Liệu pháp gen và ứng dụng liệu pháp gen trong chữa bệnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TPHCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIỂU LUẬN SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ DI TRUYỀN HỌC ĐỀ TÀI : LIỆU PHÁP GEN VÀ ỨNG DỤNG LIỆU PHÁP GEN TRONG CHỮA BỆNH GVHD : PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Lớp : HC09SH Nhóm Lê Hồng Khoa 60901228 Cao Thị Mỹ Phương 60902029 Lê Kim Tài 60902310 Nguyễn Thị Thanh Tân 60902381 Nguyễn Đức Trung 60902979 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU NỘI DUNG A LIỆU PHÁP GEN I Khái niệm Liệu pháp gen Gen liệu pháp II Nguyên tắc điều trị liệu pháp gen III Phân loại liệu pháp gen IV Kỹ thuật Cơ sở liệu pháp gen Các bước liệu pháp gen Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp V Nguyên lý liệu pháp gen Tách dòng gen liệu pháp Các loại vecto thường sử dụng liệu pháp gen B Ứng dụng liệu pháp gen chữa bệnh I Các lĩnh vực ứng dụng chủ yếu liệu pháp gen II Một số xu hướng chữa bệnh liệu pháp gen III Ứng dụng liệu pháp gen việc chữa bệnh HIV/AIDS IV Vấn đề an toàn triển vọng liệu pháp gen C Kết luận Tài liệu tham khảo LỜI MỞ ĐẦU Nhiệm vụ hàng đầu CNSH giải vấn đề mạng sống mà người phải trải qua sinh, lão, bệnh, tử CNSH tập trung nỗ lực tìm hướng để chữa khỏi bệnh di truyền bệnh hiểm nghèo Trong liệu pháp gen kĩ thuật cao CNSH có ý nghĩa quan trọng giải nhiệm vụ NỘI DUNG A LIỆU PHÁP GEN I Khái niệm Liệu pháp gen Liệu pháp gen (gene therapy) kỹ thuật đưa gen lành vào thể thay cho gen bệnh hay đưa gen cần thiết thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt mục tiêu liệu pháp - Biện pháp thứ nhất, đưa gen lành vào thay cho gen bệnh cách giải triệt để, gen lành đưa vào vị trí gen chịu tác động bình thường trình tự biểu gen đưa vào tế bào gene khỏe mạnh - Biện pháp thứ hai, đưa gen cần thiết thay vào vị trí gen sai hỏng dễ thực đưa thêm gen cần thiết vào gen, người ta không làm chủ vị trí gắn xen đoạn đưa vào Điều dẫn đến số kết không lường trước được:  Gen đưa vào không nằm phức hợp điều hồ nên biểu hịên cách tuỳ tiện, không nơi (đúng với loại tế bào, mô đặc hiệu) không lúc (đúng với chu trình phát triển cá thể), chí khơng biểu  Gen đưa vào gây hiệu không mong muốn  Gen gắn vào vị trí có khả hoạt hố gen tiền ung thư dẫn dến biểu độ gen gây ung thư Gen liệu pháp Gen liệu pháp (Therapeutic gene) gen có chức sử dụng vào điều trị bệnh cho người  Mỗi loại gen liệu pháp có đặc điểm chức khác Gen liệu pháp là:  Gen lành (các gen hoạt động bình thường) đưa vào tế bào sống để thay gen hỏng, gen chức  Những gen có khả mã hóa protein đặc hiệu, đưa vào tế bào sống tạo nên loại protein đặc hiệu Các protein đặc hiệu ức chế hoạt động gen khác tế bào, kìm hãm khả phân chia tế bào gây chết tế bào bị bệnh  Gen ức chế gen gây bệnh, gen kìm hãm gen phục hồi Các đoạn oligonucleotide có tác dụng kiềm hãm hoạt động gen bị đột biến tế bào  II Nguyên tắc điều trị liệu pháp gen Theo dõi hiểu biết cặn kẽ trình, chế phát sinh bệnh, đặc tính di truyền bệnh  Nắm vững cấu trúc chức gen gây bệnh, gen hỏng, gen đột biến, … cấu trúc, chức gen liệu pháp  Dự đoán hiệu liệu pháp Nếu hiệu cao áp dụng  Thử nghiệm nhiều lần với động vật, đạt hiệu cao áp dụng cho người  III Phân loại liệu pháp gen nhóm phương pháp bản:  Liệu pháp gen soma (Somatic Gen Therapy - SGT): phương pháp điều trị, thay hay sửa chữa gen hỏng, gen bệnh tế bào soma thể SGT liên quan đến biểu gen bên tế bào uốn nắn bệnh nhân không di truyền cho hệ sau Tế bào dùng chữa trị tế bào lympho, tế bào