LIỆU PHÁP GEN TRONG ĐIỀU TRỊ DO ĐỘT BIẾN

LIỆU PHÁP GEN TRONG ĐIỀU TRỊ DO ĐỘT BIẾN I Liệu pháp gen 1 Liệu pháp gen là gì? Liệu pháp gen là tập hợp các kỹ thuật đưa gen liệu pháp ( gen lành hay gen cần thiêt) vào tế bào người bệnh để thay thế,.

LIỆU PHÁP GEN TRONG ĐIỀU TRỊ DO ĐỘT BIẾN I.Liệu pháp gen 1.Liệu pháp gen gì? Liệu pháp gen tập hợp kỹ thuật đưa gen liệu pháp ( gen lành hay gen cần thiêt) vào tế bào người bệnh để thay thế, sửa chữa, kiềm chế gen bị hỏng phục hồi gen bị hỏng(bị lỗi, bị sai lệch) nhằm phục hồi cố chức gen bị sai hỏng chữa bệnh rối loạn di truyền 2.Gen liệu pháp gì? Gen liệu pháp: gen có chức sử dụng vào điều trị bệnh cho người Mỗi loại gen liệu pháp có đặc điểm chức riêng Các loại gen liệu pháp - Các gen hoạt động bình thường (cịn gọi gen lành) đưa vào tế bào sống để thay gen hỏng, gen chức năng, khôi phục hoạt động bình thường tế bào sống thể - Là gen có khả mã hoá protein đặc hiệu, đưa vào tế bào sống tạo nên loại protein đặc hiệu Các loại protein đặc hiệu ức chế hoạt động gen khác tế bào, kìm hãm khả phân chia tế bào gây chết tế bào bị bênh - Những gen đưa vào tế bào hoạt động đồng thời với gen bệnh (gen bị đột biến tế bào), làm hạn chế tác động gen bệnh hỗ trợ, bù đắp cho gen bị hỏng - Gen liệu pháp “các gen bị bất hoạt” đưa vào tế bào thay cho gen lành đó, nhằm hạn chế sản phấm không cần thiết gen lành tạo cho tế bào trạng thái mới, có tác động chống lại bệnh tật - Gen liệu pháp đoạn Oligo nucleotid, có tác động kìm hãm hoạt dộng gen bị hỏng, bị đột biến tế bào 3 Các biện pháp liệu pháp gen  Biện pháp thứ : Đưa gen lành vào thể để thay gen bệnh Là cách giải triệt để, gen lành đưa vào vị trí gen chịu tác động bình thường trình tự biểu gen  Biện pháp thứ hai: Đưa gen cần thiết thay vào vị trí gen bị sai hỏng Kỹ thuật đưa gen lạ vào thể người phức tạp, nên đưa gen cần thiết vào thể, người chưa làm chủ vị trí gắn gen nên gây tượng gen liệu pháp gắn vào sai vị trí gen Các sai lệch gây ra: • Gen đưa vào khơng nằm phức hợp điều hịa => Biểu cách tùy tiện , không nơi (đúng với loại tế bào, mô đặc hiệu) không lúc ( với chu trình phát triển cá thể), chí khơng biểu hiên • Gen đưa vào gây biểu khơng mong muốn • Gene gắn vào vị trí có khả hoạt hóa gene tiền ung thư dẫn đến biểu độ gene gây ung thư 4.Phân loại: Có loại tế bào dùng liệu pháp gen ■ Liệu pháp gen soma (Somatic Gen Therapy - SGT): phương pháp điều trị, thay hay sửa chữa gen hỏng, gen bệnh tế bào soma thể SGT liên quan đến biểu gen bên tế bào uốn nắn bệnh nhân không di truyền cho hệ sau Tế bào dùng chữa trị tế bào lympho, tế bào gan, đặc biệt dùng tế bào gốc Đây loại hình GT nghiên cứu "Viện Liệu pháp Gen người" nhiều phịng thí nghiệm khác giới ■ Liệu pháp gen tế bào mầm (Germline Gen Therapy - GGT): điều trị, sửa chữa, thay gen hỏng cho giao tử nhằm tạo hệ sau bình thường GGT liên quan đến cải biến gen tế bào mầm mà tế bào truyền đạt thay đổi cho hệ sau Hãy cịn cơng trình nghiên cứu can thiệp vào dịng mầm lý kỹ thuật đạo đức 5.Các bước liệu