1. Trang chủ
  2. » Giáo Dục - Đào Tạo

(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin

371 0 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Tiêu đề Nghiên Cứu Tổng Hợp, Thiết Lập Chất Chuẩn Và Tạp Chuẩn Dùng Trong Kiểm Nghiệm Terazosin
Tác giả Đỗ Thị Thanh Thủy
Người hướng dẫn PGS.TS. Đoàn Cao Sơn, GS.TS. Nguyễn Hải Nam
Trường học Trường Đại Học Dược Hà Nội
Chuyên ngành Dược Học
Thể loại luận án tiến sĩ
Năm xuất bản 2019
Thành phố Hà Nội
Định dạng
Số trang 371
Dung lượng 10,47 MB

Cấu trúc

  • CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN (20)
    • 1.1. TỔNG QUAN VỀ TERAZOSIN (20)
      • 1.1.1. Đặc điểm cấu tạo của terazosin (20)
      • 1.1.2. Tính chất (20)
      • 1.1.3. Các tạp chất của terazo sin (20)
      • 1.1.4. Tác dụng dược lý (22)
      • 1.1.5. Chỉ định, liều dùng (22)
      • 1.1.6. Tác dụng không mong muốn (22)
      • 1.1.7. Các sản phẩm chứa terazosin lưu hành trên thị trường (22)
      • 1.1.8. Một số phương pháp tổng hợp terazosin (23)
      • 1.1.9. Tình hình thiết lập chất chuẩn terazosin trên thế giới (27)
    • 1.2. TỔNG QUAN VỀ TẠP CHẤT A CỦA TERAZOSIN (28)
      • 1.2.1. Thông tin chung về tạp chất A của terazosin theo USP (28)
      • 1.2.2. Quy định về giới hạn tạp chất A của terazosin trong một số dược điển (28)
      • 1.2.3. Một số phương pháp tổng hợp tạp chất A của terazosin và các chất có cấu trúc tương t ự (29)
      • 1.2.4. Tình hình thiết lập tạp chuẩn A của terazosin trên thế giới (31)
    • 1.3. TỔNG QUAN VỀ TẠP CHẤT B CỦA TERAZOSIN THEO USP (32)
      • 1.3.1. Một số thông tin chung về tạp chất B của terazosin (32)
      • 1.3.2. Quy định về giới hạn tạp chất B của terazosin trong một số dược điển (32)
      • 1.3.3. Một số phương pháp tổng hợp các chất có cấu trúc tương tự tạp chất B của terazosin (32)
      • 1.3.4. Tình hình thiết lập tạp chuẩn B của terazosin trên thế g iớ i (34)
    • 1.4. TỔNG QUAN VỀ TẠP CHẤT C CỦA TERAZOSIN THEO USP (35)
      • 1.4.1. Một số thông tin chung về tạp chất C của terazosin (35)
      • 1.4.2. Quy định về giới hạn tạp chất C của terazosin trong một số dược điển (36)
      • 1.4.4. Tình hình thiết lập tạp chuẩn C của terazosin trên thế g iớ i (37)
    • 1.5. TỔNG QUAN VỀ KIỂM NGHIỆM TERAZOSIN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT A, B, C CỦA TERAZOSIN (38)
      • 1.5.1. T ổng quan về kiểm nghiệm terazosin (38)
      • 1.5.2. Một số phương pháp phân tích tạp chất A của terazosin (42)
      • 1.5.3. Một số phương pháp phân tích tạp chất B của terazosin (44)
      • 1.5.4. Một số phương pháp phân tích tạp chất C của terazosin (44)
      • 1.5.5. Nhận xét chung về tình hình kiểm nghiệm terazosin và phân tích các tạp chất A, B, C của terazosin trên thế giới (45)
    • 1.6. TỔNG QUAN VỀ CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU (46)
      • 1.6.1. Khái niệm về chất chuẩn đối chiếu (46)
      • 1.6.2. Vai trò của chất chuẩn đối chiếu (46)
      • 1.6.3. Phân loại chất chuẩn đối chiếu (47)
      • 1.6.4. Tình hình thiết lập chất chuẩn đối chiếu hóa học tại Việt Nam (0)
      • 1.6.5. Quy trình thiết lập chất chuẩn đối chiếu DĐVN (48)
    • 1.7. TỔNG QUAN VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH NGUYÊN LIỆU HÓA DƯỢC (50)
      • 1.7.1. Độ đặc hiệu đối với phép thử định lượng và thử tạp chất (51)
      • 1.7.2. Độ tuyến tính (51)
      • 1.7.3. Độ đúng (Accuracy) (52)
      • 1.7.4. Độ chính xác (Precision) (52)
      • 1.7.5. Khoảng xác định (53)
      • 1.7.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) (53)
  • CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (54)
    • 2.1. NGUYÊN LIỆU (54)
      • 2.1.1. Chất chuẩn, tạp chuẩn (54)
      • 2.1.2. Nguyên liệu (54)
      • 2.1.3. Dung môi, hóa chất (55)
    • 2.2. TRANG THIẾT B Ị (55)
    • 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (56)
      • 2.3.1. Phương pháp tổng h ợ p (56)
      • 2.3.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được (58)
      • 2.3.3. Phương pháp phân tích cấu trúc của các sản phẩm tổng hợp được (58)
      • 2.3.4. Phương pháp kiểm nghiệm các sản phẩm TEZ, IAT, IBT và ICT (59)
      • 2.3.5. Các phương pháp kiểm nghiệm viên nén T EZ (60)
      • 2.3.6. Các phương pháp xử lý số liệu (61)
  • CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU (63)
    • 3.1. TỔNG HỢP TERAZOSIN VÀ CÁC TẠP CHẤT A, B, C (63)
      • 3.1.1. T ổng hợp terazosin hydroclorid (63)
      • 3.1.2. T ổng hợp tạp chất A của terazosin (65)
      • 3.1.3. T ổng hợp tạp chất B của terazosin (71)
      • 3.1.4. Tổng hợp tạp chất C của terazosin (76)
    • 3.2. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG CHO CÁC NGUYÊN LIỆU TỔNG HỢP ĐƯỢC (82)
      • 3.2.1. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu terazosin hydroclorid (82)
      • 3.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu tạp A (82)
      • 3.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu tạp B (92)
      • 3.2.4. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu tạp C (105)
    • 3.3. THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN TERAZOSIN VÀ CÁC TẠP CHUẨN A, B, C CỦA TERAZOSIN (116)
      • 3.3.1. Xây dựng các thường qui kỹ thuật thiết lập các chất chuẩn, tạp chuẩn (117)
      • 3.3.2. Thiết lập chất chuẩn terazosin hydroclorid (117)
      • 3.3.3. Thiết lập tạp chuẩn A (120)
      • 3.3.4. Thiết lập tạp chuẩn B (124)
      • 3.3.5. Thiết lập tạp chuẩn C (128)
      • 3.3.6. Đánh giá độ ổn định của các sản phẩm chất chuẩn, tạp chuẩn thiết lập được (131)
      • 3.3.7. Sử dụng các chất chuẩn, tạp chuẩn thiết lập được trong kiểm nghiệm terazosin (135)
  • CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN (138)
    • 4.1. VỀ TỔNG HỢP CÁC NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN, TẠP CHUẨN (138)
      • 4.1.1. Bàn luận chung về các quy trình tổng hợp các nguyên liệu thiết lập chuẩn 121 4.1.2. v ề quy trình tổng hợp terazosin hydroclorid (138)
      • 4.1.3. v ề quy trình tổng hợp tạp A (140)
      • 4.1.4. Về quy trình tổng hợp tạp B (142)
      • 4.1.5. Về quy trình tổng hợp tạp C (144)
    • 4.2. VỀ CẤU TRÚC CỦA CÁC SẢN PHẨM (145)
      • 4.2.1. Về cấu trúc của sản phẩm terazosin hydroclorid (145)
      • 4.2.2. Về cấu trúc của sản phẩm tạp A (147)
      • 4.2.3. Về cấu trúc của sản phẩm tạp B (149)
      • 4.2.4. Về cấu trúc của sản phẩm tạp C (151)
    • 4.3. VỀ VIỆC XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG CHO CÁC NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN (153)
      • 4.3.1. Về tiêu chuẩn chất lượng của các sản phẩm (153)
      • 4.3.2. Bàn luận chung về phương pháp phân tích các sản phẩm IAT, IBT, ICT (154)
      • 4.3.3. Về xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu tạp A (155)
      • 4.3.4. Về xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu tạp B (157)
      • 4.3.5. Về xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu tạp C (158)
    • 4.4. VỀ THIẾT LẬP CÁC CHẤT CHUẨN, TẠP CHUẨN (160)
      • 4.4.1. Về quy trình thiết lập chất chuẩn, tạp chuẩn (160)
      • 4.4.2. Về độ ổn định của các sản phẩm (161)
    • 4.5. VỀ ỨNG DỤNG CÁC SẢN PHẨM CHẤT CHUẨN, TẠP CHUẨN THIẾT LẬP ĐƯỢC TRONG KIỂM NGHIỆM (163)

Nội dung

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ TERAZOSIN

- Công thức phân tử: C 19 H 25 N 5 O 4 HCI

- Công thức cấu tạo: Hình 1.1. o n h 2

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của terazosin

- Tên khoa học: 1-(4-Amino-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)-4-(tetrahydro-2- furoyl)piperazin monohydrochlorid [48], [60], [89], [90].

- Trong USP đưa ra 2 dạng dược dụng của terazosin là loại terazosin hydroclorid khan ( ptl: 423,89 đvC) và terazosin hydroclorid ngậm 2 phân tử nước (ptl: 459,92 đvC) [90].

1.1.2 Tính chất Tính chất: tinh thể màu trắng, không mùi, ít tan trong methanol và nước, rất ít tan trong ethanol 96% và cloroform, thực tế không tan trong aceton [60], [89].

1.1.3 Các tạp chất của terazosin Terazosin có nhiều tạp chất Các tạp chất của terazosin được định danh trong các dược điển không hoàn toàn giống nhau Theo USP đưa ra các tạp chất liên quan gồm tạp A, tạp B, tạp C, tạp 1-[(tetrahydro-2-furanyl)carbonyl]piperazin và tạp acid tetrahydro-2-furancarboxylic [90] Theo BP và EP đưa ra 10 tạp chất liên quan là các tạp A, B, C, E, J, K, L, M, N, O [48], [89] Theo Dược điển Hàn Quốc, cũng có qui định về chỉ tiêu tạp chất liên quan I, II III của terazosin, tạp 1-[(tetrahydro-2- furanyl)carbonyl]piperazin và tạp acid tetrahydro-2-furancarboxylic [60] Trong đó, tạp chất A theo USP tương đương với tạp chất C theo BP và tạp chất I theo KP Tạp chất B theo USP tương đương với tạp chất B theo BP và tạp chất II theo KP Tạp chất

C theo USP tương đương với tạp chất E theo BP và tạp chất III theo KP Tạp 1- [(tetrahydro-2-furanyl)carbonyl]piperazin theo USP tương đương tạp N của BP (Bảng 1.1).

Bảng 1.1 Tạp chất của terazosin theo một số dược điển

Công thức câu tạo Tên tạp theo

Tên tạp theo BP và EP

Tên tạp theo KP Ghi chú r ^ \

EP là dạng base o r ~ 'jN' V >

Acid tetrahydro-2- furancarboxylic nh2 CH3 ° Y Y ^ N

Ghi chú: Dấu (-) là không đề cập

1.1.4 Tác dụng dược lý Terazosin là thuốc ức chế a1-adrenergic, gây giãn cơ trơn động mạch, tuyến tiền liệt và cổ bàng quang Giãn cơ trơn động mạch làm giảm huyết áp Giãn cơ trơn quanh cổ bàng quang làm tăng lưu lượng nước tiểu, giúp giảm tắc nghẽn nước tiểu do phì đại tuyến tiền liệt Ngoài ra TEZ còn làm giảm cholesterol toàn phần và LDL- cholesterol [9], [10], [35], [36], [44], [79].

1.1.5 Chỉ định, liều dùng Terazosin được chỉ định để điều trị đồng thời cả hai bệnh là phì đại lành tính tuyến tiền liệt và tăng huyết áp Tăng huyết áp sử dụng liều 1 mg trước lúc đi ngủ, có thể tăng liều hàng tuần đến lúc đạt liều duy trì, liều duy trì thường từ 1 - 5 mg/ngày Phì đại lành tính tuyến tiền liệt sử dụng liều 1 mg trước lúc đi ngủ, liều duy trì 5 - 10 mg/ngày [9], [10], [35], [36], [44], [79], [98].

1.1.6 Tác dụng không mong muốn

- Hội chứng hạ huyết áp liều đầu gây choáng váng, ngất.

- Nhẹ và thoáng qua: Ngủ gà, hạ huyết áp tư thế, mệt mỏi, phù, nhịp nhanh, đánh trống ngực, đau ngực, tăng cân, thở nông.

- Hiếm gặp: Đau cơ, nhìn mờ, nghẹt mũi, đau dạ dày, giảm khoái cảm, bất lực [9],

1.1.7 Các sản phẩm chứa terazosin lưu hành trên thị trường Terazosin là một thuốc được sử dụng rộng rãi ở các nước ASEAN và trên thế giới

Terazosin có nhiều biệt dược khác nhau, đa số được bào chế dưới dạng viên nén với hàm lượng 1, 2, 5 và 10 mg (Bảng 1.2 và Hình 1.2).

Bảng 1.2 Một số viên nén chứa terazosin trên thế giới

TT Biệt dược Hàm lượng Hãng sản xuât Nước sản xuât l Hytrin l mg, 2 mg, S mg Abbott Ản Độ

2 Vicard-T 2 mg Abbott Ản Độ

S Teraz l mg, 2 mg, S mg Unichem

4 Olyster l mg, 2 mg, S mg Zydus Alidac Ản Độ

Pharmaceuticals Ản Độ ổ Terakare 2 mg Medley

9 Unoter 2 mg, S mg Pharmacia India Ản Độ lO Apo-Terazosin 2 mg, lO mg Apotex Mỹ l l Terazosab l mg, 2 mg,

PI-Pharma Bỉ l2 Terazosine EG 2 mg, S mg, lO mg Eurogenerics Bỉ lS Terazosine Sandoz S mg, lO mg Sandoz Đức

Hình 1.2 Một số biệt dược chứa terazosin

1.1.8 Một số phương pháp tổng hợp terazosin

Phương pháp tổng hợp terazosin của Manoury P.M và cộng sự

Phương pháp tổng hợp terazosin đầu tiên được Manoury.P.M và cộng sự công bố, sử dụng hai nguyên liệu chính là iV-benzylpiperazin và 4-amino-2-cloro-6,7-dimethoxyquinazolin (ACDQ) Mặc dù phương pháp này hiệu quả, nó cũng có nhược điểm là cần thực hiện bước tách nhóm benzyl thông qua phản ứng hydrogen hóa, sử dụng khí hydro dễ cháy nổ và Pd-C, một hóa chất có giá thành cao.

Việc triển khai quy trình sản xuất ở quy mô công nghiệp gặp nhiều khó khăn, đặc biệt liên quan đến an toàn và chi phí Bên cạnh đó, nguyên liệu ban đầu cần được tổng hợp từ piperazin, với các bước xử lý bao gồm pyridin ở 130 °C trong 30 phút, methanol dưới áp suất thường, và DMF.

Hình 1.3 Sơ đồ tổng hợp terazosin của Manoury P.M và cộng sự

1.1.8.2 Phương pháp tổng hợp terazosin của Winn M và cộng sự

Winn M và cộng sự đã phát triển một phương pháp tổng hợp terazosin từ acid tetrahydrofuroic, trong đó sử dụng chất trung gian ACDQ Tuy nhiên, việc áp dụng các tác nhân như SOCh hay oxalyl clorid gặp khó khăn khi triển khai ở quy mô công nghiệp, do acyl clorid là chất acyl hóa mạnh, dễ dẫn đến sự hình thành dẫn chất diamid ở giai đoạn 2, làm giảm hiệu suất của quy trình tổng hợp Các bước trong quy trình bao gồm việc sử dụng SOCh hoặc oxalyl clorid với DCM hoặc benzen, sau đó là pyridin trong điều kiện đun hồi lưu, và cuối cùng là methanol cũng trong điều kiện đun hồi lưu.

Hình 1.4 Sơ đồ tổng hợp terazosin của Winn M và cộng sự

1.1.8.3 Phương pháp tổng hợp terazosin của Karimian K và cộng sự

Karimian K và cộng sự đã đưa ra phương pháp tổng hợp TEZ khác (Hình 1.5)

Trong phương pháp này, tác giả sử dụng HNCO, một tác nhân dễ gây cháy nổ, cùng với dung môi độc hại pyridin Quá trình thực hiện bao gồm các bước: a) sử dụng HNCO; b) tiến hành đun hồi lưu với pyridin; c) thêm POCl3 hoặc PCl5, sau đó kết hợp với NH3/pyridin và tiếp tục đun hồi lưu.

Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp terazosin của Karimian K và cộng sự

1.1.8.4 Phương pháp tổng hợp terazosin của Penthala N.R và cộng sự

Penthala N.R và cộng sự đã đưa ra phương pháp tổng hợp terazosin theo sơ đồ (Hình 1.6) [75].

Hình 1.6 Sơ đồ tổng hợp terazosin của Penthala N.R và cộng sự

1.1.8.5 Phương pháp tổng hợp terazosin của Schwartz E và cộng sự

Schwartz E và cộng sự đã phát triển một phương pháp tổng hợp terazosin hydroclorid dihydrat thông qua quá trình đun hồi lưu ACDQ với 1-(2-tetrahydrofuroyl)-piperazin ở nhiệt độ từ 35 đến 55 °C, sử dụng các dung môi phân cực như butanol, ethanol hoặc cyclohexan.

Sau đó, để nguội để kết tinh sản phẩm (Hình 1.7) [77]

Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp terazosin của Schwartz E và cộng sự

1.1.8.6 Phương pháp tổng hợp terazosin của Mannino A và cộng sự

Mannino A và cộng sự đã phát triển một phương pháp tổng hợp terazosin từ ACDQ bằng cách cho ACDQ phản ứng với N-(2-tetrahydrofuroyl)-piperazin trong dung môi phân cực khan, tạo ra terazosin base Sau đó, họ tiến hành đun nóng hồi lưu dung dịch terazosin base trong ethanol với HCl đặc ở nhiệt độ 70 °C để thu được terazosin hydroclorid.

Hình 1.8 Sơ đồ tổng hợp terazosin của Mannino A và cộng sự

1.1.8.7, Phương pháp tổng hợp đồng phân R(+) TEZ.HCl của Kyncl J.J và cộng sự

Kyncl J J và cộng sự đã đưa ra qui trình tổng hợp đồng phân R(+) TEZ.HCl [62]

1.1.8.8 Tổng hợp terazosin tại Việt Nam

Terazosin hydroclorid lần đầu tiên được Nguyễn Hải Nam và cộng sự tổng hợp tại Việt Nam vào năm 2010 (Hình 1.10) [19]. n h 2 n h 2

Hóa chất và điều kiện: a) CH 3 OH, H 2 SO 4 , 25 - 35 °C/4 giờ, 98,7%, b) Piperazin,

CH 3 COOH 5%/dioxan, đun hồi lưu 12 giờ, hiệu suất 88,0%, c) dioxan, hồi lưu 12 giờ, hiệu suất 71,6% d) HCl/EtOH; TEA, ethyl acetat, 60 - 65 °C, hiệu suất 94,6%.

Hình 1.10 Sơ đồ tổng hợp terazosin tại Việt Nam

1.1.9 Tình hình thiết lập chất chuẩn terazosin trên thế giới Trên thị trường đã có chất chuẩn terazosin do Hội đồng dược điển Mỹ (USPRS) và một số công ty thiết lập được với giá khá cao (khoảng gần 400 $ cho lọ khoảng

200 mg chuẩn) Tuy nhiên, một số hãng phân phối chất chuẩn terazosin USPRS, một số hãng không công không công bố hàm lượng chất chuẩn này (Bảng 1.3) [109], [110],

Bảng 1.3 Thông tin về chất chuẩn terazosin trên thế giới

TT Nơi phân phối, sản xuất

Mã sản phẩm Lô Giá thành

Khôi lượng đóng gói (mg)

1 Hội đồng dược điển Mỹ

Ghi chú: Dấu (-) là không đề cập

TỔNG QUAN VỀ TẠP CHẤT A CỦA TERAZOSIN

- Công thức phân tử: C 14 H 19 N 5 O 2 2HCl.