gan, đặc biệt dùng tế bào gốc Đây loại hình GT nghiên cứu "Viện Liệu pháp Gen người" nhiều phịng thí nghiệm khác giới  Liệu pháp gen tế bào mầm (Germline Gen Therapy - GGT): điều trị, sửa chữa, thay gen hỏng cho giao tử nhằm tạo hệ sau bình thường GGT liên quan đến cải biến gen tế bào mầm mà tế bào truyền đạt thay đổi cho hệ sau Hãy cịn cơng trình nghiên cứu can thiệp vào dịng mầm lý kỹ thuật đạo đức IV Các kỹ thuật liệu pháp gen Cơ sở liệu pháp gen - Liệu pháp gen tiến hành thơng qua số cách sau:  Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh Strategies for Delivering Therapeutic Transgenes into Patients  Tạo véctơ virus để chuyển gen cách hiệu tới tế bào (in vivo) HIV based gene therapy vector Virus xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào cách gắn với chúng “bơm” thông tin di truyền chúng vào tế bào Vì virus tự nhiên tự sinh sản bên tế bào chủ nên gây hại với vật chủ mang chúng Tuy nhiên, xố hay làm phần có hại virus, ngăn khơng cho chúng tái tế bào chủ Ngày virus khơng có khả tái sử dụng chung cho nghiên cứu liệu pháp gen người động vật  Sử dụng kỹ thuật khác để chuyển gen vào tế bào bên ngồi người bệnh, sau chuyển tế bào biến đổi vào người bệnh (ex vivo) Phương pháp sử dụng chung để phân phối nhân tố phát triển phân tử khác tới vùng đặc hiệu thể Chúng sử dụng để tạo dòng tế bào bị biến đổi hoàn toàn cho cấy ghép Giống liệu pháp gen in vivo, tế bào chuyển gây biểu protein lạ gây sưng tấy hay đáp ứng miễn dịch - Các nhóm chuyên gia chia liệu pháp gen thành mức khác nhau:  Chuyển gen với hoà nhập (gen kết hợp chặt chẽ với DNA vật chủ)  Chuyển gen khơng hồ nhập (gen khơng kết hợp chặt chẽ với DNA vật chủ)  Sử dụng oligonucleotide tổng hợp nhân tạo gọi phân tử ribozyme/antisense khơng có thành phần điều hồ (sự biểu gen bị biến đổi) - Để chuyển gen, cần hội đủ số điều kiện sau đây:  Đầu tiên, phải có đầy đủ gen thích hợp với trình tự điều hồ thích hợp (trình tự khởi động), trình tự khởi động gen đặc hiệu, cách cho phép gen biều mô mà thông thường chúng biểu  Lần lượt, gen kết nối với trình tự khởi động, hoạt hố tất mô (phương pháp chung sử dụng ngày nay) kết nối với trình tự hoạt hố hay bất hoạt cơng tắc Những thao tác đạt công nghệ DNA tái tổ hợp  Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích DNA cần kỹ thuật để tiếp cận với tế bào Ba kỹ thuật sử dụng để làm điều này:  DNA gắn trực tiếp với tế bào cấy vào mô Gọi chuyển DNA trần (nacked DNA transfer)  DNA sử dụng dể tạo nên thoi dịch chuyển virus (viral transfer shuttle) Đây phương pháp chuyển DNA chắn DNA xâm nhập không hiệu vào tế bào khó xun qua lớp màng lipit kép, vector virus dễ dàng làm việc  DNA phối hợp với phức hệ hoá học khác để khuếch đại khả chuyển dịch qua màng tế bào  Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng liệu pháp gen: liệu pháp gen ứng dụng trực tiếp với bệnh nhân tế bào tách khỏi người bệnh (như tế bào tuỷ xương) sau cấy trở lại người bệnh Trong tương lai, thao tác liệu pháp gen tế bào gốc phát triển môi trường mô tế bào sau cấy lên người bệnh tiến triển - Mỗi kỹ thuật có thuận lợi khó khăn riêng Khi chọn phương pháp phân phối gen, số nhân tố cần cân nhắc:  Hiệu liệu pháp phải đặt lên hàng đầu  Sau đó, gen chuyển đổi phải điều hồ đắn Nó phải hoạt hố lúc, với độ dài thời gian xác số lượng Các bước liệu pháp gen Trong thực nghiệm, người ta dùng vector virus để chuyển gen vào tế bào động vật theo bước:  Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp mang gen cần chuyển Trước đó, virus biến đổi để khơng cịn khả