tế bào tăng (từ 2,2*107 CFU/ml đến 2,6*107 CFU/ml) Với nồng độ tăng từ 1,5 đến 3,5% mật độ tế bào giảm xuống 2,0*107 CFU/ml Chủng Bac36 tạo lượng tế bào cao nồng độ saccharose 1,5% Tuy nhiên, theo nghiên cứu Maria Antonieta Gordillo cộng (2009), chủng Bacillus IBA 33 tăng sinh cho lượng tế bào cao nồng độ 2% với đường glucose họ khảo sát với đường mannitol hiệu thấp hơn.[19] Điều lần cho thấy loại đường nồng độ đường có ảnh hưởng khác lên tăng sinh chủng Bacillus khác Với kết này, chọn đường saccharose với nồng độ bổ sung 1,5% để tiến hành tăng sinh chủng Bac36 4.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitrogen bổ sung Nhiều nghiên cứu cho thấy để thu số lượng tế bào Bacillus cao, cần bổ sung thêm nguồn nitrogen Do đó, chủng Bac36 nghiên cứu ni cấy mơi trường có bổ sung thành phần nitrogen vô nitrogen hữu khác 4.2.4.1 Ảnh hưởng nguồn nitrogen vô bổ sung Tiến hành nuôi cấy chủng Bac36 môi trường chọn lọc mục 4.2.3 kết hợp với nguồn nitrogen vô khác Nguồn nitrogen vô sử dụng chủ yếu hợp chất dạng muối nitrogen vô NH4Cl, NH4NO3, (NH4)2SO4 60 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: ThS Nguyễn Như Nhứt NH4H2PO4 với nồng độ 0,1%.[24] Sau ngày nuôi cấy, tiến hành xác định số lượng tế bào erlen Kết thu nhận trình bày bảng 4.19 Bảng 4.19 Ảnh hưởng nguồn nitrogen vô bổ sung lên tăng sinh chủng Bac36 Nitrogen vô N (*107 CFU/ml) NH4Cl 2,4 NH4NO3 2,0 (NH4)2SO4 2,8 NH4H2PO4 2,7 Biểu đồ 4.16 Ảnh hưởng nguồn nitrogen vô bổ sung lên tăng sinh chủng Bac36  Nhận xét: Dựa vào bảng số liệu thu được, thấy nguồn nitrogen vô bổ sung có ảnh hưởng đến q trình tăng sinh Bac36, với nguồn nitrogen vơ khác khả tăng sinh Bac36 khác Dựa vào biểu đồ, thấy nuôi cấy chủng Bac36 mơi trường có chứa NH4NO3 thu nhận lượng tế bào thấp (2,0*107 CFU/ml) Lượng tế bào Bac36 đạt cao thu môi trường có bổ sung (NH4)2SO4 (2,8*107 CFU/ml), NH4H2PO4 (2,7*107 CFU/ml), NH4Cl (2,4*107 CFU/ml) Do đó, chúng tơi chọn (NH4)2SO4 nguồn nitrogen vơ thích hợp cho tăng sinh chủng Bac36 61 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: ThS Nguyễn Như Nhứt 4.2.4.2 Ảnh hưởng nồng độ bổ sung (NH4)2SO4 Tiến hành nuôi cấy chủng Bac36 môi trường chọn lọc mục 4.2.4.1 với tỷ lệ bổ sung (NH4)2SO4 từ 0,025 đến 0,15% [2], [24] Sau lắc ngày, tiến hành xác định mật độ tế erlen Bảng 4.20 Ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 lên tăng sinh chủng Bac36 Nồng độ (NH4)2SO4 (%) N (*107 CFU/ml) 0,025 2,5 0,050 3,0 0,075 3,4 0,100 2,8 0,125 2,4 0,150 2,4 8,10 8,05 Log N 8,00 7,95 7,90 7,85 7,80 0,025 0,05 0,075 0,100 Nồng độ (NH4)2SO4 (%) 0,125 0,1506 Biểu đồ 4.17 Ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 lên tăng sinh chủng Bac36  Nhận xét: Dựa vào kết thu được, nhận thấy hàm lượng (NH4)2SO4 ảnh hưởng đến khả tăng sinh chủng Bac36 Nhìn chung, hàm lượng (NH4)2SO4 mơi trường ni cấy thấp, nhiên, có ảnh hưởng đến trình tăng sinh vi khuẩn Với hàm lượng bổ sung khác (NH4)2SO4, mức độ ảnh hưởng lên tăng sinh khác Dựa vào biểu đồ 4.18, thấy tăng nồng độ từ 0,025 đến 0,075% mật độ tế bào tăng dần sau giảm dần Khi (NH4)2SO4 nồng độ 0,075% khả tăng sinh chủng 62 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: ThS Nguyễn Như Nhứt Bac36 cao với 3,4*107 CFU/ml, 0,05% (lượng tế bào thu 3,0*107 CFU/ml) Khả tăng sinh thấp nồng độ 0,125 0,15% với lượng tế bào thu 2,4*107 CFU/ml Mật độ tế bào giảm hàm lượng nitrogen dư thừa gây ức chế trình tăng sinh Bac36 Do đó, chúng tơi chọn hàm lượng bổ sung (NH4)2SO4 để tiến hành thí nghiệm 0,075% 4.2.4.3 Ảnh hưởng nguồn nitrogen hữu bổ sung Khơng nitrogen vơ có ảnh hưởng đến trình tăng sinh Bacillus mà nitrogen hữu ảnh hưởng đáng kể.