pháp gen (1) Tạo vector tái tổ hợp mang gen cần chuyển Trước đó, virus biến đổi để khơng cịn khả chép, đồng th ời lại có khả biểu mạnh gen cần chuyển Các biến đổi bao gồm: - Loại bỏ trình tự cần cho chép virus - Gắn trình tự promoter mạnh vào trước gen chuyển (2) Đưa vector virus mang gen lành vào tế bào nuôi cấy (3) Ghép tế bào chứa gen chuyển vào thể II.Phương pháp chuyển gen liệu pháp 1.Chuyển gen vào tế bào bên người bệnh (ex vivo) (1)Lấy tế bào bị bệnh có gen hỏng thể Tế bào chọn tế bào soma tế bào mầm (2)Dùng kỹ thuật khác để chuyển gen lành vào thay gen hỏng để tạo tế bào lành Có kỹ thuật chuyển gen sau:  Phương pháp chuyển gen vector có chất virus là: Adenovirus, Retrovirus, Herpes Simplex, Adeno-associate virus Khả xâm nhiễm đa dạng chuyên biệt Gắn chèn gen mục tiêu vào gen tế bào chủ-> biểu ổn định protein mục tiêu Phương pháp hiệu (Việc thiết kế vector liệu pháp có chất virus nhóm trình bày)  Phương pháp chuyển gen hóa học (polymer cation, liposome…) Giúp • • • • cho DNA dễ dàng bám di chuyển qua màng tế bào, màng nhân Hiệu thấp so với phương pháp chuyển gen sử dụng virus Yêu cầu nghiêm ngặt hóa chất sử dụng Phương pháp Cationic lipid (Liposome) Một phương pháp không sử dụng virus hiệu Khi cho Cationic lipid ( mang điên tích dương )vào DNA o Tập hợp DNA (mang điện tích âm) o Hình thành phức hợp lớp nhiều tầng DNA/cationic lipid Dễ dàng thấm qua màng tế bào di chuyển thơng qua q trình th ực bào Một số loại cationic lipid độc với tế bào Phương pháp Calcium Phosphate • Tạo tủa từ phức hợp DNA/CaCl2 đệm HBS 2X • Tủa có chứa DNA gắn lên bề mặt tế bào quan tâm, DNA di chuyển vào bên tế bào thong qua chế thực bào  Phương pháp chuyển gen vật lý (điện biến nạp, sung bắn gen) Thường sử dụng phương pháp chuyển gen hóa học hiệu Không phụ thuộc vào loại tế bào khơng có gi ới hạn v ề kích cỡ DNA chuyển Yêu cầu có dụng cụ chuyên bi ệt (Súng bắn gen, Máy điện biến nạp, Hệ thống vi thao tác, …) Phương pháp điện biến nạp Sử dụng dòng điện => tạo điện trường tác động lên màng tế bào thời gian cực ngắn • Xuất lổ (pore) màng tế bào vector dễ dàng di chuy ển xuyên qua màng tế bào • Thơng số điện biến nạp dịng tế bào khác • Thường gây chết tế bào • Phương pháp sung bắn gen Hệ thống bao gồm xylanh “hộp đạn” có chứa hạt vàng phủ DNA • Khi kích hoạt hệ thống, khí nén Helium giải phóng, tác động sóng siêu âm lên hạt vàng có phủ DNA h ạt di chuyển vào tế bào chất tế bào Phương pháp vi tiêm Phương pháp vi tiêm lượng nhỏ DNA tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần tế bào nguyên vẹn cách học kính hiển vi Phương cho phép đưa gen bào vị trí mong muốn tế bào với hiệu tương đối cao Tuy nhiên đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ xác nên hạn chế s ố lượng tế bào vi tiêm ngồi cịn làm tổn thương đến tế bào phôi tác nhân học gây tiến hành vi tiêm • Vi tiêm tiến hành qua bước: nạp gen vào kim tiêm phương pháp capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10-12 giờ) bơm trực tiếp dung dịch gen vào, lắp