- Công thức cấu tạo: Hình 1.11

- Tên khoa học: 6,7-dimethoxy-2-(piperazin-1-yl)quinazolin-4-amin dihydroclorid

Hình 1.11 Công thức cấu tạo tạp chất A của terazosin theo USP

- Tạp chất A là một trong số các sản phẩm phân hủy của terazosin và doxazosin [41],

Hình 1.12 Phương trình phân hủy terazosin tạo ra tạp chất A

Theo quy định của USP 40, giới hạn tạp chất A trong terazosin hydroclorid không vượt quá 0,3%, trong khi đó giới hạn cho viên nén và viên nang terazosin là không quá 0,4% Tương tự, BP 2017 và EP 9.0 quy định giới hạn tạp chất A trong terazosin hydroclorid là không quá 0,5%, mặc dù chưa có chuyên luận về thành phẩm chứa terazosin KP 10 cũng quy định giới hạn tương tự như USP 40 cho nguyên liệu và viên nén terazosin, nhưng chưa có chuyên luận cho viên nang terazosin (Bảng 1.4) [48], [60], [89], [90].

Bảng 1.4 Quy định về giới hạn tạp chất A của terazosin trong 1 số dược điển

Dược điển Nguyên liệu TEZ Viên nén TEZ Viên nang TEZ

Ghi chú: Dấu (-) là không đề cập

1.2.3 Một số phương pháp tổng hợp tạp chất A của terazosin và các chất có cấu trúc tương tự

1.2.3.1 Tổng hợp tạp chất A dạng base của Nageswara R R và cộng sự

Trong nghiên cứu này, tác giả mô tả quy trình tổng hợp tạp chất A dạng base, được gọi là impurity VI, từ 0,5 g (0,33 mol) 4-amino-2-cloro-6,7-dimethoxyquinazolin (ACDQ) và 0,7 g (0,4 mol) piperazin trong 100 ml IAM, khuấy và hồi lưu trong 72 giờ Sau khi giảm nhiệt độ xuống 80 °C, sản phẩm thu được có độ tinh khiết 97,8% Tuy nhiên, tỷ lệ mol giữa ACDQ và piperazin không khớp với khối lượng phản ứng được nêu, và thời gian phản ứng không được chia rõ cho từng giai đoạn Độ tinh khiết của sản phẩm cũng không được xác định bằng phương pháp cụ thể, thiếu so sánh với chuẩn gốc và không đề cập đến các tiêu chí như độ ẩm và giới hạn tạp chất Quy trình kết tinh bằng 2-propanol cũng chưa được mô tả chi tiết.

Hình 1.14 Sơ đồ tổng hợp tạp A dạng base của Nageswara R.R và cộng sự

1.2.3.2 Tổng hợp dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp chất A của Yokoyama K và cộng sự Đun hồi lưu 0,63 g 2-cloro-6,7-dimethoxyquinazolin và 0,7 g piperazin khan trong

Trong quá trình thực hiện, 15 ml IAM được xử lý trong 2 giờ, sau đó tiến hành cất quay trong chân không để loại IAM Tiếp theo, chiết xuất bằng NaOH 2 N và CHCh, thu lấy lớp CHCh, rửa bằng nước muối bão hòa và làm khô bằng MgSO4 khan Cuối cùng, cất quay loại CHCh trong chân không, thu được 0,7 g sản phẩm với hiệu suất đạt 91,0%.

Hình 1.15 trình bày sơ đồ tổng hợp dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp A của Yokoyama K và cộng sự Phương pháp này tạo ra sản phẩm với cấu trúc chỉ khác IAT ở một nhóm NH2, với các điều kiện phản ứng tương tự như phương pháp tổng hợp IAT base của Nageswara R R và cộng sự, nhưng có sự khác biệt về tỷ lệ mol các chất phản ứng, thể tích IAM sử dụng và thời gian phản ứng.

I.2.3.3 Tổng hợp dẫn chất tương tự tạp A của Naik P P.

Naik P P đã thực hiện phản ứng tổng hợp dẫn chất thế vào vị trí số 4 của ACDQ thông qua phản ứng thế với dẫn chất piperazin trong DMF, khuấy ở nhiệt độ 100°C cho đến khi phản ứng hoàn tất Quy trình này áp dụng chung cho các dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp chất A, với mỗi nhóm R khác nhau tạo ra sản phẩm khác nhau Tuy nhiên, các điều kiện phản ứng chi tiết như tỷ lệ chất tham gia, thời gian phản ứng và phương pháp tinh chế sản phẩm chưa được cung cấp.

Hình 1.16 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp A của Naik P P.

I.2.3.4 Tổng hợp dẫn chất tương tự tạp A của Campbell S F và cộng sự

Campbell S F và cộng sự đã tổng hợp dẫn chất thế vào vị trí số 4 của ACDQ bằng cách đun hồi lưu hỗn hợp ACDQ và dẫn chất piperazin trong ô-butanol, khuấy ở nhiệt độ từ 70-150 °C trong 25 giờ Qui trình này có thể áp dụng cho các dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp chất A, tuy nhiên mỗi nhóm R khác nhau sẽ tạo ra sản phẩm khác nhau, do đó chưa có điều kiện phản ứng cụ thể Nhiệt độ phản ứng hiện tại chỉ là khoảng gợi ý từ 70-150 °C.

Trên thị trường hiện nay, tạp chuẩn A của terazosin đã được Hội đồng dược điển Mỹ và một số công ty thiết lập với mức giá cao khoảng 1000 USD cho lọ vài chục mg Một số hãng phân phối tạp chuẩn A USPRS nhưng không công bố hàm lượng cụ thể Trong số các tạp chuẩn A trên thế giới, hầu hết các công ty chỉ thiết lập dạng tạp A base, trong khi chỉ có Hội đồng dược điển Mỹ thiết lập tạp chuẩn dạng muối kết hợp với acid HCl.

Bảng 1.5 Thông tin về tạp chuẩn A của terazosin trên thế giới

TT Nơi phân phối, sản xuất

Mã sản phẩm Lô Giá thành

Khôi lượng đóng gói (mg)

1 Hội đồng dược điển Mỹ

Ghi chú: Dấu (-) là không đề cập

TỔNG QUAN VỀ TẠP CHẤT B CỦA TERAZOSIN THEO USP

- Công thức phân tử: C 19 H 24 N 4 O 5 Công thức cấu tạo: Hình 1.18.

- Tên khoa học: 1-(4-Hydroxy-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)-4-[(tetrahydro-2- furanyl)carbonyl]piperazin [60], [90].

Hình 1.18 Công thức cấu tạo tạp chất B của terazosin theo USP

1.3.2 Quy định về giới hạn tạp chất B của terazosin trong một số dược điển USP 40 quy định giới hạn tạp chất B không được quá 0,1% trong nguyên liệu terazosin hydroclorid, không quá 0,4% trong viên nén và viên nang terazosin Tạp này được quy định theo BP 2017 và EP 9.0 là không quá 0,1% trong nguyên liệu terazosin hydroclorid (BP 2017 và EP 9.0 chưa có chuyên luận thành phẩm chứa terazosin) KP 10 quy định giới hạn tạp này trong nguyên liệu và trong viên nén chứa terazosin tương tự như USP 40 (KP 10 chưa có chuyên luận viên nang terazosin) (Bảng 1.6) [48], [60], [89], [90].

Bảng 1.6 Quy định về giới hạn tạp chất B của terazosin trong 1 số dược điển

Dược điển Nguyên liệu TEZ Viên nén TEZ Viên nang TEZ

Ghi chú: Dấu (-) là không đề cập

1.3.3 Một số phương pháp tổng hợp các chất có cấu trúc tương tự tạp chất B của terazosin

Tạp chất B của terazosin là một dẫn chất phenol, có cấu trúc chứa một nhóm OH phenol Các dẫn chất phenol này được tổng hợp thông qua nhiều phương pháp khác nhau.

1.3.3.1 Tổng hợp dẫn chất phenol từ amin thơm qua giai đoạn tạo muôi diazoni

Chất phenol được tổng hợp bằng cách cho amin thơm bậc nhất phản ứng với acid nitro trong dung dịch nước, dưới sự hiện diện của một acid vô cơ mạnh như HCl.

H2SO4 và HNO3 có khả năng tạo ra muối diazoni Do HNO2 không ổn định, người ta thường tạo ra nó ngay trong hỗn hợp phản ứng bằng cách cho NaNO2 phản ứng với acid vô cơ Sau đó, bằng cách đun nóng dung dịch muối diazoni ở nhiệt độ từ 50 đến 80 °C hoặc đun sôi, phenol sẽ được thu được.

Ar NH2 + Na N0 2 + 2HX — Ar I NENỊx - A r — OH

Trong quá trình tổng hợp dẫn chất phenol từ amin thơm, thường sử dụng diazoni sulfat để tránh các phản ứng phụ, như việc hình thành dẫn chất aryl halogenid khi dùng diazoni halogenid.

1.3.3.2 Tổng hợp dẫn chất của phenol từ phản ứng thủy phân amin

Phenol có thể được tổng hợp thông qua phản ứng thủy phân arylamin trong môi trường acid hoặc trung tính Đặc biệt, phản ứng này diễn ra hiệu quả trong môi trường acid khi có mặt các chất như ZnCl2, HCl, BF3, H2SO4 hoặc H3PO4, và yêu cầu nhiệt độ rất cao.

Hình 1.20 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất phenol từ phản ứng thủy phân arylamin

1.3.3.3 Tổng hợp phenol từ các ether oxyd của phenol

Tổng hợp phenol bằng phản ứng dealkyl hóa các ether oxyd của phenol [6]

1.3.3.4 Tổng hợp phenol từ aryl halogenid

Khi các dẫn chất halogen của vòng thơm được thủy phân trong môi trường kiềm, chúng sẽ tạo ra phenol Phản ứng của các aryl clorid thường được xúc tác bởi muối CuCl2 hoặc BaCl2.

Hình 1.21 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất phenol từ aryl halogenid

Một số dẫn chất phenol thơm có thể được tổng hợp từ các dẫn chất iodid của vòng thơm, sử dụng xúc tác đồng và dung môi là hỗn hợp DMSO và nước với tỷ lệ 1:1.

Hình 1.22 Sơ đồ tổng hợp dãy dẫn chất phenol từ dẫn chất iodid

1.3.3.5 Tổng hợp phenol từ acid aryl sulfonic

Phenol có thể được tổng hợp bằng phản ứng nung chảy acid aryl sulfonic với kiềm ở nhiệt độ lên tới 300 °C (Hình 1.23) [6], [76]. f03H

Hình 1.23 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất phenol từ acid aryl sulfonic

1.3.3.6 Tổng hợp dẫn chất phenol từ amin thơm xúc tác NaHSO 3

Các nhóm amin của naphthylamin có thể được thay thế bằng nhóm hydroxy thông qua xúc tác bisulphit (NaHSO3) trong môi trường nước Tuy nhiên, phạm vi phản ứng này rất hạn chế, vì các nhóm amin (NH2 hoặc NHR) cần phải nằm trên naphthalen hoặc vòng phenanthren.

Hình 1.24 Phản ứng tổng hợp dẫn chất phenol từ amin thơm xúc tác NaHSO3

1.3.4 Tình hình thiết lập tạp chuẩn B của terazosin trên thế giới Trên thế giới việc thiết lập tạp chuẩn B của terazosin cũng được một số hãng dược phẩm phát triển với giá thành khá cao (khoảng 1000 USD cho lọ cỡ vài chục mg tạp chuẩn) Tuy nhiên, một số hãng phân phối tạp chuẩn B USPRS, một số không công bố hàm lượng tạp chuẩn này (Bảng 1.7) [107], [111], [112], [113], [116].

Bảng 1.7 Thông tin về tạp chuẩn B của terazosin trên thế giới

TT Nơi phân phối, sản xuất

Mã sản phẩm Lô Giá thành

Khôi lượng đóng gói (mg)

Ghi chú: Dấu (-) là không đề cập

TỔNG QUAN VỀ TẠP CHẤT C CỦA TERAZOSIN THEO USP

- Công thức phân tử: C24H28N8O4 2HCl

- Công thức cấu tạo: Hình 1.25

- Tên khoa học: 1,4-Bis(4-amino-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)piperazin, dihydroclorid [60], [90].

Hình 1.25 Công thức cấu tạo của tạp chất C theo USP

1.4.2 Quy định về giới hạn tạp chất C của terazosin trong một số dược điển USP 40 quy định tạp chất C không được quá 0,4 % trong nguyên liệu terazosin hydroclorid, không quá 0,4% trong viên nén và viên nang terazosin Tạp này được quy định theo BP 2017 là không quá 0,5 % trong nguyên liệu terazosin hydroclorid (BP 2017 chưa có chuyên luận thành phẩm chứa terazosin) KP 10 quy định giới hạn tạp này trong nguyên liệu và trong viên nén chứa terazosin tưng tự như USP 40 nhưng

KP 10 chưa có chuyên luận viên nang terazosin (Bảng 1.8) [48], [60], [89], [90].

Bảng 1.8 Quy định về giới hạn tạp chất C của terazosin trong 1 số dược điển

Dược điển Nguyên liệu TEZ Viên nén TEZ Viên nang TEZ

Ghi chú: Dấu (-) là không đề cập

1.4.3 Một số phương pháp tổng hợp các chất có cấu trúc tương tự tạp chất C của terazosin

Một số công bố về các phương pháp tổng hợp dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp

C có thể được sản xuất từ nguyên liệu đầu vào là tạp A hoặc ACDQ Quy trình tinh chế của C khá phức tạp, bao gồm việc sử dụng cả phương pháp sắc ký cột và HPLC, cùng với phương pháp kết tinh trong dung môi.

1.4.3.1 Tổng hợp các dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp chất C từ ACDQ

Chất tương tự tạp C của TEZ, được gọi là 4-Amino-6,7-dimethoxy-2-[4-(6-hydroxypyridazin-3-yl)piperazin] quinazolin, đã được tổng hợp thông qua phản ứng giữa ACDQ và 5-(6-hydroxypyridazin-3-yl)piperazin hydrobromid trong ô-butanol dưới điều kiện đun hồi lưu.

Hình 1.26 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp C từ tạp ACDQ

I.4.3.2 Tổng hợp các dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp chất C từ tạp A sử dụng hỗn hợp dung môi n-pentanol và n-butanol

Một dẫn chất tương tự tạp C của TEZ, 4-Amino-6,7-dimethoxy-2-[4-(6-cloropyridazin-3-yl)piperazin] quinazolin, đã được tổng hợp bởi Campbell S F và cộng sự Quá trình tổng hợp diễn ra bằng cách cho tạp A dạng base phản ứng với 3-cloro-6-methoxy-pyridazin trong hỗn hợp ô-pentanol và ô-butanol hồi lưu.

Hình 1.27 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp C từ tạp A sử dụng

I.4.3.3 Tổng hợp các dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp chất C từ tạp A sử dụng dung môi n-butanol

Campbell S F và cộng sự đã tổng hợp dẫn chất tương tự tạp C của TEZ, cụ thể là 4-Amino-6,7-dimethoxy-2-[4-(4-phenylpyrimidin-2-yl)piperazin] quinazolin, bằng cách cho tạp A dạng base tác dụng với cloro-4-phenylpyrimidin trong ô-butanol hồi lưu.

Hình 1.28 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất có cấu trúc tương tự tạp C từ tạp A sử dụng

1.4.4 Tình hình thiết lập tạp chuẩn C của terazosin trên thế giới Trên thị trường đã có tạp chuẩn C của terazosin do Hội đồng dược điển Mỹ và một số công ty thiết lập được với giá thành khá cao (khoảng gần 1000 USD cho lọ cỡ vài chục mg tạp chuẩn) Tuy nhiên, một số hãng phân phối tạp chuẩn C USPRS, một số không công bố hàm lượng tạp chuẩn này Trong số các tạp chuẩn C được thiết lập trên thế giới, đa số các công ty thiết lập dạng tạp C base, chỉ có Hội đồng dược điển Mỹ và hãng Chemical book mới thiết lập tạp chuẩn C dạng muối kết hợp với acid HCl hỗn hợp dung mụi ô-pentanol và ô-butanol dung mụi ô-butanol

Bảng 1.9 Thông tin về tạp chuẩn C của terazosin trên thế giới

TT Nơi phân phối, sản xuất

Mã sản phẩm Lô Giá tiền Khối lượng đóng gói (mg)

H0M084 1000 $ 50 95,0 Tạp C dạng muối kết hợp HCl

89159 Tạp C dạng muối kết hợp HCl

Ghi chú: Dấu (-) là không đề cập

TỔNG QUAN VỀ KIỂM NGHIỆM TERAZOSIN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT A, B, C CỦA TERAZOSIN

1.5.1 Tổng quan về kiểm nghiệm terazosin

1.5.1.1 Kiểm nghiệm nguyên liệu terazosin

Một số dược điển quy định phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu TEZ, trong đó sử dụng chất chuẩn TEZ và các tạp chuẩn IAT, IBT, ICT Chỉ tiêu định tính được thực hiện bằng IR và HPLC, trong khi chỉ tiêu định lượng cũng phải sử dụng chất chuẩn TEZ Để xác định tạp chất liên quan, cần sử dụng các tạp chuẩn IAT, IBT và ICT.

[60], [89], [90] Ngoài ra, phương pháp định lượng nguyên liệu TEZ do Ferretti R và cộng sự đưa ra có sử dụng tạp chuẩn B và tạp chuẩn C (Bảng 1.10) [51].

Bảng 1.10 Một số phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu TEZ

Chất chuẩn, tạp chuẩn sử dụng Điều kiện tiến hành

[60], [90] Định tính IR TEZ Đo IR từ 3800 - 650 cm -1 Định tính HPLC TEZ 10 ^g/ml Detector UV 254 nm

Cột C8, 30 °C Pha động: MeCN - dung dịch đệm citrat pH 3,2 (1685 : 315) Định lượng

Xác định tạp chất liên quan

IAT 2,0 ^g/ml IBT 2,0 ^g/ml ICT 2,0 ^g/ml

[48], [89] Định tính IR TEZ Đo IR từ 4000 - 400 cm -1

HPLC ICT 50 ^g/ml Detector UV 254 nm

Cột C8, 30 °C Pha động: MeCN - dung dịch đệm citrat - TEA (350 : 1650: 2)

TEZ 8,76 - 26,28 ^g/ml IBT, ICT không rõ nồng độ

Detector UV 238 nm Cột Chiralpak IC, 20 - 40 °C Pha động: MeOH - DEA (100: 0,1)

Kiểm nghiệm viên nén và viên nang TEZ cần tuân thủ một số tiêu chuẩn kỹ thuật (TLTK) quan trọng, bao gồm việc sử dụng chất chuẩn TEZ để thực hiện các chỉ tiêu định tính, định lượng, độ hòa tan và giới hạn tạp chất, như được thể hiện trong Bảng 1.11.

Bảng 1.11 Một số phương pháp kiểm nghiệm viên TEZ rri • y\

Chất chuẩn, tạp chuẩn sử dụng Điều kiện tiến hành

[60], [90] Định tính UV TEZ 5 ^g /ml Đo phổ UV từ 200 - 400 nm Định tính HPLC TEZ 10 ^g/ml Detector UV 254 nm

Cột C18, 30 °C Pha động: MeCN - nước - acid acetic : DeA (600: 300: 10: 0,2) Định lượng HPLC TEZ 55 ^g/ml

HPLC TEZ 3 ^g/ml Detector UV 246 nm, Cột C18

Pha động: MeCN - dung dịch đệm phosphat pH 3,0 (6: 19) Độ hòa tan UV TEZ 6 ^g/ml Đo quang ở 245 nm TCNSX

Abbott [34] Định tính HPLC TEZ 20 ^g/ml Detector UV 246 nm, Cột C18

Pha động: MeCN - MeOH - dung dịch đệm citrat (15: 5: 80) Định lượng HPLC TEZ 20 ^g/ml Đồng đều hàm lượng

HPLC TEZ 20 ^g/ml Độ hòa tan UV TEZ

Phát hiện vêt: 254 nm Pha động: CHCỈ 3 - toluen - MeOH (9: 1: 6)

TLTK [80], [105] Định lượng HPLC TEZ

Detector UV huỳnh quang Bước sóng kích thích: 238 nm Bước sóng phát xạ: 370 nm

Cột ODS Pha động: N 2 HPO 4 0,01 M - MeCN - THF (76 : 22 : 2) TLTK

[81] Định lượng Tạo màu đo quang

Bước sóng 415 nm Thuốc thử tạo màu: xanh bromophenol

TLTK [78] Định lượng Tạo màu đo quang

Bước sóng 455 nm Thuốc thử tạo màu: DDQ TLTK

[64] Định lượng Đo điện thế

TLTK [52] Định lượng Đo điện thế

1.5.1.3 Định lượng đồng thời terazosin và một số thuốc ức chế a1-adrenergic trong thành phẩm

Một số TLTK công bố các phương pháp phân tích đồng thời TEZ và các thuốc ức chế a1-adrenergic cần sử dụng đến chất chuẩn TEZ (Bảng 1.12).

