Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Phân Bào Thực Nghiệm Của Một Số Bài Thuốc Cổ Truyền Hoặc Dân Gian Ở Mức Độ Tế Bào Và Phân Tử.pdf

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG PHÂN BÀO THỰC NGHIỆM CỦA MỘT SỐ BÀI THUỐC CỔ TRUYỀN HOẶC DÂN GIAN Ở MỨC ĐỘ TẾ BÀO VÀ PHÂN TỬ CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 6/ 2010 MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i  DANH MỤC CÁC BẢNG iv  DANH MỤC CÁC HÌNH v  PHẦN MỞ ĐẦU 1  TỔNG QUAN 5  VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 13  2.1 VẬT LIỆU SINH HỌC 13  2.2 PHƯƠNG PHÁP 14  2.2.1 Phương pháp thu nhận cao nước từ thuốc 14  2.2.2 Phương pháp nuôi tế bào 14  2.2.3 Phương pháp SRB (Sulforhodamin B) 15  2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính caspase 16  2.2.5 Phương pháp kính hiển vi huỳnh quang 18  2.2.6 Phương pháp phân tích DNA gene (“thang DNA”) 19  2.2.7 Phương pháp flow cytometry 20  2.2.8 Phương pháp microarray 21   2.2.9 Phương pháp real-time RT-PCR 22  KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 25  TUYỂN CHỌN CÁC BÀI THUỐC CÓ TÁC ĐỘNG KHÁNG PHÂN BÀO 25  THU NHẬN DỊCH CHIẾT TỪ BÀI THUỐC 27  SÀNG LỌC CÁC CAO CHIẾT DỰA VÀO TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO TRÊN BA DỊNG TẾ BÀO UNG THƯ NUÔI CẤY IN VITRO 27  NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÀM NGỪNG CHU TRÌNH TẾ BÀO VÀ CẢM ỨNG APOPTOSIS CỦA BÀI THUỐC BT3 TRÊN DÒNG TẾ BÀO HELA 33  4.1 Khả làm ngừng phân bào thuốc BT3 dòng tế bào HeLa 33  4.2 Khả cảm ứng apoptosis BT3 dòng tế bào HeLa 35  4.2.1 Kết thử nghiệm caspase 36  4.2.2 Quan sát biến đổi hình thái tế bào apoptosis 37  4.2.3 Phân tích phân mảnh DNA gene 38  NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO VÀ CẢM ỨNG APOPTOSIS CỦA TỪNG VỊ TRONG SỐ VỊ CỦA BÀI THUỐC BT3 TRÊN DÒNG TẾ BÀO HELA 39  5.1 Kết sàng lọc độc tính tế bào vị thuốc BT3 39  5.2 Kết xác định giá trị IC50 nước sắc vị 43  5.3 Kết xác định khả cảm ứng apoptosis vị có độc tính tế bào cao thuốc BT3 45  5.3.1 Kết xác định hoạt tính caspase-3 45  5.3.2 Kết thử nghiệm DNA phân mảnh 46  5.3.3 Kết quan sát kính hiển vi huỳnh quang tế bào HeLa xử lí với nước sắc Hoàng liên Hoàng cầm 47  KHẢO SÁT BIỂU HIỆN TỔNG THỂ CỦA CÁC GENE Ở TẾ BÀO HELA XỬ LÝ VỚI BÀI THUỐC - XÁC ĐỊNH CÁC GENE ĐÁP ỨNG VỚI THUỐC 49  XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO BÀI THUỐC BT3 VÀ CÁC VỊ 53  7.1 Hoàng liên 53  7.2 Hoàng cầm 57  7.3 Hoàng bá 60  7.4 Bạch thược 63  7.5 Chi tử 66  7.6 Xây dựng TCCS cao toàn phần 69  XÂY DỰNG “DẤU VÂN TAY HÓA HỌC” VÀ “DẤU VÂN TAY SINH HỌC” CỦA BÀI THUỐC BT3 75  8.1 Xây dựng “dấu vân tay hóa học” kỹ thuật HPLC 76  8.2 Xây dựng “dấu vân tay sinh học” 78  KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 83  TÀI LIỆU THAM KHẢO 100  PHỤ LỤC 105  7.1 CƠ SỞ DỮ LIỆU CỦA BÀI THUỐC 105  7.2 DỮ LIỆU KHẢO SÁT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC DỊCH CHIẾT NƯỚC BÀI THUỐC TRÊN DỊNG TẾ BÀO NI CẤY 133  7.3 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ CÁC GIÁ TRỊ APOPTOSIS 137  7.4 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ GIÁ TRỊ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO (IC50) APOPTOSIS CỦA CÁC VỊ TRONG BT3 140  7.5 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THƠ MICROARRAY SỰ BIỂU HIỆN GENE 142  7.6 KẾT QUẢ REALIME-PCR ĐỊNH LƯỢNG 192  7.7 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH “dấu vân tay hóa học” BẰNG KỸ THUẬT HPLC 198  DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Thuật ngữ AIF Apoptosis-Inducing Factor: nhân tố cảm ứng apoptosis AO acridine orange ATF4 Activating transcription factor BAX B-cell lymphoma-extra large BCL-2 B-cell lymphoma BSA Bovine serum albumin Cdc2 cell division cycle Cdc25C cell division cycle 25 homolog C CEBPB CCAAT/enhancer-binding protein beta CHOP Cyclophosphamide, Hydroxydaunorubicin (doxorubicin), Oncovin (vincristine), and Prednisone/prednisolone COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Bệnh tắt nghẽn phổi mãn tính Cpt Camptothecin CREB3L2 cAMP responsive element binding protein 3-like CRYAB crystallin, alpha B Ct Cycle Threshold: Chu kỳ ngưỡng CYP4F11 cytochrome P450, family 4, subfamily F, polypeptide 11 DDIT3 DNA damage-inducible transcript 3: DEVD Asp-Glu-Val-Asp DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxiribonucleic acid E’MEM môi trường Eagle’s Minimum Essential Medium EB ethidium bromide EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EIF2A Eukaryotic translation initiation factor 2A i FAM129A Family with sequence similarity 129, member A FBS Fetal Bovine Serum FDA Food and Drug Administration: Cục quản lý Thuốc Thực phẩm Hoa Kỳ GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenease: GDF15 Growth differentiation factor 15 HeLa tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2 tế bào ung thư quản HepG2 tế bào ung thư gan HL-60LNCaP tế bào ung thư ruột kết HPLC High-Performance Liquid Chromatography: sắc ký lỏng cao áp IC50 Inhibitory concentration of 50% growth: nồng độ ức chế 50% tăng trưởng tế bào ISR Integrated Stress Response: KB tế bào ung thư biểu bì MCF-7 tế bào ung thư vú mRNA RNA thơng tin MTT 3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide NCCAM National Center for Complementary and Alternative Medicine: Trung tâm Y học cổ truyền Quốc gia Hoa Kỳ NCI National Cancer Institute: Viện Ung thư Hoa Kỳ NCI-H460 tế bào ung thư phổi NUPR1 nuclear protein, transcriptional regulator, OD Opticcal density: Mật độ quang PBS Phosphate buffered saline pf Primer forward: mồi xuôi PI propidium iodide pr Primer reverse: mồi ngược ii RD tế bào ung thư Rf Rate of flow RNA ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcriptase-polymerase chain reaction SERPINE Serpine peptidase inhibitor, member SRB Sulforhodamine B STC2 Stanniocalcin STD Standard deviation: độ lệch chuẩn TRIB3 Tribbles homolog WHO World Health Organization: Tổ chức Y tế Thế giới YHCT Y học cổ truyền iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng - Tác dụng theo Đông y Tây y vị thuốc 25  Bảng - Tỉ lệ (%) ức chế tăng trưởng thuốc nồng độ 10% (v/v) dòng tế bào ung thư 28  Bảng - Kết xác định IC50 thuốc dòng tế bào HeLa 28  Bảng 4- Kết IC50 thuốc dòng tế bào MCF-7 29  Bảng - Kết IC50 thuốc dòng tế bào NCI-H460 31  Bảng - Tỉ lệ % tế bào pha chu trình phân bào xử lý với BT3 35  Bảng - Kết thử nghiệm caspase tế bào HeLa cảm ứng với thuốc BT3 với thời gian cảm ứng khác 36  Bảng 8- Tỉ lệ % ức chế tăng trưởng (I %) vị thuốc nồng độ 10% dòng tế bào HeLa 40  Bảng - Giá trị IC50 nước sắc Hoàng liên, Hoàng cầm, Hoàng bá, Bạch thược, Chi tử dòng tế bào HeLa 43  Bảng 10 - Kết thử nghiệm caspase-3 nước sắc Hoàng liên, Hoàng cầm, Hoàng bá Bạch thược 45  Bảng 11- Kết phân tích microarray số gene tăng biểu tế bào HeLa xử lý với thuốc BT3 52  Bảng 12 - Kết độ ẩm Hoàng Liên 55  Bảng 13 - Kết tro toàn phần Hoàng Liên 55  Bảng 14 - Kết tro không tan HCl Hoàng Liên 55  Bảng 15 - Kết định lượng Hoàng Liên 57  Bảng 16- Kết độ ẩm Hoàng cầm 58  Bảng 17 - Kết tro toàn phần Hoàng cầm 58  Bảng 18 - Kết tro không tan HCl Hoàng cầm 58  Bảng 19 - Kết định lượng hoàng cầm 59  Bảng 20- Kết độ ẩm Hoàng bá 60  Bảng 21 - Kết tro toàn phần Hoàng bá 61  Bảng 22 - Kết tro khơng tan HCl Hồng bá 61  Bảng 23 - Kết định lượng Hoàng bá 63  Bảng 24 - Kết độ ẩm Bạch thược 64  Bảng 25 - Kết tro toàn phần Bạch thược 64  Bảng 26 - Kết tro không tan HCl Bạch thược 64  Bảng 27 - Kết định lượng Bạch thược 65  Bảng 28 - Kết độ ẩm Chi tử 67  Bảng 29 - Kết tro toàn phần Chi tử 67  Bảng 30 - Kết tro không tan HCl Chi tử 67  Bảng 31- Kết định lượng Chi tử 68  Bảng 32 - Kết độ ẩm cao toàn phần 69  Bảng 33 - kết tro toàn phần cao toàn phần 69  Bảng 34- Hàm lượng berberin cao toàn phần 75  Bảng 35 - Hàm lượng baicalin cao toàn phần 75  Bảng 36 - Thời gian lưu phần trăm hàm lượng/hàm lượng tổng mũi lặp lại mẫu nước sắc thuốc ứng với lần nấu khác 77  Bảng 37 - Các mồi sử dụng phản ứng real-time RT-PCR với gene nghiên cứu 79  Bảng 38 - Kết nhiệt độ nóng chảy sản phẩm PCR gene 80  Bảng 39 - Giá trị Ct thay đổi biểu mức mRNA số gene phân tích kỹ thuật realtime-PCR bán định lượng 81  iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình - Các dòng tế bào sử dụng đề tài 13  Hình 2: Nguyên lý phương pháp phân tích DNA gene 19  Hình - Biểu đồ histogram biểu diễn tần số giá trị FL2-H tế bào giai đoạn subG1, G0/G1, S G2/M 21  Hình - Nguyên lý microarray 21  Hình - Nguyên lý phương pháp realtime RT-PCR sử dụng SYBRGreen 23  Hình - Tác động ức chế tăng trưởng thuốc dòng tế bào HeLa 29  Hình - Tác động ức chế tăng trưởng thuốc dịng tế bào MCF-7 30  Hình 8- Tác động ức chế tăng trưởng thuốc dịng tế bào NCI-H460 32  Hình - Tỉ lệ tế bào sống mẫu xử lý với BT3 phụ thuộc thời gian cảm ứng thuốc 33  Hình 10 - Biểu đồ histogram mẫu chứng mẫu cảm ứng thuốc thời điểm cảm ứng thuốc khác 34  Hình 11 - Kết quan sát kính hiển vi huỳnh quang (400 X) tế bào HeLa có khơng có xử lý thuốc 37  Hình 12 - Kết điện di gel agarose DNA gene 38  Hình 13- Hình thái tế bào HeLa sau 48 nuôi cấy lô chứng (400X) 41  Hình 14 - Hình thái tế bào HeLa sau 48 nuôi cấy lô thử nghiệm(400X) 42  Hình 15 - Đồ thị so sánh giá trị IC50 vị toàn thuốc 44  Hình 16 - Kết thử nghiệm phân mảnh DNA tế bào HeLa sau 40 cảm ứng với nước sắc Hoàng liên Hoàng cầm 47  Hình 17 - Hình ảnh tế bào HeLa mẫu chứng (A, B) xử lí với Hồng cầm Hồng liên (C, D, E, F) sau 15 24 KHV huỳnh quang(400X) 48  Hình 18 - Mức độ biểu số gene xác định kỹ thuật real-time RT-PCR 52  Hình 19 - Kết soi bột Hoàng Liên 54  Hình 20 - Kết sắc ký đồ Hồng liên 56  Hình 21 - Kết soi bột Hoàng Cầm 57  Hình 22 - Kết sắc ký đồ Hoàng cầm 59  Hình 23 - Kết soi bột Hoàng bá 60  Hình 24 - Kết sắc ký đồ Hoàng bá 62  Hình 25 - Kết soi bột Bạch thược 63  Hình 26 - Kết sắc ký đồ Bạch thược 65  Hình 27 - Kết soi bột Chi tử 66  Hình 28- Kết sắc ký đồ Chi tử 68  Hình 29 - Kiểm tra diện nguyên liệu Hoàng liên cao toàn phần 70  Hình 30 - Kiểm tra diện nguyên liệu Hoàng bá cao toàn phần 71  Hình 31 - Kiểm tra diện nguyên liệu Hoàng cầm cao toàn phần 72  Hình 32 - Kiểm tra diện nguyên liệu Chi tử cao toàn phần 73  Hình 33 - Kiểm tra diện nguyên liệu Bạch thược cao tồn phần 74  Hình 34 - Kết HPLC ba lần lặp thuốc BT3 77  v PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu khả kháng phân bào thực nghiệm số thuốc cổ truyền dân gian mức độ tế bào phân tử Chủ nhiệm đề tài/dự án:PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Tp.HCM Thời gian thực hiện: 18 tháng Kinh phí duyệt: 565.749.000 Kinh phí cấp: theo TB số: 131 TB-SKHCN ngày 27/08/2008 Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), 80% dân cư nước phát triển điều trị y học cổ truyền, đặc biệt với phương thuốc làm từ chất chiết thực vật Khoảng 3/4 thuốc có nguồn gốc thảo mộc sử dụng giới bắt nguồn từ phương thuốc cổ truyền 25% số thuốc đại có nguồn gốc từ thuốc dân gian sử dụng từ lâu Tuy nhiên, theo đánh giá nhiều tổ chức y tế giới, YHCT có số nhược điểm cần khắc phục Chính mà năm 2002, WHO công bố kế hoạch phương hướng phát triển YHCT, với điểm : (1) Phát triển sách quốc gia đánh giá kiểm định YHCT, (2) Xây dựng sở vững để chứng minh tính an tồn, hiệu chất lượng sản phẩm YHCT, (3) Đảm bảo nguồn cung cấp đầy đủ ổn định nguyên liệu cho YHCT, (4) Khuyến khích việc sản xuất tiêu thụ sản phẩm YHCT, (5) Sưu tầm bảo quản kiến thức thuốc dân gian Các nước có YHCT phát triển Trung Quốc, Ấn Độ, đầu tư mạnh vào nghiên cứu ứng dụng lĩnh vực Trong vòng năm qua, Trung Quốc đầu tư 740 triệu nhân dân tệ (92,5 triệu đô la Mỹ) cho nghiên cứu phát triển YHCT Trong số bệnh có khuynh hướng tăng dần với mức độ phát triển xã hội tiểu đường, béo phì, tim mạch, ung thư dạng ngày trở thành vấn đề lớn lĩnh vực Sức khỏe cộng đồng Tỉ lệ mắc tử vong ung thư giới tăng 22% so với năm 1990 Bên cạnh việc tìm kiếm hoạt chất mới, khả sử dụng phối hợp nhiều hoạt chất biết nhằm tạo hiệu cộng hưởng cách tiếp cận thực tế mang tính khả thi cao Nguyên lý YHCT phù hợp với cách nhìn đại Điều chứng tỏ qua số lượng tăng dần cơng trình nghiên cứu YHCT, đặc biệt YHCT Trung Quốc, tính riêng lĩnh vực điều trị Probe Set ID Control Control Control BT 36h BT 36h BT 36h 36h 36h 