kim tiêm kim giữ vào máy vi thao tác, chuyển trứng tiền nhân vào đĩa petri có chứa mơi trường đặt kính hiển vi, giữ trứng tiền nhân vào đầu kim giữ lực hút syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phơi điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí trứng tiền nhân, đẩy gen vào trứng tiền nhân cách vặn nhẹ syringe Khi thấy trứng tiền nhân phồng to trở nên sáng dừng lại kéo nhanh kim tiêm Trứng tiền nhân sau tiêm di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước tiêm trứng tiền nhân (3) Nhân nuôi tế bào lành lên thành số lượng lớn (4) Đưa trở lại thể người bện Có thể dung phương pháp vi tiêm, sung bắn gen 2.Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh (in vivo) Bước 1: Lựa chọn vector liệu pháp thích hợp Bước 2: Tách tạo vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp (thường tạo vector virus) Virus xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào cách gắn với chúng bơm thông tin di truyền vào Bước 3: Đưa vector tái tổ hợp mang gen liệu pháp kỹ thuật chuyển gen như: vi tiêm, súng bắn gen v.v… Bước 4: Kiểm tra biểu gen liệu pháp III.Ứng dụng điều trị bệnh di truyền Bệnh ADA - SCID Là loại bệnh gây gene mã hóa enzyme adenosine deaminase b ị h ỏng, dẫn đến rối loạn chức tế bào limpho T, limpho B Khiếm khuyết miễn dịch kết hợp trầm trọng (SCID) bệnh đột biến gen adenosine deaminase (ADA) mà giữ vai trò quan trọng sản xuất sống sót tế bào bạch cầu khoẻ mạnh Để khỏi phục hoạt động bình thường gen ADA, người ta sử dụng nhiều kỷ thuật khác liệu pháp gen nhằm thay gen ADA bị sai hỏng gen bình thường Điều trị bệnh ADA-SCID liệu pháp gen khác cho kết khác Trong đó, liệu pháp gen sừ dụng retroviral vectơ chuyển gen ADA lành vào tế bào lympho T cho kết tốt Bằng liệu pháp gen ex vivo thay gen ADA lành vào gen ADA bị hỏng nhờ vector retrovirus, năm 1990 bác sỹ French Anderson Michael Blaese điều trị khói bệnh cho hai em Ashanti tuổi Cynthia tuổi, thành công liệu pháp gen chữa bệnh người 2.Điều trị ung thư Điều trị ung thư thực trị xạ, hoá chất, dạng độc tố miễn dịch, liệu pháp gen Liệu pháp gen phương pháp điều trị ung thư có hiệu Điều trị ung thư liệu pháp gen thực hi ện liệu pháp in vivo ex vivo Liệu pháp gen chữa ung thư sử dụng phương pháp invivo ,như liệu pháp điều trị ung thư gan, ung thư phổi kỹ thuật vi tiêm đưa thẳng vào khối u vector mang gen liệu pháp tương ứng, để ức chế tiêu diệt tế bào ung thư Đối với số loại ung thư điều trị phương pháp ex vivo ung thư bạch cầu , nhiều trường hợp đồng thời sử dụng hai liệu pháp Hiện bệnh ung thư loại bệnh chiếm tí lệ cao nhất, loại bệnh điều trị bàng liệu pháp gen (69%) Trong liệu pháp gen điều trị ung thư sử dụng nhiều loại vectơ liệu pháp khác nhau, retroviral vectơ, adenoviral vectơ vectơ DNA trần, plasmid sử dụng nhiều Tuỳ theo loại bệnh ung thu, phát triển kỹ thuật gcn y sinh học đại, loại vectơ sử dụng liệu pháp gen thay đổi theo thời gian khác Retroviral vectơ loại vectơ sử dụng s ớm loại vectơ liệu pháp gen Tí lệ % sử dụng retroviral vect thay đổi theo thời gian: từ năm 1988 đến 1991 sử dụng vectơ retrovirus chiếm 100%, năm 2000 chi 20%, năm 2003 chiếm 70% tổng số loại vectơ liệu pháp sử dụng Liệu pháp gen diều trị ung thư tác động trực tiếp vào khối u thực theo nhiều chiến lược khác nhau: 1- Úc chế phát triển khối 11 (Tumor suppressor ): thực liệu pháp ex vivo in vivo với viral vectơ mang gen liệu pháp p53, pRb 2- Kích hoạt tế bào chết theo chưưng trình (apoptosis): sử dụng gen liệu pháp BAX tăng cường gây kích hoạt chết theo chương trình , sử dụng gen BCL-2 để ngăn chặn phản ứng chống apoptosis (anti-apoptcitic) Trường hợp apoptosis tế bào co lại, tíích khịi tế bào xung quanh, gen ced (gen tư tử - suicide gene) hoạt hoá làm cho tế bào teo dẩn rổi chết 3- Thực liệu pháp thay gen nhằm phục hồi protein bị hỏng, phục hồi khả miễn dịch tế bào 4- Sử dụng liệu pháp antisen để kìm hãm hoạt động oncogen, ức chế tác dụng sản phẩm oncogen 5- Hạn chế phái triển khối 11 vi tim protein tiền apoptosis (pro-apoptotic protein) protein BAX (sán phẩm cùa gen BAX) interferon (TNF ), kết hợp sử dụng trị xạ diều trị hoá chất 6- Sử dụng geil tự tử ced (suicide gene) sán phẩm cùa gen tự tử “thuốc gen" ticm thẳng vào khối u, cháng hạn tiêm ganciclovir - sản phẩm cúa gen mã hoá cnzvm Thymidin Kinase có tác đụng tiêu diệt tế bào ung thư 7- Biện pháp tác dộng Irực tiếp vào tế hào ung thư- bang bao vây thành mạch (Anti-angiogenic) Đáy biện pháp chặn mối liên hệ mặt dinh dưỡng cùa tế bào ung Ìhir, làm cho tế bào ung thư thiếu dinh dưỡng chết Hiện nay, phát 40 hợp chắt tự nhiên có chức này, như: endo.statin, angiostatin Điều trị HIV/AIDS + Phòng chống HIV/AIDS cách ức chế hoạt động gen HIV, làm biến đổi gen HIV: Theo hướng liệu pháp thiết kế vector mang gen liệu pháp đưa vào tế bào, thể người bị nhiễm HIV nhằm phục hồi hệ thống miễn dịch lại không gây phản ứng phụ bất lợi cho người bệnh Các vector liệu pháp sử dụng để phòng chống HIV/AIDS andenovirus, AAV, oligonucletit, liposom v.v Vector AAV đựơc gắn gen liệu pháp nhằm hạn chế chép, nhân HIV Vector adenovirus có gắn gen HIV bị biến đổi gen gag, tpa số gen adenovirus bị biến đổi gen Ad5 tạo vector Ad5Flag, vector Ad5tpagag Khi đưa vector vào tế bào lây nhiễm HIV khả lây nhiễm HIV giảm Bên cạnh số vector liệu pháp khác như: oligo-antisens, ribozym, đựơc thử nghiệm nhằm hạn chế xâm nhiễm, hạn chế khả chéo, nhân HIV + Phòng chống HIV/AIDS tăng cường miễn dịch tế bào: Theo hướng này, người ta sử dụng gen đột biến Revio, gen tăng cường hoạt động gen cytokin, sử dụng gen tự tử gen độc tố (toxic gene) Sử dụng vector oligonucleotit mang gen ReviO chuyển vào tế bào lympho TCD4 kìm hãm xâm nhiễm HIV Cũng sử dụng liệu pháp gen tăng cường hoạt động gen cytokin tổng hợp protein đáp ứng miễn dịch Cytokin có nhiều loại khác nhau, interferon (IFNa, IFNP IFNy ) quan trọng Interferon ngăn cản xâm nhiễm loại virus có HIV Cytokin đựơc tổng hợp chủ yếu từ tế bào lympho T, có nhóm interleukin (IL1, IL2, IL13) mà chủ yếu