Bảng 1.12 Một số phương pháp định lượng đồng thời TEZ và các thuốc ức chế a l- adrenergic

TT Hoạt chất định lượng

Chất chuẩn Điều kiện tiến hành TLTK

Bản mỏng silica gel 60 F 254 Phát hiện vết: UV 254 nm Pha động: CHCI 3 - MeOH (9,5: 0,5)

2 TEZ + PRA + ALF + DOX + FIN

Bản mỏng silica gel 60 F 254 Phát hiện vết: UV 254 nm;

220 nm Pha động: CHCl 3 - MeOH (9,5: 0,5)

Pha động: (MeCN và DEA) - MeOH - amoni acetat 10 mM tỷ lệ thay đổi theo thời gian

Pha động: MeCN - DEA - MeOH - amoni acetat

10 mM - nước tỷ lệ thay đổi theo thời gian

Bước sóng kích thích: 337 nm Bước sóng phát xạ: 430 nm

7 TEZ + ALF TAM + DOX + SIL Điện di mao quản

Detector UV 245 nm Cột mao quản 53,8 cm, 75^m Điện thế: 28 kV

1.5.1.4 Định lượng terazosin trong dịch sinh học

Phân tích TEZ trong dịch sinh học cũng cần sử dụng chất chuẩn TEZ (Bảng 1.13)

Bảng 1.13 Một số phương pháp định lượng TEZ trong dịch sinh học

Chất chuẩn Điều kiện tiến hành TLTK

1 Huyết tương và nước tiểu

Detector huỳnh quang Bước sóng kích thích: 250 nm Bước sóng phát xạ: 370 nm Cột C18

Pha động: Na 2 HPŨ 4 10 mM - MeCN

- THF (76: 22 :2), pH = 6,5 Tốc độ: 1 ml/phút

2 Huyết tương và nước tiểu

Detector huỳnh quang Bước sóng kích thích:250 nm Bước sóng phát xạ: 370 nm Cột C18, nhiệt độ cột: 50 °C Pha động: N 2 HPO 4 10 mM - MeCN

- THF (76: 22 :2), pH = 6,5 Tốc độ: 1,3 ml/phút

3 Mẫu nghiên cứu dược động học

Pha động: KH 2 PO 4 0,01 M - MeCN

Cột ODS Pha động: dung dịch đệm N 2 HPO 4

25 mM pH = 2,7 và MeOH (tỷ lệ thay đổi theo thời gian)

1.5.2 Một số phương pháp phân tích tạp chất A của terazosin Một số phương pháp phân tích tạp chất A của terazosin được công bố trong đó tạp

Trong nghiên cứu, nguyên liệu TEZ và hoạt chất doxazosin (DOX) đều yêu cầu sử dụng tạp chuẩn IAT, vì IAT cũng là một tạp chất có mặt trong DOX.

Phương pháp xác định tạp chất A trong thành phẩm TEZ sử dụng chất chuẩn TEZ để tính kết quả, trong khi phương pháp định lượng nguyên liệu IAT của LGC không sử dụng chất chuẩn IAT Do đó, kết quả từ phương pháp chuẩn hóa diện tích hàm lượng sẽ kém tin cậy hơn so với phương pháp định lượng có sử dụng chất chuẩn.

Bảng 1.14 Một số phương pháp phân tích tạp chất A của terazosin

Chất chuẩn Điều kiện tiến hành TLTK

Detector UV 254 nm, Cột C8, 30 °C Pha động: MeCN - dung dịch đệm citrat pH 3,2 (1685 : 315)

HPLC TEZ có chứa IAT

Pha động: MeCN - dung dịch đệm citrat - TEA (350: 1650' 2)

Detector UV 254 nm, cột C8 Pha động: MeCN - isopropanol - dung dịch đệm citrat 0,05 M pH 4,4

Cột C18, 20 - 40 °C Detector UV 220 nm và detector khối phổ QDa

Pha động: MeCN - MeOH - NH 3 1% tỷ lệ thay đổi theo thời gian

Cột C18, 35 °C Detector UV 210 nm Pha động: MeCN - nước - H 3 PO 4 5% tỷ lệ thay đổi theo thời gian.

Cột ZrO 2 -BS, 60 °C Detector UV 250 nm Pha động: MeCN - amoni phosphat 20 mM pH 9,0 tỷ lệ thay đổi theo thời gian

Cột C8, 40 °C Detector UV 245 nm Pha động: dung dịch đệm tetramethylamoni hydroxid pentahydrat và natri heptansulphonat (pH = 5) - MeOH tỷ lệ thay đổi theo thời gian

8 Viên nén, viên nang TEZ

Detector UV 246 nm Cột C18 Pha động: MeCN - dung dịch đệm phosphat pH 3 (6: 19)

Ghi chú: Dấu (-) là không đề cập

1.5.3 Một số phương pháp phân tích tạp chất B của terazosin Một số phương pháp phân tích tạp chất B của terazosin được công bố trong đó phương pháp xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu TEZ cần sử dụng tạp chuẩn IBT Ngoài ra, phương pháp xác định tạp chất B trong thành phẩm TEZ sử dụng chất chuẩn TEZ để tính kết quả, phương pháp định lượng chính nguyên liệu IBT của LGC không sử dụng chất chuẩn IBT mà tính kết quả bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích kết quả hàm lượng sẽ kém tin cậy hơn phương pháp định lượng có sử dụng chất chuẩn IBT (Bảng 1.15).

Bảng 1.15 Một số phương pháp phân tích tạp chất B của terazosin

Chất chuẩn Điều kiện tiến hành TLTK

Pha động: MeCN - dung dịch đệm citrat pH 3,2 (1685 : 315)

HPLC TEZ có chứa IBT

Pha động: MeCN - dung dịch đệm citrat - TEA (350 : 1650: 2)

Cột C18, 20 - 40 °C Detector UV 220 nm và detector khối phổ QDa

Pha động: MeCN - MeOH - dung dịch NH 3 1% tỷ lệ thay đổi theo thời gian

Pha động: MeCN - dung dịch H3PO4

5 Viên nén, viên nang TEZ

Detector UV 246 nm, cột C18 Pha động: MeCN - dung dịch đệm phosphat pH 3 (6: 19)

Ghi chú: Dấu (-) là không đề cập

1.5.4 Một số phương pháp phân tích tạp chất C của terazosinMột số phương pháp phân tích tạp chất C của terazosin được công bố, trong đó tạp C được xác định trong nguyên liệu TEZ và nguyên liệu của 1 hoạt chất khác là doxazosin đều cần sử dụng tạp chuẩn ICT vì ICT cũng là 1 tạp chất của DOX Ngoài ra, phương pháp xác định tạp chất A trong thành phẩm TEZ sử dụng chất chuẩn TEZ để tính kết quả, phương pháp định lượng chính nguyên liệu ICT của LGC không sử dụng chất chuẩn ICT mà tính kết quả bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích kết quả hàm lượng sẽ kém tin cậy hơn phương pháp định lượng có sử dụng chất chuẩn ICT (Bảng 1.16).

Bảng 1.16 Một số phương pháp phân tích tạp chất C của terazosin

Chất chuẩn Điều kiện tiến hành TLTK

Pha động: MeCN - dung dịch đệm citrat pH 3,2 (1685 : 315)

Pha động: MeCN - dung dịch đệm citrat: tEa (350: 1650: 2)

Detector UV 220 nm và detector khối phổ QDa

Cột C18, 20 - 40 °C Pha động: MeCN - MeOH - dung dịch NH3 1% (tỷ lệ thay đổi theo thời gian)

Pha động: MeCN - dung dịch amoni acetat 10 mM pH 4,0 (33: 67)

Pha động: MeCN - nước - H 3 PO 4 0,1% tỷ lệ thay đổi theo thời gian

7 Viên nén, viên nang TEZ

Detector UV 246 nm, cột C18 Pha động: MeCN - dung dịch đệm phosphat pH 3 (6: 19)

Ghi chú: Dấu (-) là không đề cập

1.5.5 Nhận xét chung về tình hình kiểm nghiệm terazosin và phân tích các tạp chất A, B, C của terazosin trên thế giới

Trên thế giới đã công bố khá nhiều phương pháp kiểm nghiệm TEZ cũng như

Bài viết phân tích 28 tạp chất A, B, C của TEZ, nêu rõ các phương pháp định lượng TEZ đa dạng như đo quang tạo màu, HPLC với detector UV và huỳnh quang, HPTLC, và đo thế Các mẫu nghiên cứu bao gồm nguyên liệu, viên nén, viên nang và dịch sinh học như huyết tương và nước tiểu Ngoài các phương pháp định lượng TEZ riêng biệt, còn có nhiều phương pháp đồng thời định lượng TEZ và thuốc ức chế a1-adrenergic khác Hầu hết các phương pháp kiểm nghiệm terazosin đều sử dụng chuẩn terazosin hydroclorid, với một số yêu cầu thêm các tạp chuẩn A, B, C của terazosin.

Các phương pháp phân tích tạp chất A, B, C của terazosin chủ yếu sử dụng HPLC với các loại detector như UV, khối phổ và nhiều loại cột sắc ký như C8, C18, Chiralpak IC hay cột nhồi ZrO2, với nhiệt độ cột từ 20 đến 60 °C Các mẫu phân tích bao gồm nguyên liệu TEZ, thành phẩm TEZ và các tạp chất tương ứng, thường cần chất chuẩn TEZ và các tạp chuẩn IAT, IBT, ICT ở các nồng độ khác nhau Đặc biệt, tạp chuẩn A và tạp chuẩn C cũng được sử dụng để kiểm nghiệm DOX, một hoạt chất trong nhóm ức chế a1-adrenergic cùng với TEZ Đối với phương pháp định lượng tạp chất IAT, IBT, ICT của LGC, không cần chất chuẩn mà kết quả được tính bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích.

Phương pháp xác định tạp chất trong viên nén và viên nang TEZ dựa trên chất chuẩn TEZ mang lại kết quả chính xác hơn Việc sử dụng các nguyên liệu tạp chuẩn như IAT, IBT, ICT trong quy trình phân tích giúp định danh đúng các tạp chất và cải thiện độ tin cậy so với phương pháp tính tương đối theo chuẩn hóa diện tích.

TỔNG QUAN VỀ CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU

Chất chuẩn đối chiếu là những chất đồng nhất, đã được xác định chính xác và có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng, thường được sử dụng trong các phép thử hóa học, vật lý và sinh học Trong quá trình thử nghiệm, các tính chất của chất đối chiếu sẽ được so sánh với các tính chất của chất cần thử nghiệm.

1.6.2 Vai trò của chất chuẩn đối chiếuChất chuẩn đối chiếu được dùng trong các phép thử như: Định tính, định lượng bằng các phương pháp đo quang; định tính, định lượng bằng các phương pháp sắc ký; định tính, định lượng bằng phương pháp vi sinh vật, các phép thử xác định tạp chất; các phép thử sinh học; một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng [7], [91] Ngoài ra chất chuẩn đối chiếu còn được dùng để thẩm định một phương pháp mới; chuẩn hoá các chất đối chiếu khác hay khẳng định giá trị pháp lý của một phương pháp đã chuẩn ho á [5].

1.6.3 Phân loại chất chuẩn đối chiếu

1.6.3.1 Phân loại theo cách thiết lập

Chuẩn sơ cấp (Primary reference standard) là những chất chuẩn đầu tiên được thiết lập mà không cần sử dụng chuẩn gốc Để xác định hàm lượng của các chất này, cần tính tổng tất cả các tạp chất, bao gồm độ tinh khiết sắc ký, tồn dư dung môi, tồn dư chất vô cơ, độ ẩm và các yếu tố khác tùy theo từng trường hợp cụ thể Giá trị hàm lượng được tính bằng 100% trừ đi tổng phần trăm của tất cả các tạp chất.

Các chuẩn sơ cấp thường được sử dụng làm chuẩn gốc để kết nối với các chuẩn thứ cấp hoặc chuẩn làm việc Chuẩn sơ cấp chủ yếu là chuẩn của USP.

- Chuẩn thứ cấp (Secondary reference standard) là các chất chuẩn khi thiết lập có sử dụng các chất chuẩn gốc để nối chuẩn [40], [47], [53], [56], [91].

1.6.3.2 Các loại chất chuẩn đối chiếu trên thế giới theo nơi thiết lập

Chất chuẩn đối chiếu của dược điển quốc tế (ICRS) được thiết lập tại trung tâm hợp tác về các chất đối chiếu hóa học của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), với sự tham gia đánh giá từ các tổ chức được WHO chỉ định.

- Chất chuẩn đối chiếu Dược điển Anh do các phòng thí nghiệm trực thuộc Hội đồng dược điển Anh thiết lập

- Chất chuẩn đối chiếu của hội đồng Dược châu Âu (EPCRS) do hội đồng Dược điển Châu Âu thiết lập

- Chất chuẩn đối chiếu của Hội đồng Dược điển Mỹ (USPRS) được thiết lập bởi ít nhất 3 phòng thí nghiệm thành viên đáp ứng tiêu chuẩn

Chất chuẩn đối chiếu của khu vực ASEAN (ACRS) được thiết lập với sự hỗ trợ kỹ thuật từ WHO, bao gồm các phòng thí nghiệm quốc gia của Thái Lan, Singapore, Indonesia, Malaysia, Philippines và Việt Nam, trong đó Thái Lan đóng vai trò điều phối viên Tại Việt Nam, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (VKNTTƯ) là thành viên chính thức chịu trách nhiệm đánh giá và thiết lập chất chuẩn khu vực ASEAN.

- Chất chuẩn đối chiếu của Dược điển Việt Nam do VKNTTƯ thiết lập.

- Chất chuẩn PTN do VKNTTƯ và Viện Kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh (VKNTPHCM) thiết lập.

- Chất chuẩn làm việc do các cơ sở sản xuất tự thiết lập 1.6.4 Tinh hình thiết lập chất chuẩn đối chiếu hóa học tại Việt Nam

1.6.4.1 Các chất chuẩn, tạp chuẩn tại Việt Nam

Việt Nam hiện đã thiết lập hơn 500 chất chuẩn đối chiếu hóa học, trong đó Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (VKNTTƯ) cung cấp hơn 300 chất chuẩn, còn Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM (VKNTPHCM) cũng đóng góp nhiều chất chuẩn quan trọng.

Tại Việt Nam, số lượng tạp chuẩn chất chuẩn hiện nay còn hạn chế, với chỉ khoảng gần chục tạp chuẩn được thiết lập trong danh mục chất chuẩn của VKNTTƯ và VKNTPHCM.

1.6.4.2 Tinh hình nghiên cứu tổng hợp các chất và tạp chất dùng làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn đối chiếu hóa học tại Việt Nam

Tại Việt Nam, các chất chuẩn đối chiếu hóa học chủ yếu được thiết lập từ nguyên liệu dược dụng nhập khẩu Trong khi đó, việc nghiên cứu và tổng hợp các tạp chất làm nguyên liệu cho các tạp chuẩn còn hạn chế Một số nghiên cứu đã được thực hiện, bao gồm tổng hợp tạp chất A của metronidazol, clopidogrel, 4-aminophenol, captopril disulfid, cloramphenicol, amlodipin, cephalexin, dimenhydrinat, guaphenessin và ranolazin.

1.6.4.3 Tinh hình tổng hợp terazosin và các tạp chất A, B, C của terazosin làm nguyên liệu thiết lập chuẩn tại Việt Nam

Hiện nay tại Việt Nam chưa có đề tài nào về nghiên cứu tổng hợp các tạp chất A, B,

C terazosin là nguyên liệu quan trọng để thiết lập tạp chuẩn cho việc kiểm tra chất lượng nguyên liệu và thành phẩm chứa terazosin Nghiên cứu này tập trung vào việc tổng hợp terazosin nhằm phục vụ sản xuất thuốc trong nước Tuy nhiên, khi kiểm tra chất lượng nguyên liệu terazosin tổng hợp, giới hạn các tạp chất A, B, C chưa được đánh giá do thiếu các tạp chuẩn tương ứng.

C của terazosin [19], [20] Chất chuẩn terazosin và các tạp chuẩn A, B,C của terazosin cũng chưa được thiết lập tại Việt Nam.

1.6.5 Quy trình thiết lập chất chuẩn đối chiếu DĐVN Quy trình thiết lập chất chuẩn đối chiếu DĐVN do VKNTTƯ xây dựng dựa trên các hướng dẫn về thiết lập chuẩn trên thế giới [40], [47], [55], [53], [56], [93], [97] gồm các bước: Xây dựng thường qui kỹ thuật thiết lập chất chuẩn đối chiếu; đánh giá nguyên liệu; đóng gói chất đối chiếu; kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói; kiểm tra thành phẩm và đánh giá liên phòng thí nghiệm; xử lý số liệu; lập hồ sơ, chứng chỉ, dán nhãn; bảo quản; kiểm tra định kỳ [32].

1.6.5.1 Xây dựng thường qui kỹ thuật thiết lập chất chuẩn đối chiếu

Kỹ thuật thiết lập chất chuẩn đối chiếu bao gồm các chỉ tiêu chất lượng và phương pháp thử nhằm kiểm tra chất lượng của chất đối chiếu Những tiêu chí này được xây dựng để đánh giá nguyên liệu, kiểm tra độ đồng nhất, đánh giá thành phẩm, thực hiện liên phòng thí nghiệm và kiểm tra định kỳ chất đối chiếu.

1.6.5.2 Đánh giá nguyên liệu Đánh giá nguyên liệu được tiến hành theo thường qui kỹ thuật thiết lập chất chuẩn đối chiếu Yêu cầu nguyên liệu dùng để sản xuất chất đối chiếu phải đạt các qui định trong thường qui kỹ thuật thiết lập chất đối chiếu đó [31], [32].

1.6.5.3 Đóng gói chất chuẩn đối chiếu

Để chuẩn bị buồng đóng, cần đảm bảo rằng buồng đóng và các dụng cụ như phễu, cơi thuỷ tinh, thìa xúc, lọ thuỷ tinh và lọ đựng nguyên liệu được vệ sinh sạch sẽ Hãy lau toàn bộ mặt trong của buồng đóng bằng ethanol 96° để đảm bảo vệ sinh an toàn trong quá trình đóng lọ.

- Chuẩn bị lọ trước khi đóng: đánh số thứ tự lọ, để lọ ổn định trong buồng đóng.

- Đóng lọ: ở nhiệt độ khoảng 25 °C, độ ẩm tương đối trong buồng đóng đạt 0 - 10%

Dùng thìa và phễu thuỷ tinh phân phối nguyên liệu vào từng lọ với lượng đóng đủ cho các phép thử Đậy nút ngay sau mỗi lần đóng lọ [31], [32].

1.6.5.4 Kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói

- Lấy mẫu: số lượng lọ lấy để đánh giá độ đồng nhất ít nhất là 4 n +1 (n là tổng số lọ đóng được) hoặc lấy ít nhất 10 lọ.

- Kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói: Xác định hàm lượng của hoạt chất trong từng lọ theo thường qui kỹ thuật thiết lập chất chuẩn.

+ RSD giữa các lọ < 1,0%: điều kiện đóng gói ổn định, lô sản xuất đồng nhất + RSD giữa các lọ > 1,0%: tiến hành lấy mẫu lại để kiểm tra [31], [32].

- PTN 1: Kiểm tra đầy đủ các chỉ tiêu chất lượng

- PTN 2: Kiểm tra chỉ tiêu định lượng

- Xử lý kết quả phân tích trong từng PTN: loại giá trị thô, tính giá trị trung bình, RSD.

- Đánh giá kết quả phân tích 2 PTN: áp dụng test-F và test-T

- Tính giá trị công bố trên CoA của chất chuẩn và độ không đảm bảo đo của giá trị

1.6.5.7 Lập hồ sơ, chứng chỉ, dán nhãn

- Lập hồ sơ, chứng chỉ theo biểu mẫu

Dán nhãn theo quy định là rất quan trọng, bao gồm các thông tin cần thiết như tên chất chuẩn, loại chất chuẩn, khối lượng đóng gói trong mỗi lọ, số kiểm soát (số lô), điều kiện bảo quản và tên đơn vị thiết lập chuẩn.

Các chất chuẩn thường được bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8 °C, tránh ánh sáng Một số chất cần bảo quản đặc biệt sẽ được qui định cụ thể [31], [32].

- Kiểm nghiệm viên tiến hành kiểm tra định kỳ là người không tham gia vào quá trình thiết lập chuẩn ban đầu

- Chỉ tiêu kiểm tra định kỳ: Tạp chất liên quan và định lượng

TỔNG QUAN VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH NGUYÊN LIỆU HÓA DƯỢC

Việc thẩm định phương pháp phân tích được thực hiện theo các quy định chung của ASEAN, ICH, USSP và các tài liệu chuyên ngành liên quan Các tiêu chí thẩm định sẽ phụ thuộc vào bản chất của phương pháp thử, như được nêu trong Bảng 1.17.

Bảng 1.17 Qui định các chỉ tiêu cần thẩm định theo từng qui trình phân tích

^ ^ ^ ^ L o f i qui trình phân tích Định Xác định tạp chât Định Các chỉ tiêu thẩm định tính Định lượng Thử giới hạn lượng

Tính tuyến tính - + - + Độ đúng - + - + Độ lặp lại - + - + Độ chính xác trung gian - + (1) - + (1)

Giới hạn phát hiện (LOD) - - (3) + -

Giới hạn định lượng (LOQ) - + - -

Chú thích: Dấu (-) là không phải đánh giá

Dấu (+) là cần phải đánh giá

(1) Nếu đã đánh giá độ tái lặp thì không cần đánh giá chỉ tiêu này

(2) Qui trình kém đặc hiệu có thể bổ trợ bằng các qui trình hỗ trợ khác

(3) Có thể cần trong một số trường hợp 1.7.1 Độ đặc hiệu đối với phép thử định lượng và thử tạp chất

♦♦♦ Trường hợp có sẵn tạp chất

Để thực hiện phép định lượng, cần thêm một lượng tạp chất thích hợp vào mẫu ban đầu và xác minh rằng kết quả định lượng không bị ảnh hưởng bởi tạp chất Điều này được thực hiện bằng cách so sánh với kết quả định lượng trên mẫu không có tạp chất.

Đối với phép thử tạp chất, cần thêm vào nguyên liệu một lượng tạp chất phù hợp và chứng minh rằng từng tạp chất riêng lẻ được tách biệt khỏi nhau cũng như tách ra khỏi các thành phần có trong mẫu.

Tính đặc hiệu trong phân tích có thể được xác minh bằng cách so sánh kết quả trên mẫu thử chứa tạp chất hoặc sản phẩm phân hủy với các phương pháp đã được thẩm định, bao gồm cả các mẫu lưu trữ trong điều kiện khắc nghiệt như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, và thủy phân Đối với quy trình sắc ký, độ tinh khiết của pic cần được xác định bằng detector DAD hoặc detector khối phổ, và tính đặc hiệu có thể được chứng minh thông qua độ phân giải của hai thành phần gần nhau nhất.

Độ tuyến tính của phương pháp phân tích phản ánh mối quan hệ tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất phân tích (x) trong một khoảng xác định Mối quan hệ này được diễn đạt qua phương trình hồi quy y = ax + b, trong đó hệ số tương quan tuyến tính và phần trăm hệ số chắn đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá độ chính xác của phương pháp.

- Thực hiện trực tiếp trên mẫu chuẩn với ít nhất 5 nồng độ.

+ Hệ số tương quan R phải > 0,999 + % Hệ số chắn tại nồng độ 100% (%Y) phải < 2,0%

% Y = - -x 100 Đáp ứng của dung dịch nồng độ 100%

Độ đúng của phương pháp phân tích thể hiện mức độ gần gũi giữa các giá trị thu được và giá trị thực Để đảm bảo độ đúng, cần xác định khoảng giá trị phù hợp cho từng phương pháp phân tích.

1.7.3.1 Xác định độ đúng của phương pháp định lượng nguyên liệu

- Áp dụng phương pháp phân tích đối với chất phân tích đã biết rõ độ tinh khiết (ví dụ chất đối chiếu)

So sánh kết quả của phương pháp phân tích đề xuất với kết quả của phương pháp phân tích chính thống cho thấy độ chính xác đã được công bố, giúp xác định hiệu quả và độ tin cậy của phương pháp mới.

- Có thể được suy ra một khi độ chính xác, độ tuyến tính và độ đặc hiệu đã được thiết lập [11], [14], [30], [33], [39], [54], [92], [94].

1.7.3.2 Xác định độ đúng của phương pháp định lượng tạp chất trong nguyên liệu Độ đúng được tiến hành bằng phương pháp thêm chuẩn trên các mẫu nguyên liệu.

Trong trường hợp không có tạp và sản phẩm phân hủy chuẩn thì có thể chấp nhận so sánh kết quả thu được với một quy trình chính thống [11], [14], [30], [33], [39], [54],

1.7.4 Độ chính xác (Precision) Độ chính xác gồm độ lặp lại và độ chính xác trung gian.

Độ lặp lại hệ thống, hay còn gọi là độ chính xác hệ thống, được xác định thông qua việc đo lường nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý Điều này giúp đánh giá độ chính xác của thiết bị trong các phép đo.

Độ lặp lại của phương pháp phân tích là một yếu tố quan trọng phản ánh độ chính xác của toàn bộ quy trình phân tích Để đánh giá độ lặp lại, cần phân tích mẫu thử từ giai đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu) đến giai đoạn cuối cùng của quy trình, thực hiện ít nhất 3 lần ở mỗi mức nồng độ và tối thiểu 6 lần định lượng ở nồng độ 100% Kết quả độ lặp lại được biểu thị bằng sai số tương đối (RSD), với yêu cầu RSD phải nhỏ hơn 2% nếu không có quy định riêng.

1.7.4.2 Độ chính xác trung gian Độ chính xác trung gian: là độ chính xác của phương pháp phân tích được thực hiện trong cùng phòng thí nghiệm nhưng trong các ngày khác nhau, những người phân tích khác nhau, dụng cụ phân tích khác nhau [11], [14], [30], [33], [39], [54],

1.7.5 Khoảng xác định Khoảng xác định được thiết lập bởi việc khẳng định quy trình đã xây dựng có tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác chấp nhận được khi áp dụng định lượng chất phân tích Khoảng xác định tối thiểu cần cân nhắc:

- Để định lượng: thường từ 80% đến 120% của nồng độ thử.

- Để xác định tạp chất: Khoảng xác định phải từ 100% đến 120% của giới hạn cho phép [11], [14], [30], [33], [39], [54], [92], [94].

1.7.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Giới hạn phát hiện: là lượng thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện được.

Giới hạn định lượng là mức tối thiểu của chất cần phân tích trong mẫu thử mà có thể được xác định với độ chính xác và độ tin cậy phù hợp Thông số này đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện các tạp chất và sản phẩm phân hủy.

1.7.ổ.2 Các cách xác định LOD và LOQ

LOD được xác định thông qua việc phân tích mẫu thử có chất phân tích với nồng độ đã biết, từ đó xác định nồng độ tối thiểu mà tại đó phản ứng của chất phân tích có thể được đọc Trong khi đó, LOQ được xác định bằng cách phân tích mẫu thử tương tự nhưng tập trung vào nồng độ tối thiểu mà tại đó chất cần phân tích có thể được định lượng với độ chính xác và độ tin cậy chấp nhận được.

Tỉ lệ đáp ứng so với nhiễu chỉ áp dụng cho các phương pháp phân tích có nhiễu đường nền, thông qua việc so sánh đáp ứng giữa mẫu trắng (N) và mẫu thử (S) Tỷ số S/N được thiết lập, với tỷ lệ S/N 3:1 hoặc 2:1 thường được chấp nhận để xác định giới hạn phát hiện (LOD) Trong khi đó, tỷ lệ S/N 10:1 được chấp nhận để thiết lập giới hạn định lượng (LOQ).

- Dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc: giới hạn phát hiện có thể được tính như sau :

Trong đó, ơ đại diện cho độ lệch chuẩn của đáp ứng, được tính toán dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu trắng Còn S là độ dốc của đường chuẩn, được xác định từ đường chuẩn của chất phân tích.

NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGUYÊN LIỆU

- Chất chuẩn terazosin hydroclorid của Hội đồng Dược điển Mỹ (USPRS); lô G0F290; hàm lượng nguyên trạng 91,9% (Hình 2.1.a).

- Tạp chuẩn A của Hội đồng Dược điển Mỹ dạng muối dihydroclorid (USPRS); lô F0C245; hàm lượng nguyên trạng 90,0% (Hình 2.1.b).

- Tạp chuẩn B của terazosin của Hội đồng Dược điển Mỹ (USPRS); lô F0C218; hàm lượng nguyên trạng 100% (Hình 2.1.c).

- Tạp chuẩn C của terazosin của Hội đồng Dược điển Mỹ dạng muối dihydroclorid (USPRS); lô H0M084; hàm lượng nguyên trạng 95,0% (Hình 2.1.d).

2.1.a).Chất chuẩn TEZ 2.1.b) Tạp chuẩn A 2.1.c) Tạp chuẩn B 2.1.d) Tạp chuẩn C

Hình 2.1 Chất chuẩn terazosin hydroclorid và các tạp chuẩn A, B, C của terazosin của Hội đồng Dược điển Mỹ

- Dung dịch chuẩn gốc Cl" nồng độ 1000 ppm, lô HC68810497 (Merck).

- 2-cloro-6,7-dimethoxyquinazolin-4-amin (ACDQ) PA, Sigma-Aldrich, lô STBC3541V, hàm lượng nguyên trạng 99,7%

- Nguyên liệu terazosin hydroclorid tổng hợp tại Bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội, hàm lượng nguyên trạng 90,2%

- Acid tetrahydro-2-furancarboxylic (THFA), Sigma-Aldrich, lô 10504TBV, hàm lượng nguyên trạng 99,9%.

- Acid capric, Sigma-Aldrich, lô BCBJ 3927V, hàm lượng nguyên trạng 99,8%.

- 1-[(tetrahydro-2-furanyl)carbonyl]piperazin (TFCP), Alfa Aesar, lô 10173170, hàm lượng nguyên trạng 99,5%.

- Naproxen, Sigma-Aldrich, lô SLBV2253, hàm lượng nguyên trạng 99,6%.

- 3,5-Dinitrobenzoyl clorid, Sigma-Aldrich, lô BCBF6802V, hàm lượng nguyên trạng 98,7%

- Silica gel dùng cho sắc ký cột: silica gel 60 (kích thước 63 - 200 ^m) Merck.

- Bản mỏng silica gel 60 F 254 (Merck).

2.1.3 Dung môi, hóa chất Các hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu thể hiện ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu đề tài

TT Tờn nguyờn liệu m ^ y\ ằ• y\ Xuất xứ TT Tờn nguyờn liệu m ^ y\ ằ• y\ Xuất xứ

1 Acetonitril HPLC Merck (Đức) 16 Ethyl acetat PA Xilong (TQ)

2 Acetonitril PA Merck (Đức) 17 ô-Hexan PA Xilong (TQ)

3 Aceton PA Xilong (TQ) 18 Isopropanol PA Xilong (TQ)

4 Acid acetic băng PA Xilong (TQ) 19 Kali bromid PA Merck (Đức)

5 Acid citric PA Merck (Đức) 20 Methanol PA Trung Quốc

6 Acid phosphoric đặc PA Xilong (TQ) 21 Methanol HPLC Merck (Đức)

7 Acid sulfuric đặc PA Xilong (TQ) 22 Natri citrat PA Merck (Đức)

8 Alcol isoamylic PA Xilong (TQ) 23 Natri hydroxyd PA Xilong (TQ)

9 Amoniac 25% PA Xilong (TQ) 24 Natri laurylsulfat Fisher

10 ô-Butanol PA Xilong (TQ) 25 Natri nitrit PA Xilong (TQ)

11 Cloroform PA Xilong (TQ) 26 Ninhydrin PA Xilong (TQ)

12 Dicloromethan PA Xilong (TQ) 27 Piperazin PA Merck (Đức)

13 Diethylamin PA Merck (Đức) 28 ô-Propanol PA Xilong (TQ)

14 Dimethyl sulfoxid dó Merck (Đức) 29 Toluen PA Xilong (TQ)

TRANG THIẾT B Ị

- Máy cất quay chân không Buchi R201 (Thụy Sĩ) của Bộ môn Hóa Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội

- Máy đo pH Metrohm 780 (Thụy Sĩ) của VKNTTƯ

- Máy siêu âm RK 106 Bandenlin (Đức) của VKNTTƯ

- Máy xác định nhiệt độ nóng chảy SMP3 Stuart (Anh) của VKNTTƯ

- Máy khuấy từ gia nhiệt Wish (Hàn Quốc) của Bộ môn Hóa Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội

- Máy đo khối phổ phân giải cao LTQ ORBITRAP XLTM (Mỹ) của Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500MHz Ascend (Đức) của Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AVANCE 500 MHz (Thụy Sĩ) của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ hồng ngoại Thermo FTIR NEXUS 670 (Mỹ) của VKNTTƯ

- Máy đo phổ hồng ngoại Shimazdu FTIR Affinity-1S (Nhật Bản) của Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

- Máy đo phổ hồng ngoại Spectrum Two Traffinity - 1S (Anh) của Trung tâm Kiểm nghiệm Vĩnh Phúc (TTKNVP).

- Máy phân tích nhiệt trọng lượng Labysys TG 1600, SETARAM (Pháp) của Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

- Máy quang phổ UV-VIS Hitachi U-3900H (Nhật Bản) của VKNTTƯ

- Máy quang phổ UV-VIS Shimadzu UV-1800 (Nhật Bản) của TTKNVP

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200 (Mỹ) của VKNTTƯ

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao SHIMADZU diode array UV-VIS SPD-M20A, sản phẩm đến từ Nhật Bản, đang được sử dụng tại Bộ môn Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, thuộc Trung tâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao SHIMADZU detector đo độ dẫn điện CDD-10A VP (Nhật Bản) của TTKNVP.

- Cân kỹ thuật Ohaus PA512, Sartorius CP232S, Ohaus (d = 1 mg) của VKNTTƯ

- Cân phân tích METTLER TOLEDO XPE26 (d = 0,001 mg), (Thụy Sĩ) của VKNTTƯ.

- Cân phân tích Mettler toledo MS 105, (d = 0,01 mg), (Thụy Sĩ) của VKNTTƯ

- Cân phân tích Mettler toledo MS 205 DU, (d = 0,01 mg), (Thụy Sĩ) của TTKNVP.

- Cột sắc ký C8 (250 x 4,6 mm, 5 ^m) của các hãng Supelco, Luna và Shimadzu

- Cột sắc ký C18 (250 x 4,6 mm, 5 ^m); (150 x 4,6 mm, 5 ^m) của Shimadzu

- Cột sắc ký G25 theo USP (0,53 mm x 10 m; 1,2 ^m) là cột mao quản bằng silica nung chảy được phủ một lớp hợp chất polyetylen glycol TPA của GL Sciences.

- Cột thủy tinh dùng cho sắc ký cột kích thước: (40 cm x 2,5 cm) và (60 cm x 3,5 cm)

- Đèn soi tử ngoại UV-VIS Vilber Lourmart (Pháp)

- Tủ sấy chân không W0V-70 (Hàn Quốc)

- Lọ thủy tinh để đóng chuẩn: lọ thủy tinh màu nâu của hãng Agilent, thể tích 2 ml, có nút nhựa kín.

- Bình triển khai sắc ký lớp mỏng và các dụng cụ thủy tinh cần thiết.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1.1 Phương pháp tổng hợp terazosin hydroclorid

Tổng hợp terazosin theo TLTK [19] theo sơ đồ “Hình 1.10” ở phần “Tổng quan” nhưng tiến hành đến giai đoạn tạo terazosin thô.

2.3.1.2 Phương pháp tổng hợp tạp chất A

Dựa trên nguyên tắc tổng hợp tạp chất A từ ACDQ và piperazin (Hình 2.2). ị—^NH

CH30 ^ ^ ^ NV ' Dung môi thích hợp CH ^

Hình 2.2 Sơ đồ tổng hợp IAT

2.3.1.3 Phương pháp tổng hợp tạp chất B

Dựa trên nguyên tắc tổng hợp tạp chất B từ terazosin, quá trình bắt đầu bằng phản ứng diazo hóa để tạo ra muối diazoni Sau đó, muối diazoni này được thủy phân trong môi trường acid yếu và chiết xuất bằng ethyl acetat, từ đó thu được sản phẩm thô.

Hình 2.3 Sơ đồ tổng hợp IBT

2.3.1.4 Phương pháp tổng hợp tạp chất C

Dựa trên nguyên tắc tổng hợp tạp chất C của terazosin từ IAT base và ACDQ (Hình 2.4). n h 2 p h 3 c o ^ A n ACDQ ^ H3COY y * N

H N ^ S' N ^ ' S's | ®un8 mô* thích hợp H3CO N 1

Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp ICT

Tinh chế sản phẩm thô bằng phương pháp sắc ký cột sử dụng silica gel 60 (kích thước 63 - 200 μm) với các hệ dung môi rửa giải phù hợp cho từng sản phẩm Phương pháp nhồi cột ướt yêu cầu tỷ lệ 50 g silica gel cho 1 g nguyên liệu thô Để đưa mẫu lên cột, phân tán khoảng 1 g nguyên liệu thô trong 20 ml dung môi rửa giải, thêm 5 g silica gel, trộn đều và chuyển hỗn hợp lên cột sắc ký Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi phù hợp với tốc độ khoảng 30 giọt/phút.

2.3.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được

2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Mỗi sản phẩm được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp TLC với 3 hệ dung môi pha động khác nhau, sử dụng nồng độ chất phân tích phù hợp, và phát hiện vết bằng soi đèn UV ở 254 nm và 312 nm Đặc biệt, sản phẩm IAT được kiểm tra bằng 4 hệ dung môi pha động, trong đó 3 hệ sử dụng soi đèn UV 254 nm và 312 nm, còn 1 hệ dùng thuốc thử Nihydrin để phát hiện piperazin tồn dư.

(Cáchpha thuốc thử Ninhydrin theo DĐVNV: Hòa tan 0,2 g ninhydrin trong 100 ml hỗn hợp gồm n-butanol - acid acetic 2 M tỷ lệ 95: 5) 2.3.2.2 Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (TGA)

Xác định hàm ẩm của sản phẩm sử dụng máy phân tích nhiệt trọng lượng Labsys

TG 1600, SETARAM (Pháp) với tốc độ dòng khí bảo vệ 2,5 lít/giờ, tốc độ gia nhiệt là 2 °C/phút, duy trì nhiệt độ 105 °C trong 4 giờ, lượng mẫu thử khoảng 10 mg.

2.3.3 Phương pháp phân tích cấu trúc của các sản phẩm tổng hợp được

2.3.3.1 Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) Được ghi trên máy Shimazdu FTIR Afinity - 1S hoặc máy đo phổ IR 670 - FTIR Nicolet - NEXUS với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000 - 400 cm-1.

2.3.3.2 Phương pháp đo phổ khối lượng (MS) Được đo bằng máy khối phổ LTQ ORBITRAP XL sử dụng phương pháp đưa mẫu trực tiếp với dung môi là methanol, kỹ thuật ESI để ion hóa các chất cần đo.