chép, đồng thời lại có khả biểu mạnh gen cần đưa vào thể Các biến đổi bao gồm việc loại bỏ trình tự cần cho chép virus gắn vào trước gen trình tự promotor mạnh Sau đó, vector tái tổ hợp đưa vào tế bào nuôi cấy Loại tế bào sử dụng nhiều tế bào tuỷ xương dễ ni cấy lại bao gồm nhiều tế bào nguồn đa (pluri potential) Hình 17 Các kỹ thuật sử dụng để nghiên cứu tạo thành tính ổn định phức hệ polycation-DNA 2.2.3 Cấy trực tiếp Sự cấy DNA trần hay DNA tự ví dụ khác chuyển gen khơng có chất virus Trong kỹ thuật này, DNA trần cấy trực tiếp tới khối u mô Phương pháp điều trị làm giảm trực tiếp sản xuất protein quan trọng cho liệu pháp trị bệnh (ví dụ protein khối u) gây đáp ứng miễn dịch giúp ngăn ngừa bệnh Kỹ thuật ứng dụng cho xương điều trị bệnh thoái hoá (như bệnh loạn dưỡng cơ), ngăn cản bệnh gan virus (như bệnh viêm gan), bệnh tim (như bệnh lỗi sung huyết tim) Ngoài ra, nghiên cứu động vật thành công điều trị ung thư u ác tính u bướu Trong giá thấp tính dễ thiết kế làm thu hút hơn, có số nhược điểm Đầu tiên, quản lý hệ thống vật chất di truyền vấn đề nguyên nhân gây phân huỷ enzym nội bào nhanh chóng bị dẹp bỏ (clearance) gan thận Hiệu biểu di truyền khó nhận thấy Hơn nữa, số trường hợp khơng trì biểu gen, DNA lạ (foreign DNA) gây đáp ứng miễn dịch mạnh 2.2.4 Liệu pháp tế bào gốc - Chuyển tế bào gốc kỹ thuật tạo tranh cãi lớn khoa học, trị tơn giáo Vì vậy, việc nghiên cứu chúng hạn chế diễn quy mơ phịng thí nghiệm - Các tế bào gốc tế bào thể người Chúng tế bào hoàn toàn giống phát triển thành tế bào người - Các tế bào tách khỏi thể, tinh chế phịng thí nghiệm, làm thành dạng tế bào đặc hiệu khác sau tế bào đưa trở lại vật chủ 2.2.5 Biến đổi biểu gen Sự biểu gen người bị biến đổi trực tiếp cách sử dụng công cụ phân tử có khả xuyên qua tế bào, gắn tới gen đích chúng điều hồ gen sản xuất protein Có số cơng cụ dẫn đây: 2.2.5.1 Liệu pháp antisense Antisense phương pháp để ngăn cản hoạt động gen Có chế antisense oligonucleotide mã trình tự kháng nguyên miện mRNA đưa vào tế bào gen kháng nguyên Gen nhân đưa vào tế bào Cơ chế liệu pháp antisense Trong kỹ thuật antisense người ta cắt sử dụng đoạn nucleotide nhỏ đối nghĩa với DNA tổng hợp nên protein làm bất hoạt gen để giảm việc sản xuất loại protein đó-nhằm gia tăng sinh tồn, ổn định nhiệt hoạt tính RNA nhân tạo người ta thường dùng phương pháp sau : Biến đổi đầu 3’ 5’ làm tăng sinh tồn RNA nhân tạo : thông thường enzyme cắt DNA/RNA từ đầu 3’ đến đầu 5’, có enzyme cắt từ đầu 5’ đến đầu 3’ Dể bảo vệ RNA nhân tạo tránh khỏi phản ứng enzyme người ta thường thay gốc nối phosphap P=O đầu thành phosphorothioate P=S hay phosphapamindate P-N, hay băng amin-linker ngắn, hay hóa chất thơng thường cholesterol, cyclodextrin Các hóa chất làm giảm hiệu khả phân giải enzyme làm tăng tính sinh tồn RNA nhân tạo q trình sinh học dùng hóa chất có tính hydrophobic cao cholesterol, pyrene đa amin giúp việc chuyển DNA/RNA chuyển qua màng tế bào hữu hiệu Dùng RNA nhân tạo với biến đổi gốc 2’-Oxy để làm gia tính tính ổn định nhiệt RNA nhân tạo :2’-omethyl, 2’-amino, 2’-O-ankyl, LNA Dể tìm loại oligonucleotide DNA/RNA nhân tạo có nhiều gốc biến đổi hóa học mà hịa tan dung dịch nước, bền vững phản ứng phân giải enzyme, có tính kết hợp base-pairring chặt chẽ với oligonucleotide DNA/RNA thiên nhiên Mới LNA(lock nucleic acid), với cấu trúc hóa học biến đổi mang đủ điều kiện RNA nucleic acid LNA oligonucleotide có đặc điểm xương sống phosphat,LNA khơng dễ dàng bị phân giải hồn tồn hay biến đổi từ 3’Oxy sang 2’Oxy môi trường dung dịch có pH