interleukin IL2 có tác dụng kích thích tăng sinh cửa tế bào lympho TCD4 , đồng thời khống chế chép, nhân HIV Sử dụng gen tự sát (Suicide gene) gen độc tố đưa vào tế bào bị xâm nhiễm HIV liệu pháp gen để phòng chống HIV Gen tự sát đưa vào tế bào bị HIV xâm nhiễm làm ức chế hoạt động enzym chép ADN polymerase tế bào, làm cho chép DNA tế bào bị gián đoạn, tế bào co lại chết Do HIV khơng có khả lây nhiễm sang tế bào thường khác Việc sử dụng gen độc tố có thử nghiệm ban đầu chưa có kết đáng kể 4.Bệnh thiếu máu hồng cầu lưỡi liềm Bệnh thiếu máu hồng cầu liềm người chủ yếu đặc điểm hemoglobin bị thay đổi Hemoglobin người xác định hai nhóm gen, nhóm gcn a nằm nhiễm sắc thể số 16 người, nhóm gen β nằm nhiềm sắc thể số 11 người Nguyên nhân chủ yếu cùa bệnh thiếu máu hồng cầu liềm đột biến diểm gen β globin, làm thay đổi đặc điểm hemoglobin Hiện việc điều trị bệnh thiếu máu hồng cầu lưỡi liềm gặp nhiều khó khăn, kết cịn thấp Một số thực nghiệm chữa bệnh thiếu máu hồng cầu lưỡi liềm chủ yếu biện pháp tăng cường hỗ trợ hoạt động gen β globin kết hợp trị xạ hóa chất, Liệu pháp khơng chữa khỏi bệnh mà làm giảm mức độ biểu bệnh, kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân Thực hiên liệu pháp gen cách: Tách tế bào tủy xương người bện trộn chung với vector retroviral mang gen β globin bình thường để tạo tế bào tủy xương tái tổ hợp Nuôi tế bào tủy xương tái tổ hợp điều kiện thích hợp để tạo số lượng đủ lớn tế bào tủy xương mang gen β globin lành, sau tế bào đưa vào lại thể 5.Bệnh máu khó đơng Ngun nhân gây bệnh Trong máu có loại Protein giúp kiểm soát chảy máu gọi yếu tố đông máu Khi thể thiếu hụt khơng có đủ yếu tố này, yếu tố VIII IX bị mắc bệnh ưa chảy máu Điều đáng nói nhiễm sắc thể giới tính X có gene sản xuất hai yếu tố đơng máu này, có tính di truyền Phương Pháp: Khi gen đột biến làm cho protein FVIII FIX chức năng, làm giảm yếu tố đơng máu gây nên bệnh máu khó đơng Liệu pháp gen chữa bệnh sử dụng vecto liệu pháp mang gen FVIII cDNA, gen FIX cDNA bình thường vào động vật, làm tăng khả đông máu Từ đó, liệu pháp hy vọng ứng dụng cho người IV Câu hỏi Gen ReviO gì? Các phương pháp chữa bệnh phương pháp đưa vào loại tế bào nào? Giữa chuyển gen gián tiếp vào tế bào người bệnh chuyển gen trực tiếp vào tế bào người bệnh phương pháp ứng dụng nhiều nhược điểm loại? Đối với bệnh phần ứng dụng liệu pháp gen ứng dụng chuyển gen gián tiếp hay trực tiếp? ... công liệu pháp gen chữa bệnh người 2 .Điều trị ung thư Điều trị ung thư thực trị xạ, hoá chất, dạng độc tố miễn dịch, liệu pháp gen Liệu pháp gen phương pháp điều trị ung thư có hiệu Điều trị ung... thuật khác liệu pháp gen nhằm thay gen ADA bị sai hỏng gen bình thường Điều trị bệnh ADA-SCID liệu pháp gen khác cho kết khác Trong đó, liệu pháp gen sừ dụng retroviral vectơ chuyển gen ADA lành... ung thư có hiệu Điều trị ung thư liệu pháp gen thực hi ện liệu pháp in vivo ex vivo Liệu pháp gen chữa ung thư sử dụng phương pháp invivo ,như liệu pháp điều trị ung thư gan, ung thư phổi kỹ