[2], [23] Do đó, chúng tơi tiến hành khảo sát khả tăng sinh chủng Bac36 mơi trường có bổ sung thành phần nitrogen hữu khác như: casein, cao thịt, cao men peptone với nồng độ 0,09% Bảng 4.21 Ảnh hưởng nồng độ nitrogen hữu bổ sung lên tăng sinh chủng Bac36 Nguồn nitrogen hữu N (*107CFU/ml) Caomen 5,2 Casein 9,3 Cao thịt 5,4 Peptone 9,5 8,55 8,50 8,45 Log N 8,40 8,35 8,30 8,25 8,20 8,15 8,10 8,05 Cao men Casein Cao thịt Peptone Nguồn nitrogen hữu Biểu đồ 4.18 Ảnh hưởng nồng độ nitrogen hữu bổ sung lên tăng sinh chủng Bac36 63 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: ThS Nguyễn Như Nhứt  Nhận xét: Dựa vào kết bảng 4.21 biểu đồ 4.19, thấy nguồn cung cấp nitrogen hữu mơi trường có ảnh hưởng đáng kể đến trình tăng sinh Bac36 cao men cao thịt cho lượng tế bào thấp nhiều so với casein với peptone Nguồn nitrogen hữu để nuôi cấy thu nhận tế bào Bac36 thấp cao men với mật độ tế bào thu 5,2*107 CFU/ml, cao thịt với mật độ tế bào 5,4*107 CFU/ml, casein với mật độ tế bào 9,3*107 CFU/ml Mật độ tế bào Bac36 đạt cao (9,5*107 CFU/ml) nuôi cấy mơi trường có bổ sung peptone Mật độ tế bào Bac36 thu mơi trường có bổ sung peptone tăng đáng kể so với khơng có bổ sung nguồn nitrogen hữu (mục 4.2.4.2) (từ 3,4*107 CFU/ml đến 9,5*107 CFU/ml) Điều lần cho thấy kết hợp hai nguồn nitrogen vô nitrogen hữu cho kết tăng sinh chủng Bacillus tốt Với kết trên, thấy peptone nguồn nitrogen hữu bổ sung thích hợp cho q trình tăng sinh chủng Bac36 4.2.4.4 Ảnh hưởng nồng độ peptone Để xác định nồng độ peptone thích hợp để ni cấy chủng Bac36, tiến hành khảo sát khả tăng sinh Bac36 môi trường chọn lọc mục 4.2.4.3 kết hợp với thay đổi hàm lượng peptone để chọn điều kiện tăng sinh tối ưu Hàm lượng peptone khảo sát với tỷ lệ thay đổi từ đến 0,15%.[2], [18], [24] Bảng 4.22 Ảnh hưởng nồng độ peptone lên tăng sinh chủng Bac36 Nồng độ peptone bổ sung (%) 0,03 0,06 0,09 0,12 0,15 64 N (*107 CFU/ml) 5,8 6,5 7,2 9,4 7,7 4,4 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: ThS Nguyễn Như Nhứt 8,60 8,50 Log N 8,40 8,30 8,20 8,10 8,00 7,90 01 0,032 0,063 0,09 0,125 0,156 Nồng độ peptone (%) Biểu đồ 4.19 Ảnh hưởng nồng độ peptone bổ sung lên tăng sinh chủng Bac36  Nhận xét: Kết bảng 4.22 cho thấy hàm lượng peptone ảnh hưởng đến khả tăng sinh chủng Bac36, với hàm lượng peptone thay đổi khả tăng sinh Bac36 thay đổi Trong đó, nồng độ peptone mà chủng Bac36 có khả tăng sinh cao 0,09%; nồng độ 0,12% Dựa vào biểu đồ 4.20, nhận thấy mật độ tế bào tăng theo nồng độ peptone từ đến 0,09% sau giảm dần Từ nồng độ 0,09 đến 0,15% mật độ tế bào giảm hàm lượng peptone cao gây ức chế trình tăng sinh Bac36 Ở nồng độ peptone 0,09%, mật độ tế bào thu cao (9,4*107 CFU/ml) Với kết này, chọn nồng độ peptone để bổ sung vào môi trường nuôi cấy tăng sinh chủng Bac36 0,09% 65 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: ThS Nguyễn Như Nhứt 4.2.