ỨNG DỤNG của RETROVIRUS TRONG BIẾN ĐỔI GEN Ở ĐỘNG VẬT

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT Chuyên đề ỨNG DỤNG CỦA RETROVIRUS TRONG BIẾN ĐỔI GEN Ở ĐỘNG VẬT TP HỒ CHÍ MINH 03 202 1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RETROVIRUS Retrovirus là loại virus RNA, có vỏ bọc bên ngoài S.

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT Chuyên đề: ỨNG DỤNG CỦA RETROVIRUS TRONG BIẾN ĐỔI GEN Ở ĐỘNG VẬT TP HỒ CHÍ MINH 03.202 1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RETROVIRUS: Retrovirus loại virus RNA, có vỏ bọc bên Sau xâm nhiễm, genome virus chép ngược thành DNA sợi kép, hợp vào genome tế bào chủ biểu thành protein Hạt retrovirus có kích thước, hình dạng thay đổi đơi chút đường kính khoảng 100nm Vỏ virus glycoprotein, tạo thành gai màng (Hình A) Protein trưởng thành chia làm hai loại polypeptid (Hình B): - Glycoprotein vỏ bên (SU), kháng nguyên chủ yếu virus, có chức bám vào thụ quan - Glycoprotein màng (TM), bám vào protein SU vỏ, chịu trách nhiệm dung hợp màng Bên màng protein (MA), không định hình Protein bao lấy capsid (CA) CA protein phong phú hạt virus (chiếm khoảng 33 % trọng lượng tổng số), có hình khối 20 mặt Bên capsid lõi, thường có hình nón  Sơ đồ cấu trúc genome Retrovirus Genome retrovirus bao gồm hai phân tử RNA sợi đơn, mạch thẳng, có cap đầu 5’ poly A đầu 3’ (tương đương với mRNA) Genome retrovirus có kích thước khoảng 8-11kb RNA retrovirus đơn giản chứa nhóm gen chủ yếu: +Gen gag mã hóa protein lõi, capsid nucleoprotein +Gen pol mã hóa enzyme phiên mã ngược enzyme hợp +Gen env mã hóa protein cấu trúc vỏ virus Trật tự nhóm gen tất retrovirus không thay đổi 5’ – gag – pol – env – 3’ Hoạt động Retrovirus: Màng retrovirus có glycoprotein, protein dùng để liên kết với thụ quan protein tế bào vật chủ Có hai sợi RNA bên tế bào, chứa enzyme: protease, reverse transcriptase integrase Bước đầu trình chép liên kết glycoprotein với thụ quan protein Khi có liên kết với nhau, màng retrovirus phân giải thành phận tế bào chủ để sợi RNA enzyme xâm nhập tế bào Trong tế bào, enzyme reverse transcriptase tạo dây DNA phụ từ sợi RNA bị phân giải retrovirus Sợi DNA gọi cDNA Sau đó, cADN làm khn để tổng hợp sợi ADN thứ hai bổ sung với (cADN→ADN) để xâm nhập vào nhân tế bào chủ enzyme integrase Sợi cADN làm khn để tổng hợp trở lại gene virus (cADN→ARN) Ribosome dùng để chép mRNA virus thành chuỗi axit amin để tạo protein màng lưới nội bào Bước tạo enzyme vỏ protein virus RNA virus hình thành nhân Những mảnh sau tập hợp lại khỏi màng tế bào, trở thành retrovirus Cứ thế, retrovirus lại công vào tế bào chủ khác KHÁI NIỆM VECTOR - Vector phương tiện có khả mang đoạn DNA ngoại lai xâm nhập vào loại tế bào chủ thịch hợp có khả tự tái khơng phụ thuộc vào chép hệ gen tế báo chủ - Nói cách khác, vector phương tiện truyền thông tin di truyền thể thể khác  Các đặc tính vector virus: - Vector virus loại virus cắt bỏ gen độc lực gắn thêm gen thị đặc hiệu - Dễ dàng xâm nhiễm vào tế bào chủ, nhiễm vào nhiều loại vật chủ - Có khả nhân nhanh tế vào vật chủ - Khả mạng đoạn DNA có kích thước lớn 5.Cơ chế tạo vector Retrovirus: Vector retrovirus cấu trúc DNA nhân tạo có nguồn gốc từ retrovirus, sử dụng để xen DNA ngoại lai vào nhiễm sắc thể vật chủ Yếu tố chìa khóa việc sử dụng retrovirus làm thể truyền phân phối gen an tồn sinh học (biosafety) Mục đích thiết kế vector bảo đảm tạo virus không khả tái (replication incompetent virus) tế bào chủ Về nguyên tắc, tạo vector retrovirus có khả tái (replication competent retroviral vector) cách thêm trình tự cần thiết vào virus Nhưng thiết kế phổ biến thay gen virus gen chuyển mong muốn để tạo vector tái khơng hồn tồn (replication defective vector) Mặt khác, kích thước đoạn DNA ngoại lai mà vector tái khơng hồn tồn tiếp nhận lớn nhiều so với vector có khả tái Sự biểu protein retrovirus hầu hết retrovirus gây ung thư xảy tự nhiên promoter đơn (single promoter) nằm đoạn lặp dài tận (LTR) đầu 5’và biểu vùng mã hóa virus phức tạp xảy nhờ cắt ghép xen kẻ (alternative splicing) Tuy