2.3.3.3 Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Được ghi trên máy cộng hưởng từ Bruker Ascend 500 MHz hoặc máy cộng hưởng từ Bruker AVANCE 500 MHz, dung môi DMSO-d6 Phổ 1H-NMR, HSQC, HMBC đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz Độ dịch chuyển hóa học (S, ppm) được hiệu chỉnh theo chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).

2.3.3.4 Phương pháp HPLC với detector đo độ dẫn để xác định tỷ lệ mol HCl trong ICT

Sử dụng máy HPLC Shimadzu với detector đo độ dẫn CDD-10A VP, cột Shodex

IC SI-52 4E (4,0 mm x 250 mm), pha động: N 2 CO 3 3,6 mM, tốc độ dòng: 0,8 ml/phút, nhiệt độ cột: 45 °C, thể tích tiêm mẫu: 50 ^l [1].

Xác định loại acid kết hợp trong sản phẩm TEZ, IAT, ICT bằng phản ứng với dung dịch AgNO3 0,1 N.

2.3.4 Phương pháp kiểm nghiệm các sản phẩm TEZ, IAT, IBT và ICT

2.3.4.1 Phương pháp đo phổ IR

Như mục 2.3.3.1 sử dụng máy IR 670-FTIR Nicolet-NEXUS hay máy IR Spectrum Two Traffinity - 1S.

2.3.4.2 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy

Xác định nhiệt độ nóng chảy bằng máy xác định nhiệt độ nóng chảy SMP 3 Stuart (Anh).

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) được áp dụng trong luận án để định tính các sản phẩm IAT, IBT và ICT Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F 254, các vết được phát hiện bằng cách soi đèn UV ở bước sóng 254 nm Mỗi sản phẩm sẽ được phân tích bằng một hệ dung môi pha động và nồng độ chấm sắc ký tương ứng để đảm bảo độ chính xác trong kết quả.

Phương pháp HPLC được xây dựng trong luận án nhằm mục đích định tính, định lượng và xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu và các sản phẩm chuẩn TEZ, IAT, IBT Phương pháp này sử dụng cột C8 kích thước 4,6 mm x 25 cm với kích thước hạt 5 μm, ở nhiệt độ cột 30 °C Detector UV hoạt động ở bước sóng 254 nm để định lượng TEZ và phân tích tạp chất liên quan trong TEZ, 245 nm cho IAT, IBT, và 254 nm cho tạp chất trong IAT và IBT Pha động bao gồm MeCN và dung dịch đệm citrat pH 3,2 theo tỷ lệ 16:84, với tốc độ dòng 1,0 ml/phút.

Để pha dung dịch đệm citrat có pH 3,2, bạn cần hòa tan 12,0 g natri citrat dihydrat và 28,5 g acid citric khan trong 1,95 lít nước Sau đó, điều chỉnh pH đến mức 3,2 ± 0,1 bằng cách thêm natri citrat hoặc acid citric nếu cần thiết Cuối cùng, pha loãng dung dịch với nước cho đến khi đạt tổng thể tích 2,0 lít.

- Phương pháp HPLC theo BP 2017 để xác định tạp 1-[(tetrahydro-2-furanyl)

Phân tích 42 carbonyl piperazin (TFCP) được thực hiện bằng cách sử dụng chất chuẩn TEZ trên cột C18 kích thước 4,0 mm x 25 cm với kích thước hạt 5 µm Thiết bị đo sử dụng detector UV ở bước sóng 210 nm Pha động là hỗn hợp dung dịch natri laurylsulfat pH 2,5 và MeCN theo tỷ lệ 60:40, với tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút.

Để pha dung dịch natri laurylsulfat có pH 2,5, bạn cần hòa tan 2,80 g natri laurylsulfat trong 1000 ml nước Tiếp theo, thêm 11 ml dung dịch chứa triethylamin với nồng độ 202,4 g/lít và H3PO4 có nồng độ 230 g/lít Cuối cùng, điều chỉnh pH của dung dịch về mức 2,5 bằng cách sử dụng H3PO4.

Phương pháp HPLC được xây dựng để định tính, định lượng và xác định tạp chất trong nguyên liệu và tạp chuẩn ICT, sử dụng cột C8 kích thước 4,6 mm x 25 cm với kích thước hạt 5 µm Nhiệt độ cột được duy trì ở 40 °C, sử dụng detector UV tại bước sóng 254 nm Chương trình pha động áp dụng gradient dung môi với tốc độ dòng 1,0 ml/phút.

(Cách pha dung dịch đệm citrat: Hòa tan 3,63 g natri citrat dihydrat và 8,63 g acid citric khan trong 1000 ml nước, lọc qua màng 0,45 ụm rồi thêm 0,25 ml triethylamin)

2.3.4.6 Phương pháp sắc ký khí (GC) theo USP 40

Phương pháp GC theo USP 40 được sử dụng để xác định tạp acid tetrahydro-2-furancarboxylic (THFA) trong nguyên liệu và chất chuẩn TEZ Phương pháp này sử dụng detector ion hóa ngọn lửa, với nhiệt độ duy trì ở 240 °C Cột G25 theo USP (0,53 mm x 10 m; 1,2 µm) là cột mao quản bằng silica nung chảy, được phủ một lớp polyethylen glycol TPA 1,2 µm, với nhiệt độ cột duy trì ở 170 °C Chế độ tiêm không chia dòng được duy trì ở nhiệt độ 230 °C, sử dụng khí mang Nitơ cho sắc ký khí với tốc độ dòng 9 ml/phút.

2.3.5 Các phương pháp kiểm nghiệm viên nén TEZ

2.3.5.1 Phương pháp HPLC theo USP 40 đế định tính, định lượng TEZ trong viên nén TEZ

Sử dụng cột C18 (4,6 mm X 15 cm; 5 ^m), detector UV 254 nm, pha động là hỗn hợp MeCN và nước (7: 3), thêm 1% acid acetic băng và 0,02% DEA, tốc độ dòng 2,5 ml/phút.

2.3.5.2 Phương pháp HPLC theo USP 40 đế xác định tạp chất liên quan trong viên nén TEZ

Sử dụng cột C18 (4,6 mm X 25 cm, 5 ^m), detector UV 246 nm, pha động là hỗn hợp MeCN và dung dịch đệm phosphat pH 3,0 (6: 19), tốc độ dòng 1,0 ml/phút.

Để pha dung dịch đệm phosphat có pH 3,0, bạn cần hòa tan 4,1 g KH2PO4 và 1,1 g natri heptan sulfonic acid monohydrat trong 950 ml nước Sau đó, điều chỉnh pH về mức 3,0 ± 0,10 bằng H3PO4 và thêm nước cho đủ 1 lít.

2.3.5.3 Phương pháp HPLC theo TCNSX Abbott để định tính, định lượng TEZ trong viên nén TEZ

Sử dụng cột C18 kích thước 4,6 mm x 25 cm với độ phân giải 5 μm và detector UV ở bước sóng 246 nm, pha động được chuẩn bị bằng cách hòa tan 12,0g trinatri citrat dihydrat và 8,7g acid citric monohydrat trong 1600ml nước, sau đó thêm 100ml methanol và 300ml acetonitril, với tốc độ dòng 2,0 ml/phút.

2.3.5.4 Phương pháp xác định độ hòa tan theo USP 40 và TCNSX Abbott

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

TỔNG HỢP TERAZOSIN VÀ CÁC TẠP CHẤT A, B, C

3.1.1.1 Tổng hợp terazosin hydroclorid thô

Kế thừa phương pháp tổng hợp terazosin hydroclorid tại Việt Nam của Nguyễn Hải Nam và cộng sự, nghiên cứu đã tiến hành tạo ra sản phẩm thô chưa tinh chế Kết quả kiểm tra nguyên liệu TEZ thô cho thấy hàm lượng và giới hạn tạp A, tạp C cùng tổng tạp không đạt yêu cầu của USP 40 Để đảm bảo nguyên liệu TEZ đạt tiêu chuẩn thiết lập chuẩn, cần áp dụng phương pháp tinh chế phù hợp với quy mô sản xuất và loại bỏ các tạp chất, đặc biệt là tạp A và tạp C.

Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu chất lượng TEZ thô theo USP

TT Chỉ tiêu chất lượng Yêu cầu theo USP 40 Kết quả kiểm nghiệm

2 Định lượng 98,0-102,0% HL khan Không đạt (92,46%)

3 Giới hạn tạp chất liên quan

Tạp rửa giải trước TEZ < 0,3% Đạt (0,04%)

3.1.1.2 Tinh chế terazosin hydroclorid thô

TEZ thô được tinh chế qua phương pháp sắc ký cột sử dụng silica gel 60 (kích thước 63 - 200 μm) Hệ dung môi rửa giải bao gồm DCM, aceton và MeOH với các tỷ lệ khác nhau: (8:8:1), (8:12:1), và (8:12:2) Quy trình thực hiện theo hướng dẫn trong mục “2.3.I.5”.

Phương pháp tinh chế terazosin thô được thực hiện thông qua sắc ký cột, trong đó dung môi được loại bỏ bằng cách cất quay chân không và sấy trong chân không ở 60 °C trong 4 giờ Kết quả thu được là bột kết tinh màu trắng với nhiệt độ nóng chảy 273,1 °C Quy trình này được lặp lại 3 lần, mỗi lần sử dụng 2 g terazosin thô, cho hiệu suất tinh chế trung bình đạt 92,2% Tổng cộng, 8,5 g terazosin hydroclorid đã được thu hồi từ quá trình tinh chế này.

46 nguyên liệu thiết lập chất chuẩn TEZ.

3.1.1.3 Sơ bộ xác định độ tinh khiết của sản phẩm terazosin hydroclorid

♦♦♦ Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm TEZ bằng phương pháp TLC

Chấm lần lượt lên bản mỏng đồng lượng 20 µl các dung dịch TEZ 10 mg/ml, TEZ chuẩn 0,01 mg/ml, IAT chuẩn 0,03 mg/ml, IBT chuẩn 0,01 mg/ml và ICT chuẩn 0,04 mg/ml Triển khai bản mỏng với 3 hệ dung môi pha động khác nhau (Hệ 1T, 2T, 3T) và phát hiện vết bằng đèn UV 254 nm và 312 nm Kết quả cho thấy, cả 3 hệ dung môi và 2 phương pháp phát hiện đều cho 1 vết duy nhất với Rf lần lượt là 0,44; 0,66; 0,33 và không phát hiện vết tạp nào.

Vết các dung dịch đối chiếu quan sát rất rõ ràng Như vậy kết quả đánh giá ban đầu cho thấy sản phẩm TEZ khá tinh khiết (Hình 3.1).

Hình 3.1.Sắc ký đồ kiểm tra sản phẩm TEZ bằng TLC

A) Hệ 1T: DCM - AcOEt - TEA - dung dịch NH 3 25% ( 4: 2: 1: 4), (lắc kỹ, gạn lấy pha dung môi hữu cơ làm dung môi khai triển) B) Hệ 2T: CHCI 3 - aceton - TEA- dung dịch

NH 3 25% (8: 8: 1: 10), (lắc kỹ, gạn lấy pha dung môi hữu cơ làm dung môi khai triển)

C) Hệ 3T: CHCl 3 - AcOEt - TEA - dung dịch NH 3 25% (2: 3: 1: 5), (lắc kỹ, gạn lấy pha dung môi hữu cơ làm dung môi khai triển).

Để xác định độ ẩm của sản phẩm TEZ, phương pháp TGA được áp dụng theo hướng dẫn thử nghiệm Qua ba lần thực hiện và tính trung bình, kết quả cho thấy độ ẩm của sản phẩm TEZ đạt 0,45% (xem Phụ lục 6).

3.1.1.4 Dữ liệu xác định cấu trúc sản phẩm terazosin hydroclorid Định tính HCl kết hợp theo USP 40: Hòa tan 100 mg chế phẩm trong 10 ml dung dịch methanol 90%, acid hóa bằng dung dịch HNO 3 10%, thêm 0,4 ml dung dịch AgNO 3 0,1N, xuất hiện tủa trắng lổn nhổn, tủa này không tan trong HNO 3 nhưng tan khi dư dung dịch NH 3 Như vậy sản phẩm là dạng muối hydroclorid.

Phổ IR của sản phẩm TEZ (KBr, cm'1): cho dải hấp thụ đặc trưng của nhóm -NH 2

(3420); C-H vòng thơm (3080); CH 2 vòng no (2961); C=O (1630); C=C vòng thơm

(1591); CH 3 O- (1244); C-H vòng thơm (991) Tiến hành chồng phổ IR của sản phẩm TEZ và phổ IR của chất chuẩn TEZ USPRS cho hệ số tương đồng 99,44% (Phụ lục

1).Phổ khối phân giải cao của sản phẩm sản phẩm TEZ: cho pic [M+H] + = 388,1993 phù hợp với công thức phân tử C 19 H 25 N 5 O 4 HQ (Phụ lục 1)

Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO- d 6 ), S(ppm): 1,85-1,88 (2H, m , H22); 1,98-2,11 (2H, m , H21); 3,57-3,81 (8H, m , H23, H13, H15, H16); 3,84 (3H, s , H17), 3,87(3H, s, H18); 3,89-3,96 (2H, m , H12); 4,73-4,76 (1H, m , H20); 7,60 (1H, s , H8); 7,76 (1H, s, H5); 8,67 (1H, s , NH); 8,94 (1H, s , NH); 12,42 (1H, s , NH) (Phụ lục 1).

Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO- d 6 ), S(ppm): 25,73 (C22); 28,40 (C21); 41,21 (C15), 44,39 (C13), 44,67 (C16), 45,28 (C12), 56,54 (C18), 56,74 (C17), 68,75 (C23); 75,36 (C20); 99,66 (C8); 102,19 (C9); 105,45 (C5); 136,70 (C10); 147,28 (C7); 151,82 (C2); 155,70 (C6); 161,75 (C4); 170,21 (C19) (Phụ lục 1).

3.1.2 Tổng hợp tạp chất A của terazosin

3.1.2.1 Quy trình tổng hợp ban đầu

Dựa trên phương pháp tổng hợp tạp A dạng base của Nageswara R R và cộng sự

Nghiên cứu đã đề xuất một quy trình tổng hợp IAT ban đầu, dựa trên một số phương pháp tổng hợp dẫn chất cấu tạo tương tự và qua quá trình khảo sát.

Hòa tan 0,18 g piperazin (0,002 mol) trong 8 ml IAM trong bình cầu 100 ml, sau đó thêm 0,50 g ACDQ (0,002 mol) Siêu âm hỗn hợp trong 15 phút để đạt được sự đồng nhất, sau đó khuấy từ ở 120 °C với hồi lưu trong 6 giờ trước khi hạ nhiệt độ.

Nhiệt độ 50 °C được duy trì trong 20 giờ, sau đó thực hiện lọc nóng để thu tủa Tủa được sấy khô ở 60 °C trong môi trường chân không trong 24 giờ Tiếp theo, tủa hòa tan trong 100 ml methanol, thêm 4 ml HCl đặc và đun hồi lưu ở 60 °C trong 3 giờ Sau đó, cô quay thu cắn và hòa tan cắn trong nước, lọc bỏ tạp chất không tan trong nước và tiếp tục cô quay thu cắn Cuối cùng, cắn thu được được sấy khô trong môi trường chân không.

60 °C trong 12 giờ thu sản phẩm IAT thô.

3.1.2.2 Tiêu chí và các nội dung khảo sát để hoàn thiện quy trình

♦♦♦ Tiêu chí để lựa chọn điều kiện tổng hợp thích hợp khi khảo sát gồm:

- Hiệu suất tổng hợp cao nhất.

Mức độ tạp chất trong các sản phẩm thô được xác định là tối thiểu, dựa trên kết quả phân tích bằng sắc ký lớp mỏng Các dung dịch sản phẩm thô có cùng nồng độ và thể tích đã được chấm theo các điều kiện sắc ký cụ thể.

Hệ dung môi khai triển 1A được sử dụng để xác định piperazin tồn dư bao gồm n-ButOH, CH3COOH và nước theo tỷ lệ 6:3:5, với phương pháp phát hiện vết bằng cách phun dung dịch thuốc thử Ninhydrin Hệ dung môi khai triển 2A, gồm MeOH, AcOEt và dung dịch NH3 25% theo tỷ lệ 16:4:1, cho phép phát hiện vết bằng cách soi đèn UV 254 nm.

+ Các dung dịch chấm sắc ký pha trong MeOH: Dung dịch sản phẩm IAT thô 5 mg/ml, dung dịch piperazin 2 mg/ml, dung dịch ACDQ 1 mg/ml.

❖ Các nội dung khảo sát gồm: dung môi phản ứng, nhiệt độ phản ứng, tỷ lệ mol các chất phản ứng (piperazin, ACDQ)

3.1.2.3 Kết quả khảo sát lựa chọn điều kiện tổng hợp

Theo quy trình ban đầu mà luận án đề xuất, chúng tôi đã tiến hành khảo sát để xác định các điều kiện tối ưu cho việc tổng hợp tạp chất A của terazosin Kết quả thu được như sau:

Khảo sát các dung môi phản ứng như n-butanol, DMF và IAM cho thấy IAM là lựa chọn tối ưu, vì dung môi này cho sản phẩm kết tủa ngay trong điều kiện phản ứng Trong khi đó, DMF và n-butanol có tốc độ phản ứng tổng hợp chậm, sản phẩm tạo ra ít và dễ tan trong dung môi, dẫn đến khó khăn trong việc phân lập sản phẩm.

❖ Khảo sát nhiệt độ phản ứng:

Nhiệt độ phản ứng cho giai đoạn 1 được khảo sát ở các mốc: dưới 115 °C, 120 ±

5 °C, trên 125 °C Kết quả ở nhiệt độ dưới 115 °C và trên 125 °C phản ứng không xảy ra Ở 120 ± 5 °C, sản phẩm tạo thành và kết tủa một phần ngay ở nhiệt độ phản ứng

Giai đoạn 2 của quá trình phản ứng được tiến hành ở các nhiệt độ 30 ± 5 °C, 50 ± 5 °C, 70 ± 5 °C và 90 ± 5 °C Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 70 ± 5 °C, hiệu suất tổng hợp tương đương với các mức 30 ± 5 °C và 50 ± 5 °C, tuy nhiên không có sự hiện diện của piperazin dư trong sản phẩm (Bảng 3.2).

2 mốc nhiệt độ này (Hình 3.2) Vì vậy lựa chọn nhiệt độ phản ứng cho giai đoạn 1 là

Bảng 3.2 Hiệu suất tổng hợp IAT khi khảo sát nhiệt độ phản ứng giai đoạn 2

❖ Khảo sát tỷ lệ mol ACDQ và piperazin tham gia phản ứng ở các tỷ lệ (1: 1); (1: 2);

(1: 3); (1: 4); (1: 5); (1: 6) với nhiệt độ phản ứng cho 2 giai đoạn đã được lựa chọn

Kết quả lựa chọn tỷ lệ mol ACDQ: piperazin là 1:5 do hiệu suất tổng hợp tăng dần khi tăng tỷ lệ mol piperazin Tuy nhiên, giữa tỷ lệ mol 1:5 và 1:6, hiệu suất tổng hợp tương đương (Bảng 3.3), và mức độ tạp chất khi soi dưới đèn UV không khác nhau nhiều Dù vậy, ở tỷ lệ mol 1:6, xuất hiện vết piperazin tồn dư trên sắc ký, ảnh hưởng đến độ tinh khiết của sản phẩm thô (Hình 3.3).

Bang 3.3 Hiêu suât tông hgp IAT khi thay dôi câc ty lê mol câc chât phan ung

Ty lê mol ACDQ: Piperazin 1: 1 1: 2 1: 3 1: 4 1: 5 1: 6

Hinh 3.2 Sac ky dô câc san phâm IAT thô khi thay dôi nhiêt dô phan ung giai doan 2

A) Hê 1A: n-ButOH - CH 3 COOH - nu&c (6: 3: 5), phat hiên vêt bang thuôc thù ninhydrin; B) Hê 2A: MeOH - AcOEt - dung dich NH 3 25% (16: 4: 1), phat hiên vêt bang soi dèn l IV 254 nm.