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Bảng 4.23 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả tăng sinh Bac36 môi trường chọn lọc Thời gian nuôi cấy (giờ) Log N N (*107 CFU/ml) 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 7,513 7,531 7,543 7,543 7,549 7,567 7,644 7,739 7,810 7,880 7,968 8,073 8,200 8,323 8,508 8,572 8,606 8,640 8,675 8,680 8,654 8,600 8,564 8,541 8,530 8,530 8,530 8,530 8,524 8,524 8,521 8,521 8,521 8,521 8,521 1,0 1,1 1,1 1,2 1,2 1,4 1,5 1,7 2,0 2,2 2,5 2,7 4,5 8,7 1,1 11,7 12,0 12,4 13,2 14,1 10,9 10,7 10,7 10,4 10,2 10,5 10,9 11,6 12,1 12,2 12,1 13,3 12,8 13,3 12,3 66 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: ThS Nguyễn Như Nhứt 8,8 8,6 Log N 8,4 8,2 8,0 7,8 7,6 7,4 20 40 60 80 Thời gian nuôi cấy (giờ) Đồ thị 4.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả tăng sinh Bac36 môi trường chọn lọc  Nhận xét: Dựa vào số liệu bảng 4.23 đồ thị 4.1, thấy khả tăng sinh chủng Bac36 phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy Từ đến 10 nuôi cấy, mật độ tế bào gần không thay đổi; sau 10 đến 38 mật độ tế bào tăng theo đường tuyến tính mật độ tế bào đạt cao 38 với mật độ tế bào 1,41*108 CFU/ml; sau 38 mật độ tế bào có xu hướng giảm dần vào pha ổn định Tuy nhiên, với nghiên cứu Maria Antonieta Gordillo cộng (2009) khảo sát thời gian tăng sinh chủng Bacillus IBA 33 môi trường LM (Landy medium) sau 12 mật độ tế bào pha tăng trưởng, sau 24 kết thúc pha tăng trưởng.[19] Mặc khác, nhà nghiên cứu Giuliano Bernal cộng (2002) khảo sát thời gian tăng trưởng Bacillus môi trường khác CPG, CPM CPM-Ca2+ cho thấy tốc độ tăng trưởng chúng khác mơi trường.[15] Qua đó, chúng tơi thấy khả tăng sinh chủng Bacillus phụ thuộc vào thành phần môi trường, với mơi trường có thành phần khác thời gian cho giai đoạn trình tăng sinh khác Mặc khác, kết tăng sinh chủng Bac36 sau 38 1,41*108 CFU/ml phù hợp so với kết nghiên cứu HeidiI.G Abo-Elnaga (2006) (108-109 CFU/ml)[16] Đó tiềm để sản xuất, thu nhận chế phẩm đưa vào ứng dụng thực tiễn Với kết này, nhận thấy thời gian thích hợp để thu nhận chế phẩm sinh khối chủng Bac36 38 nuôi cấy môi trường chọn lọc 67 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: ThS Nguyễn Như Nhứt 4.3 Đánh giá hiệu đối kháng chế phẩm dịch tăng sinh chủng Bacillus Bac36 Sau chọn lọc điều kiện thích hợp để thu nhận sinh khối chủng Bac36 cao nhất, để đánh giá hiệu đối kháng tiềm ứng dụng chế phẩm Bac36, tiến hành đánh giá hiệu đối kháng chế phẩm Bac36 với chủng nấm bệnh đĩa Petri môi trường MT1 (mục 3.3) Bảng 4.24 Hiệu đối kháng chủng Bac36 chủng nấm bệnh Thời điểm nuôi cấy chế phẩm sinh học Bac36 so với Trước Đồng thời Sau NB01 84,00 70,42 28,89 NB02 84,44 72,22 25,89 NB03 81,78 62,78 30,67 NB04 90,67 81,11 38,00 nấm bệnh Nấm bệnh 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 I (%) Trước Đồng thời Sau NB01 NB02 NB03 Chủng nấm bệnh NB04 Biểu đồ 4.20 Hiệu đối kháng chế phẩm sinh học Bac36 chủng nấm bệnh trường hợp nuôi cấy chế phẩm trước, đồng thời sau so với nấm bệnh 68 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: ThS Nguyễn Như Nhứt  Nhận xét: Dựa kết trình bày bảng 4.24, chúng tơi nhận thấy chế phẩm Bac36 giữ khả đối kháng với chủng nấm bệnh nghiên cứu Với chủng nấm bệnh khác nhau, ứng với trường hợp cấy đối kháng khác nhau, hiệu đối kháng khác Khi nuôi cấy chế phẩm Bac36 trước, với kết thu được, chủng Bac36 có hiệu đối kháng cực tốt [++++] (I > 75%) chủng nấm bệnh nghiên cứu Trong đó, hiệu đối kháng NB04 cao (I = 90,67%); chủng nấm bệnh NB01 NB02 có hiệu đối kháng gần (I = 84% 84,44% thấp NB03 (81,78%) Khi ni cấy đồng thời, chế phẩm từ Bac36 có hiệu đối kháng từ tốt đến cực tốt chủng nấm bệnh nghiên cứu Hiệu đối kháng thấp NB03 62,78%, NB02 NB01 (I = 72,22% I = 70,42% tương ứng) Hiệu đối kháng đạt cao NB04 81,11% Nhìn chung, hiệu đối kháng chế phẩm Bac36 với chủng nấm bệnh nghiên cứu trường hợp cấy đối kháng đồng thời thấp so với cấy đối kháng nấm bệnh trước Khi nuôi cấy chế phẩm Bac36 với nấm bệnh ni cấy trước, chế phẩm Bac36 có hiệu đối kháng với chủng nấm bệnh nghiên cứu thể mức giá trị [+] (I < 50%) Hiệu đối kháng cao chế phẩm thu NB04 đạt 38%, NB03 30,67%; đến NB01 28,89% hiệu đối kháng thấp NB02 25,89% Tóm lại, ba trường hợp cấy đối kháng để đánh giá hiệu chế phẩm Bac36 với chủng nấm bệnh nghiên cứu, hiệu đối kháng chế phẩm Bac36 nuôi cấy trước so với nấm bệnh cao nhất, nuôi cấy đồng thời thấp trường hợp nuôi cấy nấm bệnh trước Kết tương tự với kết thu sử dụng Bac36 nuôi cấy tăng sinh môi trường nước chiết giá đậu dùng nghiên cứu ban đầu (mục 4.1) Kết đối kháng chế phẩm Bac36 nấm bệnh trường hợp nấm bệnh phát triển trước cho thấy việc sử dụng chế phẩm việc phòng trừ nấm bệnh tốt việc phòng trị chúng Đây điểm đặc trưng chung sử dụng chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại nấm trồng 69 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: ThS Nguyễn Như Nhứt CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua kết thí nghiệm, rút kết luận sau: 5.1.1 Khả đối kháng chủng Bacillus chủng nấm bệnh Tất 22 chủng Bacillus có khả đối kháng với chủng nấm bệnh nghiên cứu (Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsic Fusarium sp.) Trong đó, chủng Bac36 có hiệu đối kháng cao ổn định qua trường hợp khảo sát hiệu đối kháng nuôi cấy chủng Bacillus trước, nuôi cấy đồng thời nuôi cấy chủng nấm bệnh trước mơi trường thí nghiệm 5.1.2 Điều kiện nuôi cấy lỏng chủng Bacillus Bac36 để thu nhận chế phẩm sinh học đánh giá hiệu chế phẩm Thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy chủng Bac36: Dịch chiết cám gạo 10% 1000ml Saccharose 1,5% (NH4)2SO4 0,075% Peptone 0,09% Điều kiện nuôi cấy: tỷ lệ tế bào ban đầu 2*104 tế bào/ml môi trường, thời gian nuôi cấy 38 Chế phẩm thu sau nuôi cấy chủng Bacillus Bac36 môi trường chọn lọc có mật độ tế bào 1,41*108 CFU/ml Chế phẩm sinh học Bac36 thu có tiềm để sử dụng phòng trừ chủng nấm bệnh nghiên cứu có hiệu đối kháng từ tốt đến cực tốt thí nghiệm ni cấy trước đồng thời với nấm bệnh Chế phẩm có khả ức chế phát triển chủng nấm bệnh phát triển trước môi trường thí nghiệm 5.2 Đề nghị Qua q trình nghiên cứu, nhận thấy rằng, để kết thí nghiệm có ý nghĩa thiết thực hơn, cần giải nhiều vấn đề như: o