nhiên, việc thiết kế vector làkhông bị giới hạn sử dụng promoter retrovirus đơn Một hướng thiết kế khác sử dụng promoter phức (multiple promoter) trình tự tiếp nhận ribosome bên (internal ribosome entry site = IRES) Một điểm lưu ý quan trọng thiết kế vector retrovirus hiệu tái virus cấu trúc vector Phần lớn vector retrovirus thường thiết kế dựa virus Mo-MLV Ðây loại virus có khả xâm nhiễm vào tế bào chuột (có thể phát triển vector mơ hình chuột) tế bào người (có thể điều trị bệnh cho người) Các gen virus (gag, pol env) thay gen chuyển mong muốn biểu plasmid dịng tế bào đóng gói Các vùng cần thiết bao gồm đoạn lặp dài tận đầu 3’ 5’ (3’LTR 5’LTR) trình tự đóng gói -Vector retrovirus cần thiết cho liệu pháp gen, sử dụng có hiệu nhiều liệu pháp gen chữa bệnh cho người suy giảm miễn dịch thiếu hụt enzyme ADA, ung thư, tiểu đường, thiếu máu - Các vector retrovirus khác thiết kế để tạo động vật chuyển gen gà chuyển gen đặc biệt (Ronfort, Legras Verdier, 1997) Các vector mang trình tự env có khả nhận biết tế bào phôi gà PP1: Các vector mang trình tự env có khả nhận biết tế bào phôi gà Chúng tiêm vào trứng gà đẻ Ở giai đoạn chứakhoảng 60 000 tế bào Chỉ tỉ lệ nhỏ tế bào có hội mang gen chuyển nhờ vector retrovirus Gà chuyển gen tạo dạng thể khảm có hội truyền gen chuyển chúng cho hệ sau  Hiệu không cao PP2: Tiêm gen vào tế bào thực giai đoạn phôi 16 tế bào vùng lân cận tế bào mầm nguyên thủy => động vật chuyển gen => truyền gen cho hệ sau  Hiệu cao - Vector retrovirus sử dụng để chuyển gen vào nỗn bào bị khỉ (Chen, 1998, 2001) + Ðể tiến hành công việc đòi hỏi hai điều kiện đặc biệt Vỏ vector protein G VSV (vesicular somatitis virus) có chức nhận biết màng phospholipid cho phép tiêm vào nhiều loại tế bào khác + Các hạt virus tiêm vào màng (zona pellucida) màng noãn bào vào lúc màng nhân biến mất, tạo cho genome virus hội tốt để đến genome tế bào chủ (Hình 9) - Lentivirus phân lớp retrovirus Chúng có khả hợp vào genome tế bào pha nghỉ, tế bào tăng sinh tế bào khơng tăng sinh Khả có có mặt tín hiệu số protein virus Protein virus nhắm tới genome virus vùng nhân Lentivirus phức tạp retrovirus đơn giản, chứa thêm gen tat, rev, vpr, vpu, nef vif HIV loại lentivirus Vector lentivirus nghiên cứu nhiều tiềm sử dụng chúng liệu pháp gen  Ưu điểm nhược điểm vector Retrovirus: *Ưu điểm: + Hiệu biến nạp cao + Thao tác đơn giản, xâm nhiễm thực cách ủ phôi loại bỏ màng với thể virus + Phương pháp mở rộng động vật có vú khác mà khơng có vấn đề đặc biệt + Phương pháp thuận lợi cách đặc biệt cho việc chuyển gen vào chuột phương pháp vi tiêm khó sử dụng *Nhược điểm: + Các hạt virus phải kiểm sốt an tồn sinh học biện pháp thích hợp Bước ngày tiêu chuẩn hóa nhằm tăng cường sử dụng loại vector cho liệu pháp gen + Các đoạn DNA có kích thước khơng vượt q 7-9kb đưa vào vector Sự biểu gen reporter tương đối thấp trường hợp Mặt khác, hợp độc lập vector xảy phôi dẫn đến động vật chuyển gen thể khảm Rõ ràng, phương pháp thay vi tiêm số trường hợp ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA VIỆC CHUYỂN GEN SỬ DỤNG RETROVIRUS: 10 * Ưu điểm: - Gắng chèn gen mục tiêu vào NST tế bào quan tâm >biểu gen mục tiêu ổn định - Ít nhạy cảm với hệ miễn dịch - Sử dụng dòng tế bào phân chia mạnh * Khuyết điểm: - Gắng chèn gen mục tiêu cách ngẫu nhiên - Khơng có khả chuyển nhiễm lên dịng tế bào khơng phân chia - Sự biểu bắt đầu giảm sau thời gian biểu ổn định 11 ... PP2: Tiêm gen vào tế bào thực giai đoạn phôi 16 tế bào vùng lân cận tế bào mầm nguyên thủy => động vật chuyển gen => truyền gen cho hệ sau  Hiệu cao - Vector retrovirus sử dụng để chuyển gen vào... trúc genome Retrovirus Genome retrovirus bao gồm hai phân tử RNA sợi đơn, mạch thẳng, có cap đầu 5’ đuôi poly A đầu 3’ (tương đương với mRNA) Genome retrovirus có kích thước khoảng 8-11kb RNA retrovirus. .. VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA VIỆC CHUYỂN GEN SỬ DỤNG RETROVIRUS: 10 * Ưu điểm: - Gắng chèn gen mục tiêu vào NST tế bào quan tâm >biểu gen mục tiêu ổn định - Ít nhạy cảm với hệ miễn dịch - Sử dụng dòng tế