Hinh 3.3 Sac ky dô câc san phâm IAT thô khi thay dôi ty lê mol phan ung

A) Hê 1: n-ButOH - CH 3 COOH - nu&c (6: 3: 5), phat hiên vêt bang thuôc thù ninhydrin; B) Hê 2A: MeOH - AcOEt - dung dich NH 3 25% (16: 4:1), phat hiên vêt bang soi dèn UV 254 nm.

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG CHO CÁC NGUYÊN LIỆU TỔNG HỢP ĐƯỢC

Tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu terazosin hydroclorid được xây dựng dựa trên các chỉ tiêu của USP 40 và BP, đảm bảo sản phẩm TEZ đạt yêu cầu về chất lượng.

Theo Bảng 3.12 năm 2017 và Phụ lục 14, các chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu terazosin được xác định dựa trên phương pháp thử trong chuyên luận nguyên liệu terazosin của USP 40 và BP 2017 Do đây là các dược điển tham chiếu, nên không cần phải tiến hành thẩm định phương pháp phân tích.

Bảng 3.12 Các chỉ tiêu chất lượng cho nguyên liệu terazosin tổng hợp được

TT Chỉ tiêu Phương pháp thử Yêu cầu

1 Mô tả Cảm quan Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng

2 Độ trong và màu sắc dung dịch

Dung dịch 1% Phải đạt qui định

3 Định tính IR Phổ IR của mẫu thử tương tự phổ

IR của mẫu chuẩn HPLC Thời gian lưu của pic thử tương tự thời gian lưu của pic chuẩn

Pư của ion Cl- Dung dịch thử cho phản ứng đặc trưng của ion Cl-

4 Mất khối lượng do làm khô

6 Tạp 1-[(tetrahydro-2- furanyl)carbonyl] piperazin

7 Tạp chất liên quan HPLC - Tạp A < 0,3%

- Tạp rửa giải trước TEZ < 0,3%

8 Định lượng HPLC 98,0 - 102,0% HL khan

3.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu tạp A

3.2.2.1 Xây dựng phương pháp định tính IA T bằng TLC a Khảo sát các hệ dung môi khai triểnKhảo sát 9 hệ pha động khác nhau từ 1A đến 9A gồm các thành phần dung môi như sau: Hệ 1A: n -ButOH - CH 3 COOH - H 2 O (6: 3: 5)

Hệ 2A: MeOH - AcOEt - dung dịch NH 3 2S% (16: 4: 1)

Hệ 3A: MeOH - aceton - dung dịch NH 3 2S% (14: 4: 1)

Hệ 4A: PrOH - n-hexan - dung dịch NH 3 2S% (24: 8: 1)

Hệ 8A: MeCN - CHCl s - n-hexan - MeOH (S: 4: 1: 1)

Hình 3.19 Sắc ký đồ khảo sát pha động định tính IAT bằng TLC

1A) Hệ 1A, 2A) Hệ 2A, 3A).Hệ SA, 4A).Hệ 4A, 5A).Hệ 5A, 6A).Hệ 6A, 7A).Hệ 7A,

Chấm 10 µl dung dịch IAT, TEZ, ACDQ và hỗn hợp của cả ba chất lên bản mỏng Nồng độ của IAT, TEZ, ACDQ trong MeOH lần lượt là 1 mg/ml, 0,5 mg/ml và 0,5 mg/ml Tiến hành sắc ký và phát hiện vết bằng phương pháp soi đèn.

Kết quả sắc ký đồ cho thấy trong 9 hệ khảo sát, có thể lựa chọn 1 trong 4 hệ 1A, 2A, 3A, 4A Trong đó, hệ 1A và 4A cho hai vết ACDQ và TEZ tách xa hơn so với hệ 2A và 3A Giữa hai hệ này, hệ 1A sử dụng n-butanol.

Để định tính IAT, hệ 4A gồm n-propanol, n-hexan và dung dịch amoniac 25% với tỷ lệ 24:8:1 được lựa chọn, mang lại các vết sắc ký rõ ràng, thời gian chạy ngắn và không có mùi khó chịu từ n-butanol Thẩm định phương pháp định tính IAT bằng TLC được thực hiện bằng cách chấm 10 μl các dung dịch mẫu khác nhau lên bản mỏng, bao gồm dung dịch mẫu trắng (methanol), dung dịch tạp chuẩn IAT 1 mg/ml, dung dịch thử IAT 1 mg/ml, dung dịch chất chuẩn TEZ 0,5 mg/ml, dung dịch ACDQ 0,5 mg/ml, và dung dịch phân giải chứa IAT, TEZ và ACDQ với nồng độ tương ứng 1 mg/ml, 0,5 mg/ml và 0,5 mg/ml Sắc ký được triển khai với hệ dung môi đã chọn là n-propanol - n-hexan - dung dịch amoniac 25%.

Phát hiện vết sắc ký bằng đèn UV 254 nm cho thấy dung dịch mẫu trắng không có vết sắc kí, trong khi dung dịch thử IAT có vết tương tự vết IAT chuẩn (Rf ô 0,38) Dung dịch phân giải cho thấy ba vết tách biệt hoàn toàn với vị trí và màu sắc tương ứng là IAT (Rf ô 0,38), TEZ (Rf ô 0,65), và ACDQ (Rf ô 0,75) Phương pháp TLC được xác nhận đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, phù hợp cho việc định tính nguyên liệu IAT.

Trắng lATchuấn lATthìr TEZ ACDQ PG

Hình 3.20 Sắc ký đồ TLC thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp định tính IAT

3.2.2.2 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng IA T bằng HPLC a Điều kiện sắc kýTham khảo phương pháp HPLC xác định các tạp chất liên quan của terazosin trong USP 40, nhưng khảo sát để đưa ra nồng độ IAT phù hợp với phương pháp định lượng là 15 ^g/ml, đồng thời đưa ra dung dịch phân giải cho phương pháp này gồm IAT, TEZ, ACDQ với nồng độ lần lượt là 15 ^g/ml, 30 ^g/ml, 30 ^g/ml và bước sóng định lượng 245 nm là bước sóng cực đại của IAT trong dung môi pha mẫu (pha động) Phương pháp HPLC để định tính, định lượng IAT xây dựng được như sau:

- Cột sắc ký C8 ( 250x 4,6 mm; 5^m), nhiệt độ cột: 30 °C.

- Pha động là hỗn hợp của MeCN và dung dịch đệm citrat pH 3,2 (84 : 16).

(Cách pha đệm citrat pH 3,2 đã trình bày trong phần “Phương pháp thử” mục

“2.3.4.5.Phương pháp HPLC" Tốc độ dòng 1,0 ml/phút.

- Detector UV 245 nm Thể tích tiêm mẫu: 20 ^l

- Dung môi pha mẫu: pha động

- Dunh dịch chuẩn IAT và thử IAT có nồng độ 15 ^g/ml

- Dung dịch phân giải là hỗn hợp gồm IAT, TEZ, ACDQ với nồng độ lần lượt là 15

Yêu cầu về hệ thống sắc ký:

- Sắc ký đồ dung dịch phân giải cho hệ số phân giải giữa pic IAT và TEZ > 10; hệ số phân giải giữa pic TEZ và ACDQ > 8

- Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cho hệ số đối xứng pic IAT < 2; số đĩa lý thuyết > 1500

Giá trị RSD của thời gian lưu và diệc tích pic khi tiêm lặp lại dung dịch chuẩn < 2% b Thẩm định phương pháp phân tích

❖ Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch tạp chuẩn IAT USPRS có nồng độ 14,799

Kết quả phân tích cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu là 0,15% và của diện tích pic là 0,27%, đều nhỏ hơn 2% Hệ số đối xứng dao động trong khoảng từ 1,435 đến 1,441, trong khi số đĩa lý thuyết vượt quá 1500 (Bảng 3.13).

Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký được xác nhận thông qua độ phân giải của các pic trong dung dịch phân giải, điều này thể hiện rõ trong phần thẩm định độ đặc hiệu.

Với các thông số trên, hệ thống HPLC đã thích hợp để định tính, định lượng IAT.

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký định lượng IAT

Hệ sô đôi xứng pic

Tiêm vào hệ thống sắc ký các dung dịch như mẫu trắng (pha động), dung dịch chuẩn để đánh giá tính thích hợp, dung dịch thử IAT 15,114 µg/ml, dung dịch chuẩn TEZ USPRS 27,705 µg/ml, dung dịch ACDQ 30,392 µg/ml, và dung dịch phân giải gồm hỗn hợp IAT, TEZ, ACDQ với nồng độ lần lượt là 13,208 µg/ml, 28,361 µg/ml và 29,545 µg/ml Kết quả thu được cho thấy

- Sắc ký đồ của mẫu trắng (Hình 3.21.a), trong khoảng thời gian lưu của pic IAT không xuất hiện pic sắc ký

Sắc ký đồ của mẫu thử cho pic có thời gian lưu 3,435 phút, tương tự như thời gian lưu của pic IAT trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn với thời gian lưu là 3,440 phút.

Dung dịch phân giải giúp tách biệt hoàn toàn các pic, với hệ số phân giải giữa pic IAT và TEZ đạt 25,546, trong khi hệ số phân giải giữa pic TEZ và ACDQ là 12,659 (Hình 3.21.d).

3.21.a) Mẫu trắng 3.21.b) Mẫu chuẩn IAT 3.21.c) Mẫu thử IAT 3.21.d) Mẫu phân giải Hình 3.21 Sắc kí đồ thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp định lượng IAT

3.22.a) Mẫu chuẩn IAT 3.22.b) Mầu thử IAT

Kết quả xác định độ tinh khiết của pic IAT cho thấy độ tinh khiết trong dung dịch chuẩn và dung dịch thử đều đạt giá trị 1,0000, như thể hiện trong Hình 3.22 Việc chồng phổ đã được thực hiện để xác minh kết quả này.

UV của pic IAT chuẩn và pic IAT thử cho hệ số chồng phổ bằng 1,0000 (Hình 3.23)

Các kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp định tính và định lượng IAT bằng HPLC đã được xây dựng với độ đặc hiệu cao, với các giá trị lambda max lần lượt là 221, 244.91, 328.76, 455.05 và 528.84.

Rot TimoỊ Lombda RongsJ Lrnibdo PHD J LambdBmn I Oporolion I Snnlonl

2è0 2ốữ 3èữ 3ộữ 4Ỉằ *ếữ siằ sỉ-9 eio eio rio 'ốo rim ẩ

Hình 3.23 Kết quả chồng phổ uv của pic IAT chuẩn và pic IAT thử

THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN TERAZOSIN VÀ CÁC TẠP CHUẨN A, B, C CỦA TERAZOSIN

Nguyên liệu thiết lập chuẩn TEZ, IAT, IBT, ICT mà luận án tổng hợp cùng các tiêu chuẩn chất lượng đã được xây dựng sẽ được chuyển giao cho VKNTTƯ Mục tiêu là phối hợp thiết lập chuẩn TEZ và các tạp chuẩn IAT, IBT, ICT.

3.3.1 Xây dựng các thường qui kỹ thuật thiết lập các chất chuẩn, tạp chuẩn Các thường qui kỹ thuật thiết lập các chất chuẩn, tạp chuẩn (Phụ lục 18, Phụ lục

Các tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu TEZ, IAT, IBT, và ICT đã được xây dựng trong luận án (Phụ lục 14, 15, 16, 17) và được áp dụng để phát triển các Phụ lục 19, 20, và 21.

3.3.2 Thiết lập chất chuẩn terazosin hydroclorid

3.3.2.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu terazosin

Kiểm tra chất lượng nguyên liệu TEZ, lô TEZ2018 được thực hiện theo quy định kỹ thuật VKN/TQKT-TT347.01 (Phụ lục 18), sử dụng chất chuẩn TEZ USPRS số lô G0F290 cho các phép thử định tính và định lượng Kết quả cho thấy nguyên liệu terazosin lô TEZ2018 đạt tiêu chuẩn sản xuất.

Bảng 3.43 Kết quả kiểm tra chất lượng nguyên liệu TEZ

TT Chỉ tiêu Kết quả

1 Mô tả Bột kết tinh màu trắng

2 Độ trong và màu sắc dung dịch Đạt

HPLC Phản ứng của ion Cl- Đúng Đúng Đúng

4 Mất khối lượng do làm khô (TGA) Đạt (0,45%)

5 Tạp acid tetrahydro-2-furancarboxylic: < 0,1% Đạt (0,02%)

6 Tạp 1-[(tetrahydro-2-furanyl) carbonyl]piperazin: < 0,1% Đạt (Không có)

- Tạp rửa giải trước TEZ < 0,3%

- Tổng tạp: < 0,6% Đạt (0,03%) Đạt (Không có) Đạt (0,01%) Đạt (Không có) Đạt (0,04%)

3.3.2.2 Đóng lọ chất chuẩn TEZ

Sử dụng buồng đóng chuẩn chuyên dụng (Glove box Labconco) giúp kiểm soát nhiệt độ và độ ẩm hiệu quả Điều kiện lý tưởng để đóng lọ thực tế bao gồm độ ẩm dưới 2%, nhiệt độ từ 24,1 đến 25,5 °C, và khí nitơ được nạp vào với độ tinh khiết đạt 99,99%.

- Đóng lọ thủy tinh màu nâu 2 ml, khối lượng TEZ 50 mg/lọ, số lượng: 150 lọ

- Thời gian sản xuất: 01 ngày (ngày 31/05/2018)

3.3.2.3 Đánh giá độ đồng nhất của chất chuẩn TEZ

Lấy 10 lọ trong tổng số lọ chuẩn TEZ đóng được, xác định hàm lượng TEZ trong từng lọ bằng phương pháp HPLC trong Thường quy kỹ thuật VKN/TQKT-TT347.01 (Phụ lục 18) sử dụng chuẩn TEZ USPRS, lô G0F290 Kết quả cho thấy giá trị RSD của các giá trị hàm lượng TEZ trong các lọ < 1,0%; như vậy lô chuẩn terazosin đóng lọ ngày 31/05/2018 đồng nhất về hàm lượng và quy trình đóng ống ổn định (Bảng 3.44).

Bảng 3.44 Kết quả đánh giá độ đồng nhất hàm lượng chất chuẩn TEZ

TT Sô TT đóng lọ Hàm lượng TEZ nguyên trạng (%)

3.3.2.4 Kiểm tra chất lượng sản phẩm chất chuẩn TEZ và đánh giá liên phòng thí nghiệm

Sản phẩm chất chuẩn TEZ được đánh giá qua hai khoa: Khoa Thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu (TLCC - CĐC) kiểm tra chất lượng tất cả các chỉ tiêu, cùng với Khoa Vật lý đo lường (VLĐL) kiểm tra chỉ tiêu định lượng Tài liệu thử áp dụng theo quy định kỹ thuật VKN/TQKT-TT347.01 (Phụ lục 18) và sử dụng chất chuẩn TEZ USPRS, số lô G0F290.

Kết quả thể hiện ở Bảng 3.45.

- So sánh phương sai của hai dãy kết quả, sử dụng phần mềm Excel 2010, hàm F-test

Kết quả Fthực nghiệm = 0,176 < Ftiêu chuẩn = 0,28; như vậy 2 phương sai khác nhau không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.46).

Kết quả so sánh hàm lượng giữa hai khoa thử nghiệm được thực hiện bằng phần mềm Excel 2010, sử dụng hàm T-test cho hai tập hợp mẫu có phương sai bằng nhau Các giá trị thu được từ phân tích cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa hai nhóm, hỗ trợ cho việc đánh giá hiệu quả của từng khoa.

/Tthực nghiệm / = 1,351 < Ttiêu chuân = 2,145; như vậy kết quả phân tích của các KTN khác nhau không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.47).

Bảng 3.45 Kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm chất chuẩn TEZ

Khoa TLCC-CĐC Khoa VLĐL

Mô tả Bột kết tinh màu trăng Độ trong và màu săc dung dịch Đạt Định tính:

- Phản ứng của ion Cl- Đúng Đúng Đúng Mất khối lượng do làm khô (TGA) Đạt (0,46%) Tạp acid tetrahydro-2- furancarboxylic < 0,1% Đạt (0,02%) Tạp 1-[(tetrahydro-2- furanyl)carbonyl]piperazin Đạt (Không có)

- Tạp rửa giải trước TEZ < 0,3%

- Tổng tạp: < 0,6% Đạt (0,03%) Đạt (Không có) Đạt (0,01%) Đạt (Không có) Đạt (0,04%) Định lượng:

Bảng 3.46 Số liệu so sánh 2 phương sai của các giá trị hàm lượng TEZ m| ^ / 1 * 1 * Thông so thong kê Dãy kêt quả 1 Dãy kêt quả 2

Bảng 3.47 Số liệu so sánh giá trị hàm lượng chuẩn TEZ của 2 khoa thử nghiệm m| ^ ^ /1 /V 1

Thông số thống kê Dãy kêt quả 1 Dãy kêt quả 2

3.3.2.5 Tính giá trị công bố trên chứng chỉ phân tích của chất chuẩn TEZ

♦♦♦ Tập hợp kết quả xác định hàm lượng sản phẩm chất chuẩn TEZ (Bảng 3 48).

TT Hàm lượng N T (%) TT Hàm lượng N T (%)

Các thông số thống kê

♦♦♦ Giá trị công bố trên chứng chỉ phân tích của chất chuẩn TEZ

- Chất chuẩn terazosin SKS: WS.0118347.01 (Hình 3.44, Phụ lục 22)

- Độ không đảm bảo đo mở rộng: U: ± 0,12% , với hệ số phủ k = 2 ở độ tin cậy 95%.

Hình 3.44 Chất chuẩn terazosin hydroclorid thiết lập được 3.3.3 Thiết lập tạp chuẩn A

3.3.3.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu IA T

Kiểm tra chất lượng nguyên liệu IAT, số lô IAT2017, theo quy định kỹ thuật VKN/TQKT-TT344.01 (Phụ lục 19) đã được thực hiện Các phép thử định tính và định lượng sử dụng chất chuẩn IAT USPRS, số lô F0C245 Kết quả cho thấy nguyên liệu IAT lô IAT2017 đạt tiêu chuẩn để sản xuất chuẩn (Bảng 3.49).

Bảng 3.49 Kêt quả kiểm tra chất lượng nguyên liệu IAT

TT Chỉ tiêu Kết quả

1 Mô tả Bột kêt tinh màu trắng

Phản ứng của ion Cl" Đúng

4 Mất khối lượng do làm khô (TGA): < 3% Đạt (2,20%)

6 Định lượng: 98,0 - 102,0% HL khan Đạt

3.3.3.2 Đóng lọ tạp chuẩn IA T

Sử dụng buồng đóng chuẩn chuyên dụng Glove box Labconco giúp kiểm soát nhiệt độ và độ ẩm hiệu quả Điều kiện lý tưởng để đóng lọ thực tế bao gồm độ ẩm dưới 2%, nhiệt độ từ 23,9 đến 25,0 °C, và nạp khí nitơ với độ tinh khiết 99,99%.

- Đóng lọ thủy tinh màu nâu 2 ml, khối lượng IAT 20 mg/lọ, số lượng: 100 lọ

- Thời gian sản xuất: 01 ngày (ngày 15/08/2017)

3.3.3.3 Đánh giá độ đồng nhất của tạp chuẩn IA T

Lấy 10 lọ trong tổng số lọ tạp chuẩn IAT đóng được, xác định hàm lượng IAT trong từng lọ bằng phương pháp HPLC trong Thường quy kỹ thuật VKN/TQKT- TT344.01 (Phụ lục 19), sử dụng tạp chuẩn IAT USPRS, lô F0C245 Kêt quả cho thấy giá trị RSD của các giá trị hàm lượng IAT trong các lọ < 1,0%; như vậy lô sản phẩm tạp chuẩn IAT đóng lọ ngày 15/08/2017 đồng nhất về hàm lượng và quy trình đóng ống ổn định (Bảng 3.50).

Bảng 3.50 Kết quả đánh giá độ đồng nhất hàm lượng tạp chuẩn IAT

TT Sô TT đóng lọ Hàm lượng IATnguyên trạng (%)

3.3.3.4 Kiêm tra chất lượng sản phâm tạp chuân IA T và đánh giá liên phòng thí nghiệm

Sản phẩm tạp chuẩn IAT được kiểm tra chất lượng bởi hai khoa: Khoa TLCC - CĐC đánh giá tất cả các chỉ tiêu chất lượng, trong khi Khoa VLĐL thực hiện kiểm tra các chỉ tiêu định lượng Tài liệu thử nghiệm được sử dụng trong quá trình này.