36h 3 Gene Symbol mRNA Accession 7984353 8.742 8.469 8.768 7.570 7.427 7.502 SMAD6 NM_005585 8061564 7893724 9.516 6.196 9.552 5.678 9.801 6.167 8.680 4.486 8.377 4.983 8.300 ID1 5.018 NM_181353 7988467 8.733 8.624 8.659 7.467 7.482 7.502 FBN1 NM_000138 184 GO Biological Process ID GO Cellular Component Term GO Molecular Function Term exp transcription factor activity // signal transducer activity // receptor signaling protein serine/threonine kinase signaling protein activity // protein binding // protein binding // transforming intracellular // growth factor beta GO:0006350 // nucleus // receptor, inhibitory GO:0006355 // transcription factor cytoplasmic GO:0007179 complex mediator activity 0.4 GO:0006357 // GO:0007275 // protein binding // GO:0016481 // transcription GO:0043433 nucleus // nucleus repressor activity 0.4 0.4 transmembrane receptor activity // extracellular matrix structural constituent // extracellular matrix structural constituent // microfibril // binding // calcium extracellular region ion binding // // basement calcium ion binding GO:0001501 // membrane // // calcium ion GO:0007507 // extracellular space binding // protein GO:0007596 // membrane binding 0.4 Probe Set ID 8049123 7893388 8104570 8037283 Control Control Control BT 36h BT 36h BT 36h 36h 36h 36h 3 8.186 3.659 6.900 7.664 8.202 3.725 6.852 7.869 8.548 4.457 7.008 8.103 7.150 2.440 5.841 6.923 7.052 2.888 5.724 6.433 Gene Symbol mRNA Accession 7.162 ALPP NM_001632 2.933 5.609 FAM105A BC011524 6.687 PSG4 NM_002780 7923332 6.108 6.097 6.262 5.292 4.759 4.806 TNNT2 NM_000364 7960438 8.231 8.302 8.574 7.507 6.853 7.127 TMEM16B NM_020373 7959102 9.597 9.642 9.793 8.437 8.478 8.450 HSPB8 NM_014365 8109044 6.879 6.910 6.967 5.667 5.852 5.567 SPINK6 NM_205841 7953765 9.663 9.601 9.952 8.664 8.487 8.392 FAM80B NM_020734 185 GO Biological Process ID GO:0008152 GO Cellular Component Term plasma membrane // cell surface // integral to membrane // anchored to membrane GO Molecular Function Term magnesium ion binding // alkaline phosphatase activity // zinc ion binding // hydrolase activity - - - 0.4 0.4 0.4 - 0.4 actin binding // tropomyosin binding // troponin C binding // troponin I binding 0.4 GO:0006952 GO:0007565 GO:0008016 GO:0030049 GO:0032780 GO:0032781 GO:0051592 GO:0055010 - extracellular region // // extracellular space // // // // // troponin complex membrane // integral to membrane protein serine/threonine kinase activity // GO:0006950 // cellular_component identical protein GO:0008150 // intracellular binding serine-type endopeptidase extracellular region inhibitor activity nucleotide binding // catalytic activity // ATP binding // manganese ion binding // metal GO:0006464 ion binding exp 0.4 0.4 0.4 0.4 Probe Set ID 8037272 Control Control Control BT 36h BT 36h BT 36h 36h 36h 36h 3 6.338 6.303 7.197 7912646 10.289 10.084 10.699 8173522 3.285 3.902 2.482 7893957 4.928 4.198 4.817 7893355 5.059 5.503 5.177 7955441 6.817 6.802 6.998 7960947 8.256 8.037 8.280 8068397 6.530 6.323 