Cần đánh giá hiệu đối kháng chế phẩm nấm bệnh trồng 70 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: ThS Nguyễn Như Nhứt o Tiến hành nghiên cứu nuôi cấy tăng sinh qui mô sản xuất nhằm thu nhận chế phẩm với số lượng lớn nghiên cứu phương pháp bảo quản chế phẩm thu o Với trường hợp cấy đối kháng nấm bệnh trước, nên khảo sát với nấm bệnh cấy thời gian khác nhau, cấy nấm bệnh trước ngày, ngày… đĩa Petri có chứa mơi trường PGA nhằm dự đốn phổ đồ phòng trị bệnh chế phẩm o Chủng Bacillus Bac36 có khả ức chế tốt với chủng nấm bệnh nghiên cứu Tuy nhiên, với chủng nấm bệnh hiệu đối kháng chủng Bacillus khác Vì vậy, cần khảo sát khả ức chế chủng Bacillus với số loại nấm bệnh gây hại trồng khác o Như biết, nguồn gen chủng Bacillus phong phú đa dạng Do đó, ta cần khảo sát nhiều nguồn phân lập khác để tận dụng tối đa ưu điểm chúng việc kiểm soát nấm bệnh 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín Ngơ Đại nghiệp ,2004 Thực tập lớn sinh hóa NXB Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh [2] Nguyễn Lân Dũng ,1978 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập III NXB Khoa học kỹ thuật [3] Đinh Thị Thùy Hương, 2009 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phân hủy chitin từ Bacillus spp thử nghiệm ứng dụng thủy phân chất tự nhiên Khóa luận tốt nghiệp trường Đại học Nơng Lâm, Tp Hồ Chí Minh [4] Nguyễn Đình Khơi Ngun , 2009 Nghiên cứu khả kháng nấm tạo chế phẩm sinh học từ Trichoderma Khóa luận tốt nghiệp Trường Đại học Tơn Đức Thắng, Tp Hồ Chí Minh [5] Chi cục bảo vệ thực vật, 2009 Phòng trừ sâu bệnh hại sầu riêng Sở nông nghiệp phát triển nông thôn, Đồng Nai [6] Chi cục bảo vệ thực vật, 2009 Phịng chống sâu bệnh hại có múi Sở nông nghiệp phát triển nông thôn, Đồng Nai [7] Trần Linh Thước, 2009 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm NXB Giáo Dục, Tp Hồ Chí Minh [8] Trung tâm khuyến nơng, 2009 Quy trình kỹ thuật trồng rau gia vị Tài liệu khuyến nông, Đồng Nai [9] Trung tâm khuyến nơng, 2008 Quy trình kỹ thuật trồng rau ăn trái Tài liệu khuyến nông, Đồng Nai [10] Trung tâm khuyến nông, 2009 Kỹ thuật trồng tiêu công nghệ cao Tài liệu khuyến nông, Đồng Nai [11] Trung tâm khuyến nông, 2009 Kỹ thuật trồng điều công nghệ cao Tài liệu khuyến nông, Đồng Nai Tài liệu tiếng nước [12] A.M.Abou-Zeid, A.D.Atalhi, and R.E.AbdEl- Fattah, 2009 Bacterial control of pathogenic fungi isolated from some wild plants in Taif governorate, Saudi Arabia Mycopath 7: 11- 20 [13] Chutima Kuekul Vong, 2008 Antifungal activity against Sclerotium rolfsii by antagonistic microorganisms isolated from soil and Dendrobium orchid Faculty of graduate studies mahidol university [14] Dinesh K.Maheshwari, 2010 Plant growth and health promoting bacteria Springer-Verlag Berlin Heidelberg [15] Giuliano Bernal, Andres lllanes, and Luigi Ciampi, 2002 Isolation and partial purification of a metabolite from a mutant strain of Bacillus spp with antibiotic activity against plant pathogenic agents EJB Electronic Joumal of Biotechnology ISSN [16] Heidi I.G Abo-Elnaga, 2006 Bacillus subtilis as a biocontrol agent for controlling sugar beet damping-off disease Egypt J Phytopathol 34: 51-59 [17] Hung-Yuh Lin, Yerra Koteswara Rao, Wen-Shi Wu, and Yew-Min Tzeng, 2007 Ferrous ion enhanced lipopeptide antibiotic iturin a production from Bacillus amyloliquefaciens B128 International Journal of Appiled Science and Engineering 5(2): 123-132 [18] Jae-Wook Hyun, Young-Hoon Kim, Yong-Se Lee, and Won-Mok Park, 1999 Isolation and evalution of protective effect against Fusarium wilt of sesame plants of antibiotic substance from Bacillus polymyxa KB-8 Plant Pathol J 15: 152-157 [19] Maria Antonieta Gordillo, 2009 Preliminary study and improve the production of metabolites with antifungal activity by a Bacillus sp strain IBA 33 Microbiology Insights 2: 15-24 [20] N.D.Gary R.C.Bard, 1952 Effect of nutrition on the growth and metabolism of Bacillus subtilis Department of bacteriology, Indiana University, Bloomington, Indiana, 501-512 [21] Nalisha I ,Muskhzli M., and Nor Farizan T., 2006 Production of bioactive compounds by Bacillus subtilis against Sclerotium rolfsii Malaysian Journal of Microbiology 2: 19-23 [22] Naveen Kumar Arora, Ekta Khare, Ji Hoon Oh, Sun Chul Kang and Dinesh K Maheshwari, 2008 Diverse mechanism adopted by fluorescent Pseudomonas PDC2 during the inhibition of Rhizoctonia solani and Phytophthora capsici World J Microbiol Biotechnol 24: 581-585 [23] Rita Noveriza and Tricita H Quimio, 2004 Soil mycoflora of black peper rhizosphere in the Philippines and their in vitro antagonis against Phytophthora capsici, 1-10 [24] R.S Prakasham, Ch Subba Rao, and P.N Sarma, 2006 Green gram husk-an inexpensive substrate for alkaline protease production by Bacillus sp in solidstate fermentation Bioresource Technology 97: 1449-1454 [25] Salme Timmusk, 2010 Mechanism of action of plant growth promoting bacterium Paenibacillus polymyxa Comprehensive summaries of Uppsala dissertations from the faculty of science and technology 908 [26] Z Kamil, M Rizk, M Saleh, and S Moustafa, 2007 Isolation and identificationof rhizosphere soil chitinolytic bacteria and their potential in antifungal biocontrol Global Journal of Molecular Sciences 2: 57-66 Tài liệu từ internet [27] http://fromnih.gov [28] http://www.indopedia.org/Advantages_and_disadvantages_of_pesticides_and _biological_control_in_agriculture.html [29] http://www.khuyennongvn.gov.vn [30] http://www.tanisugar.vn [31] http://www.bvtvphutho.vn [33] http://www.ars.usda.gov.vn [32] http://www.khuyennongvn.gov.vn [34] http://www.hgca.com [35] http://www.ngocbinh.weddayhoc.net [36] http://www.cnx.org [37] http://www.cynosura.org/index [38] http://www.caycanhvietnam.com ... tổng hợp enzyme thủy giải chitin Bac cepacia có khả tiết ? ?-1 ,3-glucanase có khả phân hủy vách tế bào nấm bệnh đất Rhizoctonia solani, Pythium cultimum Sclerotium rolfsii (Compant cộng sự, 2005)... (KT), giá đậu (GĐ), malt (M)… 3.2 Dụng cụ, thi? ??t bị Các thi? ??t bị dụng cụ thông thường phịng thí nghiệm vi sinh cân phân tích, Autolave, máy lắc 15 0-2 50 vịng/phút, kính hiển vi quang học, dụng... chứng (cm) Quy ước hiệu đối kháng sau:[23] [-] Không đối kháng [+] Đối kháng (I < 50%) [++] Đối kháng trung bình (I = 5 1-6 0%) [+++] Đối kháng tốt (I = 6 1-7 5%) [++++] Đối kháng cực tốt (I > 75%)