Thường quy kỹ thuật VKN/TQKT-TT344.01 (Phụ lục 19), sử dụng chất chuẩn IAT USPRS, số lô F0C245 Kết quả thể hiện ở Bảng 3.51.

Bảng 3.51 Kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm tạp chuẩn IAT

Khoa TLCC-CĐC Khoa VLĐL

Mô tả Bột kết tinh màu trăng Định tính: - IR Đúng \

Nhiệt độ nóng chảy Đạt (219,6 °C) \

Mất khối lượng do làm khô

- Tổng tạp < 1,0% Đạt (0,02%; 0,02%) Đạt (0,04%) \ Định lượng:

So sánh phương sai của hai dãy kết quả bằng phần mềm Excel 2010 sử dụng hàm F-test cho thấy Fthực nghiệm = 0,656, lớn hơn Ftiêu chuẩn = 0,287, điều này chứng tỏ hai phương sai khác nhau (Bảng 3.52) Kết quả này cũng áp dụng cho việc so sánh hàm lượng của hai khoa thử nghiệm.

Excel 2010, hàm T-test áp dụng cho hai tập hợp mẫu có phương sai không bằng nhau

Kêt quả giá trị /Tthực nghiệm/ = 0,574 < Ttiêu chuân = 2,262; như vậy kêt quả phân tích của

2 khoa thử nghiệm khác nhau không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.53).

Bảng 3.52 Số liệu so sánh 2 phương sai của các giá trị hàm lượng IAT m| ^ / 1 Ả 1 /\

Thông số thống kê Dãy kết quả 1 Dãy kết quả 2

Bảng 3.53 Số liệu so sánh giá trị hàm lượng tạp chuẩn IAT của 2 khoa thử nghiệm m| ^ ^ /1 /V 1

Thông số thống kê Dãy kết quả 1 Dãy kết quả 2

3.3.3.5 Tính giá trị công bố trên chứng chỉ phân tích sản phẩm tạp chuẩn IA T

❖ Tập hợp kết quả xác định hàm lượng sản phẩm tạp chuẩn IA T (Bảng 3.54)

Bảng 3.54 Tập hợp kêt quả hàm lượng tạp chuẩn IAT của các khoa thử nghiệm

TT Hàm lượng N T (%) TT Hàm lượng N T (%)

Các thông số thống kê

♦♦♦ Giá trị công bố trên chứng chỉ phân tích của tạp chuẩn IA T

- Tạp chuẩn A của terazosin SKS: WS.0117344.01 (Hình 3.45, Phụ lục 22)

- Hàm lượng: 97,26% C 14 H 19 N 5 O 2 2HCI (nguyên trạng)

- Độ không đảm bảo đo mở rộng: U: ± 0,23% , với hệ số phủ k = 2 ở độ tin cậy 95%.

^ Hình 3.45 Tạp chuẩn A thiết lập được 3.3.4 Thiết lập tạp chuẩn B

3.3.4.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu IB T

Kiểm tra chất lượng nguyên liệu IBT, lô IBT2017, được thực hiện theo Thường quy kỹ thuật VKN/TQKT-TT345.01 (Phụ lục 20), bao gồm các phép thử định tính và định lượng với chất chuẩn IBT USPRS (lô F0C218) Kết quả cho thấy nguyên liệu IBT lô IBT2017 đạt tiêu chuẩn sản xuất chuẩn (Bảng 3.55).

Bảng 3.55 Kết quả kiểm tra chất lượng nguyên liệu IBT

TT Chỉ tiêu Kết quả

1 Mô tả Bột kết tinh màu trắng

3 Nhiệt độ nóng chảy Đạt (247,3 °C)

4 Mất khối lượng do làm khô (TGA): < 1% Đạt (0,60%)

6 Định lượng: 98,0 - 102,0% HL khan Đạt

Bảng 3.57 Kết quả kiểm tra chất lượng sản phẩm tạp chuẩn IBT

Khoa TLCC-CĐC Khoa VLĐL

Mô tả Bột kết tinh màu trắng Định tính: \

Nhiệt độ nóng chảy Đạt (247,6 °C)

Mất khối lượng do làm khô

- Tổng tạp: < 1,0% Đạt (0,48%) \ Định lượng: Đạt Đạt

- So sánh phương sai của hai dãy kết quả, sử dụng phần mềm Excel 2010, hàm F-test

Kết quả Fthực nghiệm = 2,146 < Ftiêu chuẩn = 4,772; như vậy 2 phương sai khác nhau không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.58).

Kết quả so sánh hàm lượng giữa hai khoa thử nghiệm được thực hiện bằng phần mềm Excel 2010, sử dụng hàm T-test cho hai tập hợp mẫu có phương sai bằng nhau Giá trị T thực nghiệm là 0,953, nhỏ hơn giá trị T tiêu chuẩn 2,145, cho thấy sự khác biệt trong kết quả phân tích giữa hai khoa thử nghiệm không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.59).

Bảng 3.58 Số liệu so sánh 2 phương sai của các giá trị hàm lượng IBT m | ^ ^ / 1 /V 1

Thông so thong kê Dãy kêt quả 1 Dãy kêt quả 2

Bảng 3.59 Số liệu so sánh giá trị hàm lượng tạp chuẩn IBT của 2 khoa thử nghiệm rr Tí SI ^ 1 Ị s\

Bảng 3.62 Kết quả đánh giá độ đồng nhất hàm lượng tạp chuẩn ICT

3.3.6 Đánh giá độ ổn định của các sản phẩm chất chuẩn, tạp chuẩn thiết lập được

Mô tả B ộ t k ế t t i n h m à u t r ắ n g Độ trong và màu sắc dung dịch Đ ạ t Đ ạ t Đ ạ t Đ ạ t Định tính: - I R

Mât khối lượng do làm khô : s < 1 % Đ ạ t ( 0 , 4 6 % ) Đ ạ t ( 0 , 4 7 % ) Đ ạ t ( 0 , 4 5 % ) Đ ạ t ( 0 , 4 7 % )

Tạp 1-[(tetrahydro-2- furanyl)carbonyl] piperazin: < 0 , 1 % Đ ạ t ( K o c ó ) Đ ạ t ( K o c ó ) Đ ạ t ( K o c ó ) Đ ạ t ( K o c ó )

Nhiệt độ nóng chảy: 3 0 3 - 3 0 7 oC Đ ạ t ( 3 0 5 , 3 ° C ) Đ ạ t ( 3 0 5 , 9 ° C ) Đ ạ t ( 3 0 5 , 6 ° C )

Mât khối lượng do làm khô: < 1 % Đ ạ t ( 0 , 5 8 % ) Đ ạ t ( 0 , 5 9 % ) Đ ạ t ( 0 , 5 9 % )

Bảng 3.69 Kết quả đánh giá độ ổn định tạp chuẩn IAT 0 tháng - 15 tháng

Mât khối lượng do làm khô : Đ ạ t ( 2 , 1 9 % ) Đ ạ t ( 2 , 2 0 % ) Đ ạ t ( 2 , 2 1 % ) Đ ạ t ( 2 , 2 3 % ) Đ ạ t ( 2 , 2 3 % ) Đ ạ t ( 2 , 2 5 % )

Bảng 3.70 Kết quả đánh giá độ ổn định tạp chuẩn IBT 0 tháng - 15 tháng

Mât khối lượng do làm khô : Đ ạ t ( 0 , 6 1 % ) Đ ạ t ( 0 , 5 9 % ) Đ ạ t ( 0 , 6 1 % ) Đ ạ t ( 0 , 6 0 % ) Đ ạ t ( 0 , 6 2 % ) Đ ạ t ( 0 , 6 4 % )

3.3.7 Sử dụng các chất chuẩn, tạp chuẩn thiết lập được trong kiểm nghiệm terazosin

TT Chỉ tiêu Yêu câu Kêt quả

BÀN LUẬN

VỀ TỔNG HỢP CÁC NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN, TẠP CHUẨN

4.1.1 Bàn luận chung về các quy trình tổng hợp các nguyên liệu thiết lập chuẩn

4.1.2 Về quy trình tổng hợp terazosin hydroclorid

4.1.3 Về quy trình tổng hợp tạp A

DMF và IAM là hai loại dung môi mới được gợi ý trong các tài liệu về tổng hợp các dẫn chất có cấu trúc tương tự IAT Kết quả cho thấy ô-butanol và DMF chỉ tạo ra rất ít sản phẩm, không thể phân lập được, vì vậy không thể đánh giá hiệu suất Ngược lại, IAM đã tạo ra một lượng sản phẩm kết tủa đáng kể ngay từ điều kiện nhiệt độ phản ứng, do đó IAM đã được lựa chọn làm dung môi phản ứng.

Khi khảo sát nhiệt độ thích hợp cho phản ứng tổng hợp tạp A, tỷ lệ ACDQ: piperazin được sử dụng là 1:1, như đề xuất ban đầu Phản ứng được chia thành hai giai đoạn với nhiệt độ khác nhau: giai đoạn 1 diễn ra ở 120 ± 5 °C để phản ứng thế ái nhân hoàn toàn, trong khi giai đoạn 2 ở 70 °C để kết tủa sản phẩm Giai đoạn 1 yêu cầu kiểm soát nhiệt độ chính xác, vì nếu không đạt 115 °C, phản ứng sẽ không xảy ra; ngược lại, nếu vượt quá 125 °C, piperazin sẽ phân hủy, dẫn đến hỗn hợp chuyển màu nâu đen và không thu được sản phẩm Chỉ ở 120 °C, IAT mới hình thành và phản ứng đạt đến cân bằng Trong giai đoạn 2, nếu nhiệt độ vượt quá 70 °C, hiệu suất phản ứng sẽ giảm do sản phẩm hòa tan một phần trong IAM; còn nếu dưới 60 °C, piperazin dư sẽ lẫn vào sản phẩm.

Tỷ lệ mol giữa ACDQ và piperazin đã được nghiên cứu ở các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 và 1:6, trong đó tỷ lệ 1:5 được chọn vì mang lại hiệu suất tổng hợp cao nhất mà không có piperazin dư thừa, như thấy trong Bảng 3.3 và Hình 3.3.A Để tối ưu hóa hiệu suất tổng hợp, luận án đã cố định số mol ACDQ và tăng dần số mol piperazin, với hai lý do chính: thứ nhất, piperazin có giá thành thấp hơn nhiều so với ACDQ (chưa đến 1 triệu đồng cho 1 kg piperazin so với gần 10 triệu đồng cho 2S g ACDQ); thứ hai, nếu tỷ lệ ACDQ cao hơn piperazin, sẽ có nguy cơ cao tạo ra tạp chất.

C có tỷ lệ cao trong sản phẩm IAT do phản ứng giữa phân tử ACDQ và piperazin tạo ra ICT, điều này gây khó khăn trong quá trình tinh chế IAT.

Thời gian phản ứng được khảo sát trong hai giai đoạn, với giai đoạn 1 tiến hành tổng hợp trong khoảng 1 đến 6 giờ và giai đoạn 2 từ 5 đến 20 giờ Kết quả cho thấy hiệu suất tăng dần theo thời gian, đặc biệt giữa 5 giờ và 6 giờ ở giai đoạn 1, cũng như giữa 15 giờ và 20 giờ ở giai đoạn 2, đều đạt hiệu suất cao nhất và tương đương nhau Do đó, thời gian tối ưu được chọn là 5 giờ ở 120°C cho giai đoạn 1 và 15 giờ ở 70°C cho giai đoạn 2, giúp tiết kiệm thời gian trong quá trình phản ứng.

Quá trình chuyển đổi IAT từ dạng base sang dạng muối hydroclorid đã tiết kiệm được 52 giờ so với phương pháp tổng hợp tạp A của Nageswara RR và cộng sự Để đạt được sản phẩm IAT dạng muối hydroclorid tương tự như tạp chuẩn IAT USPRS, phản ứng giữa IAT base và acid HCl trong methanol được thực hiện Sản phẩm sau phản ứng chứa tạp chất không tan trong nước, do đó cần hòa tan trong nước để loại bỏ tạp chất này Khi hòa tan IAT thô trong 400 ml nước, một lượng lớn tạp chất dạng tủa keo lơ lửng không tan xuất hiện, nhưng với lượng nước phù hợp, IAT gần như hoàn toàn tan và dễ dàng lọc để thu được sản phẩm tinh khiết hơn.

Phương pháp tinh chế được thực hiện bằng sắc kí cột, sử dụng hỗn hợp dung môi DCM và MeOH với các tỷ lệ phân cực tăng dần là (9:1), (7:3) và (6:4) Các tỷ lệ này đã được lựa chọn vì khả năng tinh chế tốt nhất trong số các hệ dung môi đã khảo sát.

- Về độ tinh khiết của sản phẩm IAT: Giới hạn tạp chất trong IAT xác định bằng

Phương pháp HPLC và TLC đã cho kết quả thống nhất với sai số không quá 1% TLC được sử dụng để đánh giá giới hạn tạp chất trong sản phẩm IAT, triển khai trên 4 hệ dung môi pha động khác nhau Trong đó, hệ 1A sử dụng thuốc thử ninhydrin để phát hiện piperazin, do piperazin không hấp thụ UV, trong khi 3 hệ còn lại (hệ 2A, 3A, 4A) áp dụng 2 bước sóng phát hiện khác nhau (254 nm và 312 nm) Tất cả 4 hệ pha động này đều cho kết quả sắc ký gọn gàng, với IAT tách hoàn toàn khỏi TEZ và ACDQ, đảm bảo độ tin cậy trong việc đánh giá tạp chất Kết quả TLC ban đầu cho thấy sản phẩm IAT khá tinh khiết, trong khi phương pháp HPLC xác định có 2 tạp chất trong sản phẩm IAT, mỗi tạp không vượt quá 0,5% và tổng tạp không quá 1,0%.

Sản phẩm thu được từ quy trình tổng hợp IAT có độ tinh khiết cao, với hàm lượng trên 99% và tạp chất dưới 1,0%, cho phép thiết lập chuẩn chất lượng Ứng dụng đầu tiên của quy trình này là trong giai đoạn tạo tạp A dạng base, mở ra khả năng tổng hợp hiệu quả hơn.

15 g tạp A dạng base làm nguyên liệu để nghiên cứu qui trình tổng hợp ICT.

4.1.4 Về quy trình tổng hợp tạp BChưa thấy có công bố nào về qui trình tổng hợp tạp B của terazosin Quy trình tổng hợp tạp B trong luận án xây dựng được dựa trên nguyên tắc diazo hóa amin thơm bậc 1 (terazosin) tạo muối diazoni rồi thủy phân muối diazoni để tạo thành IBT là 1 dẫn chất phenol có cách tiến hành đơn giản hơn so với các phương pháp tổng hợp dẫn chất phenol khác trong một số tài liệu tham khảo [6], [25], [76] lại tận dụng được nguyên liệu terazosin tổng hợp được vì cấu trúc terazosin chỉ khác cấu trúc tạp B duy nhất về nhóm amin thơm bậc nhất trong cấu trúc của terazosin đã được thay thế bằng nhóm OH phenol trong tạp B Các điều kiện tổng hợp được khảo sát kỹ lưỡng gồm: tỷ lệ mol các chất phản ứng (terazosin, NaNƠ 2 và H 2 SO 4 ), nhiệt độ phản ứng, và thời gian phản ứng.

- V ề t ỷ l ệ m o l c á c c h ấ t p h ả n ứ n g : Lựa chọn tỷ lệ mol TEZ: NaNO 2 : H 2 SO 4 là 1: 20:

Để đạt được tiêu chí hiệu suất phản ứng cao nhất với lượng tạp chất tối thiểu, cần thực hiện khảo sát theo các tỷ lệ được chỉ ra trong Bảng 3.5, Bảng 3.6, Hình 3.6 và Hình 3.7.

Nhiệt độ trong quá trình diazo hóa rất quan trọng, với khoảng 0 - 5 °C là cần thiết để tạo ra muối diazo từ amin thơm bậc nhất Đối với giai đoạn thủy phân muối diazoni, nhiệt độ từ 40 - 80 °C được khuyến nghị, nhưng thực tế cho thấy hiệu suất phản ứng thủy phân tăng khi nhiệt độ từ 40 °C đến 60 °C Tuy nhiên, khi nhiệt độ đạt 80 °C, hiệu suất giảm đáng kể, có thể do muối diazoni bị phân hủy thành sản phẩm khác không phải là dẫn chất phenol, trong khi lượng tạp chất trong sản phẩm vẫn tương đương.

Thời gian phản ứng được tối ưu hóa cho từng giai đoạn trong quy trình tổng hợp Cụ thể, giai đoạn diazo hóa được chọn thời gian phản ứng là 4 giờ, trong khi giai đoạn thủy phân muối diazoni là 2 giờ Việc tăng thời gian phản ứng trên các mức này không mang lại hiệu suất cao hơn, như thể hiện trong Bảng 3.8, đồng thời lượng tạp chất cũng không thay đổi (Hình 3.9, Hình 3.10) Do đó, lựa chọn này không chỉ phù hợp mà còn tiết kiệm được 2 giờ so với quy trình ban đầu được đề xuất trong luận án.

Phương pháp tinh chế sử dụng sắc ký cột với hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm acetonitril, cloroform, ô-hexan và methanol đã được nghiên cứu Các tỷ lệ dung môi được lựa chọn là (5: 4: 1: 0), (5: 4: 0: 0), (5: 4: 0: 1) và (5: 3: 0: 2), trong đó tỷ lệ cho khả năng tinh chế tốt nhất đã được xác định từ các hệ dung môi rửa giải đã khảo sát.

- V ề đ ộ t i n h k h i ế t c ủ a s ả n p h ẩ m I B T : Giới hạn tạp chất xác định bằng HPLC, TLC

Phương pháp TLC đã được áp dụng để đánh giá giới hạn tạp chất trong sản phẩm IBT, với kết quả thống nhất không quá 1% Ba hệ dung môi pha động 1B, 2B, và 3B, được lựa chọn từ mười hệ khảo sát, cho phép tách biệt hoàn toàn vết IBT khỏi các tạp chất IAT và TEZ, đảm bảo độ tin cậy trong việc xác định độ tinh khiết của sản phẩm Kết quả ban đầu cho thấy sản phẩm IBT có độ tinh khiết cao, với hàm lượng tạp chất dưới 1,0%, trong đó có 5 tạp chất, bao gồm 2 tạp định danh và 3 tạp không định danh, mỗi tạp không quá 0,5% Sản phẩm đạt độ tinh khiết trên 99%, đủ tiêu chuẩn để thiết lập chuẩn.

VỀ CẤU TRÚC CỦA CÁC SẢN PHẨM

Phân tích phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC và HMBC đã xác nhận rằng cấu trúc của sản phẩm TEZ hoàn toàn phù hợp với lý thuyết và các cấu trúc đã được công bố trong tài liệu tham khảo [19].

Bảng 4.2 Dữ liệu phân tích phổ NMR của TEZ (dung môi: DMSO-Jó)

4.2.2 Về cấu trúc của sản phẩm tạp A Cấu trúc của IAT được khẳng định chắc chắn bằng các phương pháp đo phổ hiện đại (IR, HRMS, NMR) và phản ứng hóa học.

Phổ IR của sản phẩm IAT cho thấy các dải hấp thụ đặc trưng cho các nhóm chức trong công thức cấu tạo So sánh với phổ IR của tạp chuẩn IAT USPRS cho thấy hệ số tương đồng đạt 99,38%, xác nhận rằng công thức phân tử và cấu tạo của chất tinh chế đúng là tạp A của terazosin theo tiêu chuẩn USP.

- Phổ HRMS (CH 3 OH) với số khối được ghi nhận tới số thập phân thứ 4 xuất hiện

4.2.3 Về cấu trúc của sản phẩm tạp B

56,21 ppm, 8 carbon vòng thơm có độ dịch chuyển 105,96 ppm; 109,97 ppm; 146,3l ppm; 150,84 ppm; 155,35 ppm, 162,97 ppm; 1 carbon của nhóm C=O có độ dịch chuyển 170,07 ppm (Phụ lục 3).

Vị trí các H và C có mặt trong phân tử IBT được khẳng định chắc chắn nhờ phân tích phổ tương tác HSQC và HMBC.