6.595 8180197 10.879 10.982 11.109 5.490 9.681 2.016 4.877 1.363 5.388 7.238 5.048 9.829 5.371 8.740 1.865 2.519 4.931 5.629 6.616 5.335 9.546 Gene Symbol 5.266 PSG7 8.828 CASP9 1.956 2.649 5.513 mRNA Accession NM_002783 GO:0007565 GO:0006508 GO:0006915 GO:0008632 GO:0008635 NM_001229 GO:0042981 ENST000003632 - 5.641 METTL7A NM_014033 6.748 A2M 5.087 9.594 GO Biological Process ID GO:0008152 GO:0006886 GO:0007584 GO:0010037 GO:0051260 NM_000014 GO:0051384 ENST000003410 - 186 // // // // // // // // GO Cellular Component Term GO Molecular Function Term extracellular region // extracellular space // integral to membrane molecular_function protein binding // protein binding // enzyme activator activity // cysteinetype peptidase activity // caspase activity // caspase intracellular activity - methyltransferase activity // transferase activity serine-type endopeptidase inhibitor activity // protein transmembrane transporter activity // wide-spectrum protease inhibitor activity // enzyme binding // interleukin-8 binding // interleukin-1 binding // tumor necrosis factor extracellular region binding - exp 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 Probe Set ID 8049128 Control Control Control BT 36h BT 36h BT 36h 36h 36h 36h 3 8.125 8.173 8.126 7.083 6.637 Gene Symbol 6.694 ALPPL2 mRNA Accession NM_031313 7960919 9.185 9.095 9.204 7.832 7.870 7.769 MFAP5 8117594 7893465 8.211 4.524 8.587 5.059 8.593 4.157 7.145 4.157 7.206 1.950 7.006 HIST1H2B NM_003521 3.519 7987315 7896023 6.803 3.588 6.563 4.565 7.116 4.074 5.284 2.774 5.672 2.403 5.359 ACTC1 2.882 NM_003480 NM_005159 187 GO Biological Process ID GO Cellular Component Term GO Molecular Function Term magnesium ion binding // alkaline phosphatase plasma membrane activity // zinc ion GO:0008152 // // anchored to binding // GO:0016310 membrane hydrolase activity microfibril // extracellular region // proteinaceous extracellular matrix // extracellular space nucleosome // nucleosome // GO:0006334 // nucleus // GO:0006334 chromosome GO:0006915 GO:0006936 GO:0008016 GO:0030240 GO:0031032 GO:0055003 GO:0055008 // // // // cytoplasm // // cytoskeleton // // actin filament // I band extracellular matrix structural constituent DNA binding // DNA binding nucleotide binding // protein binding // ATP binding // structural constituent of muscle exp 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 Probe Set ID Control Control Control BT 36h BT 36h BT 36h 36h 36h 36h 3 Gene Symbol mRNA Accession 8103769 6.581 6.725 6.800 5.313 5.005 5.515 HPGD NM_000860 8015821 7.036 7.007 7.092 5.619 5.532 5.656 MEOX1 NM_004527 8040103 7.067 6.758 7.239 5.610 5.621 5.458 ID2 NM_002166 188 GO Biological Process ID GO Cellular Component Term GO Molecular Function Term prostaglandin E receptor activity // binding // 15hydroxyprostagland in dehydrogenase (NAD+) activity // GO:0006629 // 15GO:0006631 // hydroxyprostagland GO:0006693 // in dehydrogenase GO:0007179 // (NAD+) activity // GO:0007565 // oxidoreductase GO:0007567 // activity // protein GO:0008152 // cellular_component homodimerization GO:0019372 // // cytoplasm // activity // NAD GO:0045786 cytosol binding molecular_function // DNA binding // transcription factor GO:0006355 // activity // GO:0007275 // cellular_component sequence-specific GO:0008150 // nucleus DNA binding GO:0000122 // GO:0007275 // GO:0007507 // GO:0016481 // protein binding // GO:0043353 // protein binding // GO:0043433 // nucleus // nucleus transcription GO:0045651 // cytoplasm repressor activity exp 0.4 0.4 0.4 Probe Set ID Control Control Control BT 36h BT 36h BT 36h 36h 36h 36h 3 Gene Symbol mRNA Accession 8177222 7893440 6.136 3.255 6.287 2.459 6.696 3.027 5.209 0.901 4.832 2.198 4.701 CD24 1.194 NM_013230 8041467 7.411 7.295 7.458 6.203 5.611 5.901 VIT NM_053276 7939314 7951662 6.107 6.142 6.088 6.334 6.256 6.396 4.592 4.796 4.598 4.865 4.767 EHF 4.660 CRYAB NM_012153 NM_001885 189 GO Biological Process ID GO:0001666 // GO:0001775 // GO:0001959 // GO:0002237 // GO:0002768 // GO:0007204 // GO:0007274 // GO:0008629 // GO:0016055 // GO:0016337 // GO:0016477 // GO:0030856 // GO:0031295 // GO:0032597 // GO:0032600 // GO:0032913 // GO:0042104 // GO:0042325 // GO:0042632 // GO:0043406 // GO:0043408 // GO:0043627 // GO:0045730 // GO:0048488 GO:0006350 GO:0007275 GO:0008283 GO:0030855 GO:0045893 GO:0006457 GO:0006916 GO:0006936 GO:0007169 GO:0007601 GO:0032387 // // // // GO Cellular Component Term GO Molecular Function Term plasma membrane // external side of plasma membrane // anchored to membrane // anchored to external side of plasma membrane // membrane raft signal transducer activity // protein binding // protein kinase binding // carbohydrate binding // protein tyrosine kinase activator activity extracellular region transcription factor activity // protein binding // sequence-specific nucleus DNA binding // // // // // nucleus // cytoplasm structural constituent of eye lens // unfolded protein binding exp 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 Probe Set ID Control Control Control BT 36h BT 36h BT 36h 36h 36h 36h 3 Gene Symbol mRNA Accession GO Biological Process ID GO Cellular Component Term GO Molecular Function Term 7995868 9.347 9.696 9.439 7.954 7.987 7.892 SLC12A3 NM_000339 7913655 9.431 9.448 9.866 8.249 8.020 7.781 ID3 NM_002167 8103494 6.964 6.802 7.109 5.536 4.990 4.994 NPY1R NM_000909 8154229 5.753 5.419 6.184 4.158 3.708 4.019 INSL4 NM_002195 transporter activity // symporter activity membrane fraction // sodium:chloride GO:0006811 // // integral to symporter activity GO:0006814 // plasma membrane // sodium ion GO:0006821 // membrane binding GO:0000122 // GO:0006275 // GO:0007275 // GO:0007507 // GO:0009611 // transcription GO:0016481 // corepressor activity GO:0030182 // // transcription GO:0030855 // factor binding // GO:0043065 // protein domain GO:0043433 nucleus // nucleus specific binding rhodopsin-like GO:0006006 // receptor activity // GO:0007165 // peptide YY receptor GO:0007187 // activity // GO:0007193 // pancreatic GO:0007218 // polypeptide GO:0007626 // plasma membrane receptor activity // GO:0007631 // // integral to receptor activity // GO:0008217 // plasma membrane neuropeptide Y GO:0019233 // // integral to receptor activity // GO:0040014 membrane protein binding GO:0007165 // GO:0007267 // extracellular region insulin-like growth GO:0007275 // // extracellular factor receptor GO:0007565 // space // soluble binding // hormone GO:0008283 fraction activity 7938225 7.731 7.606 7.787 5.959 5.723 5.793 OLFML1 NM_198474 - 190 extracellular region - exp 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 Probe Set ID 8090180 7895700 7895713 7895611 8180366 8180367 Control Control Control BT 36h BT 36h BT 36h 36h 36h 36h 3 9.577 3.259 6.479 7.447 5.977 5.977 9.420 4.565 5.715 7.229 5.584 5.584 9.527 4.370 5.177 5.899 7.050 7.050 7.642 1.363 4.535 0.647 4.489 4.489 7.512 1.571 5.393 7.043 4.298 4.298 Gene Symbol 7.627 MUC13 3.507 1.571 6.929 3.357 3.357 mRNA Accession NM_033049 GO Biological Process ID - 8129105 5.878 5.746 5.906 3.714 3.218 3.420 RP11-259PXM_001723259 GO:0016192 8168622 8.283 8.100 8.336 5.893 5.423 5.679 KLHL4 NM_019117 191 - GO Cellular GO Molecular Component Term Function Term extracellular region // plasma membrane // integral to membrane - endoplasmic reticulum // Golgi apparatus cytoplasm // cytoskeleton actin binding // protein binding exp 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 7.6 KẾT QUẢ REALIME-PCR ĐỊNH LƯỢNG 7.6.1 Trình tự mồi Bảng trình tự mồi Ký hiệu mồi Trình tự pf CYP4F11 GCCTCAGGATCCCACCCTCCAT pr CYP4F11 ATGTGGTCACCAGCTGGGTCAATGT pf CRYAB GCCGCCCCTTCTTTCCT pr CRYAB GCTCTCCGAAGAACTGGTCAA pf CD24 TGCTCCTACCCACGCAGATT pr CD24 GGCCAACCCAGAGTTGGAA pf NUPR1 CGCTGAGACAGAGCTGGAGAT pr NUPR1 CTCCGCAGTCCCGTCTCTATT pf BAX pr BAX pf BCL-2 pr BCL-2 TCCCCCCGAGAGGTCTTTT CGGCCCCAGTTGAAGTTG TTGGCCCCCGTTGCTT CGGTTATCGTACCCCGTTCTC Nguồn Wang Y cộng Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 2010 Jan;38(1):100-7 Link CD Neurobiology of aging 2003;24(3):397-413 Kaipparettu BA.International journal of cancer 2008 Jul;123(1):66 Mulvey L Molecular medicine (Cambridge, Mass.) 2007;13(12):69-78 Masahide Ikeguchi cs, 2002 7.6.2 Kết Ct realtime RT-PCR C24H GADPH TRIB3 DDIT3 STC2 SERPINE2 FAM129A GDF15 23.97 37.02 24.48 33.96 31.04 33.08 33.05 Lan BT24H 25.93 36.46 22.77 32.8 29.29 31.64 31.36 exp 1.0 5.7 12.7 8.7 13.1 10.6 5.3 C24H 24.78 39.03 24.3 36.15 32.1 35.37 33.44 192 Lan BT24H 24.49 36.2 23.37 32.56 29.34 30.84 30.65 exp 1.0 5.8 5.7 9.8 19.6 18.9 5.7 C24H 24.17 36.73 23.97 33.74 32 32.71 30.94 Lan BT24H 24.43 34.21 21.14 29.33 27.54 29.03 29.03 exp 1.0 6.9 8.5 8.7 26.4 15.3 4.5 7.6.3 Kết giải trình tự blast 7.6.3.1 Gene GAPDH 7.6.3.2 Gene TRIB3 193 7.6.3.3 Gene DDIT3 194 7.6.3.4 Gene STC2 7.6.3.5 Gene SERPINE2 195 7.6.3.6 Gene FAM129A 196 7.6.3.7 Gene GDF15 197 7.7 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH “dấu vân tay hóa học” BẰNG KỸ THUẬT HPLC Bảng Bảng số liệu kết HPLC với ba mẫu nước sắc thuốc ứng với ba lần nấu khác Lần Lần Lần 198