- Phổ HSQC có thể nhận ra tương tác của carbon với hydro liên kết trực tiếp với carbon đó như H 5 và C 5 , H8 và C8, H 1 l và C 1 l, H 18 và C 18 , H 12 và C 12 , H 13 , H 15 , H 16 và

Các hợp chất C13, C15, C16, H20, C21, H22, H23 và C23 cho thấy sự giao thoa tương tác của các liên kết C-H với độ dịch chuyển nhỏ hơn 8 Do đó, phổ HSQC xác nhận rằng tín hiệu có độ dịch chuyển 11,38 ppm thuộc về nhóm OH phenol (Phụ lục 3).

- Phổ HMBC cho thấy các giao thao tương tác giữa carbon và hydro ở cách xa nó 1,

2, 3 liên kết như: C 4 và H 5 , C 6 và H 5 , H 8 , C l và H 5 , H 8 , C 10 và H 5 , H 8 (Phụ lục 3)

Các dữ liệu phổ NMR của IBT được trình bày chi tiết trong Bảng 4.4.

Bảng 4.4 Dữ liệu phân tích phổ NMR của IBT (dung môi: DMSO-dó)

CTCT Vị trí Nhóm 13C-NMR Ô (ppm)

4.2.4 Về cấu trúc của sản phẩm tạp C

VỀ VIỆC XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG CHO CÁC NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN

4.3.1 Về tiêu chuẩn chất lượng của các sản phẩm

4.3.2 Bàn luận chung về phương pháp phân tích các sản phẩm IAT, IBT, ICT

4.3.3 Về xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu tạp A

Phương pháp sắc ký đã xác định được 138 vết sắc ký đẹp, với thời gian chạy ngắn và không có mùi khó chịu do ô-butanol gây ra Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp này đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, như thể hiện trong Hình 3.20.

Phương pháp HPLC định tính và định lượng IAT được phát triển dựa trên phương pháp xác định tạp chất liên quan trong chuyên luận terazosin của USP Phương pháp này đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy cao trong việc phân tích các thành phần của terazosin, góp phần nâng cao chất lượng kiểm nghiệm dược phẩm.

Phương pháp đã được điều chỉnh về bản chất và các điều kiện như nồng độ định lượng, dung môi pha mẫu và bước sóng phát hiện để phù hợp với phương pháp định lượng nguyên liệu IAT và thiết bị hiện có tại phòng thí nghiệm Phương pháp này đã trải qua quá trình thẩm định theo các tiêu chí quy định và đạt yêu cầu So với các tài liệu tham khảo, phương pháp này có những điểm tương đồng và khác biệt nhất định.

- v ề b ả n c h ấ t c ủ a p h ư ơ n g p h á p p h â n t í c h : Phương pháp xác định IAT trong USP

Phương pháp xác định giới hạn tạp chất A trong nguyên liệu terazosin và doxazosin được trình bày trong tài liệu 40 cùng với các tài liệu tham khảo khác Luận án áp dụng phương pháp định tính và định lượng để phân tích nguyên liệu IAT tinh khiết.

Nồng độ IAT trong dung dịch phân tích theo phương pháp USP 40 đạt mức cao nhất là 2 µg/ml, tuy nhiên, đây chỉ là một tạp chất có trong nguyên liệu terazosin Để đảm bảo tính chính xác trong phép định lượng, nồng độ dung dịch tiêm sắc ký trong luận án được thiết lập ở mức 15 µg/ml.

Phương pháp sử dụng dung môi pha mẫu trong luận án là một kỹ thuật pha động, đơn giản hơn so với phương pháp trong USP 40, vốn yêu cầu ba loại dung môi cho ba giai đoạn khác nhau.

Bước sóng 245 nm được chọn làm bước sóng định lượng vì tại đây IAT hấp thụ cực đại khi phân tích phổ dung dịch IAT trong pha động, với dung môi pha mẫu được sử dụng trong quá trình định lượng.

- v ề p h a t ĩ n h : Cột C8 áp dụng theo USP 40 và 1 số TLTK [41], [48], [60], [89], [90].

- v ề t h à n h p h ầ n p h a đ ộ n g và tỷ lệ pha động, nhiệt độ cột và thể tích tiêm mẫu áp dụng theo USP 40. v ề p h ư ơ n g p h á p p h â n t í c h t ạ p c h ấ t l i ê n q u a n t r o n g n g u y ê n l i ệ u I A T b ằ n g H P L C

Phương pháp HPLC được áp dụng để phân tích tạp chất trong IAT, với các điều kiện sắc ký tương tự như phương pháp định lượng IAT đã được xây dựng trong luận án Tuy nhiên, nồng độ phân tích được điều chỉnh, trong đó nồng độ dung dịch thử tạp chất tăng lên 33 lần so với nồng độ định lượng, từ 15 µg/ml lên 500 µg/ml.

4.3.4 Về xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu tạp B

4.3.5 Về xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu tạp C v ề p h ư ơ n g p h á p đ ị n h t í n h I C T b ằ n g T L C

VỀ THIẾT LẬP CÁC CHẤT CHUẨN, TẠP CHUẨN

4.4.2 Về độ ổn định của các sản phẩm

Tên chuẩn TEZ IAT IBT ICT

Chỉ tiêu tạp chất trong chất chuẩn TEZ

Tên tạp chuân IAT IBT ICT

VỀ ỨNG DỤNG CÁC SẢN PHẨM CHẤT CHUẨN, TẠP CHUẨN THIẾT LẬP ĐƯỢC TRONG KIỂM NGHIỆM

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1 Đã tổng hợp được các nguyên liệu terazosin hydroclorid (TEZ), tạp chất A của terazosin dạng muối dihydroclorid (IAT), tạp chất B của terazosin (IBT) và tạp chất C của terazosin dạng muối dihydroclorid (ICT) để thiết lập chuẩn trong đó:

2 Đã xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng cho các nguyên liệu thiết lập chuẩn TEZ, IAT, IBT, ICT tổng hợp được

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

“ X â y d ự n g p h ư ơ n g p h á p đ ị n h t í n h , đ ị n h l ư ợ n g t ạ p c h ấ t B c ủ a t e r a z o s i n ” , Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, 1 6 ( 5 9 ) , t r 1 8 - 2 3

1 B ộ K h o a h ọ c , C ô n g n g h ệ v à M ô i t r ư ờ n g ( 2 0 1 1 ) , " X á c đ ị n h c á c a n i o n h o à t a n b ằ n g s ắ c k ý l ỏ n g i o n " , Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6494-1:2011 (ISO 10304

2 B ộ Y t ế ( 2 0 1 4 ) , Thông tư 44/2014/TT-BYT Qui định việc đăng ký thuốc , t r 2 6 1

3 B ộ Y t ế ( 2 0 1 5 ) , Hóa học hữu cơ tập 2, N h à x u ấ t b ả n Y h ọ c , H à N ộ i , t r 1 3 4

6 B ộ y t ế ( 2 0 1 7 ) , Hóa học hữu cơ tập 1, N h à x u ấ t b ả n Y h ọ c , H à N ộ i , t r 3 0 5 - 3 0 6

7 B ộ Y t ế ( 2 0 1 8 ) , Dược điển Việt nam V tập 2, Phụ lục 2.5, N h à x u ấ t b ả n Y h ọ c ,

8 B ộ y t ế ( 2 0 1 8 ) , Thông tư 11/2018/TT-BYT Qui định chất lượng thuốc, nguyên liệu làm thuốc, t r 4

1 1 B ộ Y t ế , V i ệ n K i ể m n g h i ệ m t h u ố c T r u n g ư ơ n g ( 2 0 1 0 ) , Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, N h à x u ấ t b ả n Y h ọ c , H à N ộ i , t r 1 0 7

1 3 N g u y ễ n V ă n G i a n g , L ê T h ị T h u , G i ả n T h ị L a n , P h ù n g Đ ứ c H ạ n h ( 2 0 1 6 ) , " T ổ n g h ợ p v à t i n h c h ế 4 - a m i n o p h e n o l đ ể l à m t ạ p c h u ẩ n s ử d ụ n g t r o n g k i ể m t r a c h ấ t l ư ợ n g n g u y ê n l i ệ u v à c á c d ạ n g b à o c h ế c ủ a p a r a c e t a m o l " , Hội nghị Khoa học công nghệ Tuổi trẻ trường Đại học Dược Hà Nội lần thứ XVIII, t r 1 1 7 - 1 2 4

1 4 H i ệ p h ộ i d o a n h n g h i ệ p D ư ợ c V i ệ t N a m ( 2 0 1 3 ) , Sổ tay đăng ký thuốc, t r 2 8 - 3 5

1 5 T r ầ n Đ ứ c H ò e ( 2 0 0 6 ) , Uphì đại lành tính tuyến tiền liệt, N h à x u ấ t b ả n k h o a h ọ c v à k ỹ t h u ậ t , t r 8 3 - 8 7

G u a i f e n e s i n đ á p ứ n g t i ê u c h u ẩ n k i ể m n g h i ệ m t h u ố c " , Đề tài khoa học cấp cơ sở Đại Học Dược TP HCM

2 0 N g u y ễ n H ả i N a m , N g u y ễ n T h ị K i ề u A n h , N g ô Q u a n g T r u n g , N g u y ễ n T h ị H u y ề n , Đ ỗ N g u y ễ n T h a n h C ầ n , T r ầ n T h ú y H ạ n h , L ê K i m D u n g ( 2 0 1 1 ) , " Đ á n h g i á c h ấ t l ư ợ n g n g u y ê n l i ệ u t e r a z o s i n H C l t ổ n g h ợ p t ạ i V i ệ t N a m " , Tạp chí Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 1 ( 2 ) , t r 9 - 1 2

2 1 N g u y ễ n B ì n h N g u y ê n ( 2 0 1 5 ) , Bước đầu nghiên cứu tổng hợp và thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid, L u ậ n v ă n t h ạ c s ĩ d ư ợ c h ọ c , T r ư ờ n g Đ ạ i h ọ c D ư ợ c H à

2 5 T h á i D o ã n T ĩ n h ( 2 0 0 8 ) , Cơ chế và phản ứng hóa học hữu cơ, N h à x u ấ t b ả n k h o a h ọ c v à k ĩ t h u ậ t H à N ộ i , t r 1 3 3

2 6 T h á i N g u y ễ n H ù n g T h u ( 2 0 0 5 ) , Ứng dụng tin học trong một số công tác dược,

2 9 T r ư ờ n g Đ ạ i h ọ c D ư ợ c H à N ộ i , B ộ m ô n C ô n g n g h i ệ p D ư ợ c ( 2 0 1 5 ) , Kỹ thuật sản xuất Dược phẩm, N h à x u ấ t b ả n Y h ọ c , H à N ộ i , t r 5 7 , 7 8 - 8 0

3 0 V i ệ n K i ể m n g h i ệ m t h u ố c T r u n g ư ơ n g ( 2 0 1 2 ) , Tài liệu tập huấn thẩm định và phê duyệt phương pháp thử cho toàn hệ thống, D ự á n “ H ỗ t r ợ h ệ t h ố n g Y t ế ” d o q u ỹ t o à n c ầ u t à i t r ợ

3 1 V i ệ n K i ể m n g h i ệ m t h u ố c T r u n g ư ơ n g ( 2 0 1 3 ) , Đào tạo kỹ thuật thiết lập chất chuẩn, chất đối chiếu, D ự á n " H ỗ t r ợ h ệ t h ố n g Y t ế ” d o q u ỹ t o à n c ầ u t à i t r ợ

3 2 V i ệ n K i ể m n g h i ệ m t h u ố c T r u n g ư ơ n g ( 2 0 1 6 ) , Thiết lập và hiệu chuẩn chất chuẩn, ống chuẩn độ, T h ủ t ụ c V K N / T T / 2 1 2 0 , b a n h à n h l ầ n 7

3 3 V i ệ n K i ể m n g h i ệ m t h u ố c T r u n g ư ơ n g ( 2 0 1 6 ) , Thủ tục Thẩm định/ đánh giá phương pháp phân tích trong dược điển và tiêu chuẩn cơ sở. r p \ • 1 ằ Ạ r p • A _ r * _ 1_

3 4 A b b o t t l a b o r a t o r i e s ( 2 0 1 0 ) , Specifications and routine tests o f terazosin tablets.

3 5 A b r a h a m D J ( 2 0 0 3 ) , Burger’s medicinal chemistry drug discovery, p p 1 5 - 1 6

3 7 A n a s t a s i o s T , R a n d a l l G R , N a t a s h a K ( 2 0 0 4 ) , " T h e r o l e o f a - b l o c k e r s i n t h e m a n a g e m e n t o f p r o s t a t e c a n c e r " , Journal Expert Opionion on Pharmacotherapy ,

3 9 A S E A N ( 2 0 1 2 ) , Asean guidelines for validation and analytical procedures.

4 0 A S E A N d o c u m e n t g u i d e l i n e s ( 2 0 0 7 ) , Guidelines for the establishment, handling, storage and use o f Asean reference substances.

4 4 B h a n j i a S , D e e p t h i K L , N e e l i m a V ( 2 0 1 3 ) , " D e v e l o p m e n t a n d e v a l u a t i o n o f s u b l i n g u a l t a b l e t s o f t e r a z o s i n h y d r o c h l o r i d e " , Word Journal o f Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3 ( 2 ) , p p 2 4 1 2 - 2 4 3 0

4 7 C o m m i t t e e o n A S E A N r e f e r e n c e s u b s t a n c e s ( 2 0 0 5 ) , Guidelines for The establishment, handling, storage and use o f Asean reference substances.

5 3 G u i d e A O A C ( 2 0 1 2 ) , General requirement for the competence o f Reference material producers.

5 5 I S O 1 3 5 2 8 : 2 0 0 5 ( 2 0 0 5 ) , Statistical method for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons.

5 6 J o h n H M B M ( 2 0 0 7 ) , " P h a r m a c e u t i c a l R e f e r e n c e S t a n d a r d s , Q L C t r a i n i n g s e m i n a r , T a n z a n i a 5 - 7 / 1 2 / 2 0 1 7 " , WHO/European Directorate for the Quality o fDrug and Healthcare.

P h a r m a c o p o e i a m e t h o d f o r T e r a z o s i n u s i n g m o d e l i n g w i t h m a s s s p e c t r o m e t r i c p e a k t r a c k i n g " , Journal o f Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 1 3 5 , p p 8

7 0 N a i k P P ( 2 0 1 1 ) , Design and synthesis o f some multitargeted ligands as potential antihypertensive agents , T h e d e g r e e o f d o c t o r o f p h i l o s o p h y i n p h a r m a c y , S a y a j i r a o U n i v e r s i t y o f B a r o d a p p 9 8

7 3 O j h a T , B a k s h i M , C h a k r a b o r t i A K , e t a l ( 2 0 0 3 ) , " T h e I C H g u i d a n c e i n p r a c t i c e : s t r e s s d e c o m p o s i t i o n s t u d i e s o n t h r e e p i p e r a z i n y l q u i n a z o l i n e a d r e n e r g i c r e c e p t o r - b l o c k i n g a g e n t s a n d c o m p a r i s o n o f t h e i r d e g r a d a t i o n b e h a v i o u r " , Journal o f Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 3 1 ( 4 ) , p p 7 7 5

7 4 O m a r M A , M o h a m e d A I , D e r a y e a S M , e t a l ( 2 0 1 8 ) , " A n e f f i c i e n t s p e c t r o f l u o r i m e t r i c m e t h o d a d o p t s d o x a z o s i n , t e r a z o s i n a n d a l f u z o s i n c o u p l i n g w i t h o r t h o p h t h a l a l d e h y d e : A p p l i c a t i o n i n h u m a n p l a s m a " , Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 1 9 5 , p p 2 1 5 - 2 2 2

9 7 W H O d o c u m e n t g u i d e l i n e s ( 2 0 0 6 ) , General guidelines for the establishment, maintance and distribution o f chemical reference substances

Phụ lục Tên phụ lục Trang

Phụ lục l: Bộ dữ liệu phổ của sản phẩm TEZ

Kết quả chồng phổ IR của mẫu thử TEZ và mẫu chuẩn TEZ USP

TEZ£R OSlM_DATC _ 1 801 31 104624 ¡t nh4oac 2/3/2018 10:45:08 MI

Phổ ‘H-NMR của TEZ ỈỈH

■ T n jy - ẽ õ ùi ùù s m H ỏ je 1 C ! \U ? a ùs \M !S i\ D Q S i( c -2 -5 \T ợr j y fui d d l I J se, M l SOI 0 1 1 s ị ị

"T ợr jy -I a ùi ợù ùs ln HM UC 1 c ! 5 - ẽS n T ĩ ', Da s ĂC Sẽ 'S T ẽI U [w d d ] ỉa

Phụ lục 2: Bộ dữ liệu phổ của sản phẩm IAT

Sample: Terazosin tap A (NL) (4/8/2017) Operator: Le Thi Thanh Huyen

Kết quả chồng phổ IR của mẫu thử IAT và mẫu chuẩn IAT USP

D a te r i x a ” rX5TR-M FRQEHD F-'IFROG TD SOLVENT

14 5 7 r o a s t asn FA EE I " EE/ ag33

EFOl JTu'Cl Fl PLXl

Phổ HSQC của IAT he s

PL ló fu id d ] H (to s í AS SS ằ9 S9 lu id d l H

Phô UV của IAT trong dung môi pha mẫu định lượng

Ngày đăng: 10/10/2022, 14:31

HÌNH ẢNH LIÊN QUAN

Hình  1.2. Một số biệt dược chứa terazosin - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
nh 1.2. Một số biệt dược chứa terazosin (Trang 23)
Hình  1.3. Sơ đồ tổng hợp terazosin của Manoury .P.M và cộng sự - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
nh 1.3. Sơ đồ tổng hợp terazosin của Manoury .P.M và cộng sự (Trang 24)
Hình  1.10. Sơ đồ tổng hợp terazosin tại Việt Nam - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
nh 1.10. Sơ đồ tổng hợp terazosin tại Việt Nam (Trang 27)
Bảng 1.11. Một số phương pháp kiểm nghiệm viên TEZ - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
Bảng 1.11. Một số phương pháp kiểm nghiệm viên TEZ (Trang 40)
Bảng 1.12. Một số phương pháp định lượng đồng thời TEZ và các thuốc ức chế a l- - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
Bảng 1.12. Một số phương pháp định lượng đồng thời TEZ và các thuốc ức chế a l- (Trang 41)
Hình 2.3.  Sơ đồ tổng hợp IBT - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
Hình 2.3. Sơ đồ tổng hợp IBT (Trang 57)
Hình 3.4.  Sơ đồ quy trình tổng hợp IAT - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
Hình 3.4. Sơ đồ quy trình tổng hợp IAT (Trang 69)
Hình 3.11. Sơ đồ quy trình tổng hợp IBT - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
Hình 3.11. Sơ đồ quy trình tổng hợp IBT (Trang 74)
Hình 3.16. Sơ đồ qui trình tổng hợp ICT - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
Hình 3.16. Sơ đồ qui trình tổng hợp ICT (Trang 79)
Hình 3.17. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm ICT bằng TLC - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
Hình 3.17. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm ICT bằng TLC (Trang 80)
Hình 3.19. Sắc ký đồ khảo sát pha động định tính IAT bằng TLC - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
Hình 3.19. Sắc ký đồ khảo sát pha động định tính IAT bằng TLC (Trang 83)
Bảng 3.20. Các chỉ tiêu chất lượng cho nguyên liệu IAT - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
Bảng 3.20. Các chỉ tiêu chất lượng cho nguyên liệu IAT (Trang 92)
Hình 3.26. sắc ký đồ khảo sát pha động định tính IBT bằng TLC - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
Hình 3.26. sắc ký đồ khảo sát pha động định tính IBT bằng TLC (Trang 93)
Hình 3.29. Kết quả xác định độ tinh khiết của pic IBT chuẩn và pic IBT thử - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
Hình 3.29. Kết quả xác định độ tinh khiết của pic IBT chuẩn và pic IBT thử (Trang 96)
Bảng 3.25. Số liệu độ ổn định cùa chất phân tích khi định lượng IBT - (LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin
Bảng 3.25. Số liệu độ ổn định cùa chất phân tích khi định lượng IBT (Trang 99)

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN