TỔNG QUAN VỀ GLUTAMICUM

TỔNG QUAN VỀ GLUTAMICUM TỔNG QUAN VỀ GLUTAMICUM TỔNG QUAN VỀ GLUTAMICUM TỔNG QUAN VỀ GLUTAMICUM TỔNG QUAN VỀ GLUTAMICUM TỔNG QUAN VỀ GLUTAMICUM TỔNG QUAN VỀ GLUTAMICUM TỔNG QUAN VỀ GLUTAMICUM TỔNG QUAN VỀ GLUTAMICUM TỔNG QUAN VỀ GLUTAMICUM

Chương TỎNG QUAN TÀI LIỆU - - 1.1 CORYNEBACTERINEAE: Corynebacterineae nhóm vi khuẩn gram dương bao gồm Corynebacteria, Mycobacteria Nocardia Đặc tính bật nhóm có chứa mycolic acid bao bọc tồn bề mặt tế bào, chúng cịn gọi nhóm mycolata Nhóm vi khuấn phân bố rộng rãi tự nhiên có ý nghĩa quan trọng nhiều mặt sống [33], Hai đại diện quan trọng nghiên cứu nhiều nhóm Corynebacterium glutamicum Mvcobacterium tuberculosis c glutamicum phân lập lần từ mẫu đất sở thú Ưeno hai nhà khoa học người Nhật Bản Ukada Kinoshita nhằm mục đích tăng cường vị chất lượng thực phẩm Các nghiên cứu sau cho thấy c glutamỉcum phân lập từ đất bị nhiễm phân chim c glutamicum tăng trưởng nhanh, thường có hình que, kích thước khoảng từ 0,7-1 X 1-3 |im (Hình 1.1) Hình dạng vi khuẩn phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy Neu mọc mơi trường lỏng, tế bào có hình elip hình que ngắn đạt đến pha ổn định Những tế bào giai đoạn tăng trưởng có khuynh hướng hình thành kiểu xếp chữ V, nguyên nhân kết dính phần hai vách tế bào [16].Với khả tiết L-glutamate biết năm mươi năm qua, kết hợp với hoạt tính protease thấp an tồn cho việc sản xuất chất phụ gia thực phẩm, c glutamicum trở thành chủng vi khuẩn sử dụng rộng rãi Hình 1.1: Kết quan sát kính hiển vi điện tử c glutamicum fhttp://www.fz-juelich.de/ibƯcoryne.html) trong công nghiệp với sản lượng năm tỉ L-glutamate 450.000 L-lysín [16], [17], Đối với c glutamicum, màng bao tế bào xem trở ngại việc vận chuyến ion, đại phân tử chất tan nhỏ Nhiều kênh vận chuyển amino acid diện bề mặt tế bào phục vụ cho việc xuất bào amino acid (lysine, threonine) liên quan đến chế điều hòa tổng lượng amino acid nội bào Trong trường hợp glutamate, cần phải vượt qua lớp peptidoglycan- arabinogalactan hàng rào kị nước vách tế bào, để khởi phát tiết glutamate người ta phải tiến hành xử lí đặc biệt màng tế bào c glutamicum, phổ biến thêm vào môi trường nuôi cấy chất tẩy penicillin, điều cho thấy màng bao c glutamicum cản trở tiết L- glutamate cấu trúc màng bao không quan trọng cho chế tiết amino acid mà định đặc tính sinh lí tế bào tính kị nước, kết dính khả tạo bọt tế bào Chính ngun nhân trên, cấu trúc màng bao c glutamicum trở thành mục tiêu quan trọng việc cải thiện hiệu suất thu nhận sản phẩm công nghệ sinh học [16] Ngược lại với c glutamicum, M tuberculosis tác nhân gây bệnh nguy hiểm lan tràn nước phát triển có khuynh hướng quay trở lại quốc gia cơng nghiệp hóa Năm 1882, nhà vi sinh người Đức, Robert Koch lần phân lập M tuberculosis miêu tả tác nhân gây bệnh lao M tuberculosỉs đặc trưng dạng hình que tăng trưởng chậm, khuẩn lạc quan sát sau nhiều ngày đến nhiều tuần ni cấy Các lipid, acid béo lịng đỏ trứng thường thêm vào môi truờng nuôi cấy để giúp vi khuẩn tăng trưởng tốt [15] 4 - - Hình 1.2: Kết quan sát kính hiển vỉ điện tử M tuberculosis (www.sudantnbüne.com/IMG ,'arton 1330j]jg) Khi xâm nhiễm vào người, M tuberculosis cư ỨTÍ phát triển phối Vi khuẩn sống sót nhân lên đại thực bào Nhiễm trùng cấp tính M tuberculosis dẫn đến phá hủy mạnh mẽ mô phối, lan truyền VI khuẩn sang phận khác thể dẫn đến tử vong Độc tính M tuberculosis ni cấy tương ứng với hình thành cấu trúc chuỗi dài dạng dây thừng môi trường lỏng hay thạch, nguyên nhân lớp lipid bề mặt đặc trưng, glycolipid, tạo nên kết dính vi khuẩn [15], Theo tính tốn gần WHO, có khoảng tám triệu người nhiễm lao năm gần hai triệu người chết [15], [52], Cùng với gia tăng tỉ lệ mắc lao xuất chủng M tuberculosis kháng thuốc, điều đe dọa lớn đến khả kiểm sốt dịch bệnh Ví dụ, số ca mắc lao kháng thuốc điều trị Estonia 14 %, tỉ lệ Trung Quốc Án Độ 40 % [35], Một yếu tố quan trọng góp phần vào khả kháng thuốc di truyền củaM tuberculosis cấu trúc bất thường màng tế bào Một điều đáng quan tâm c glutamicum, M tuberculosis VI khuẩn khác thuộc nhóm Corynebacterineae có chung đặc tính cấu trúc thành phần màng bao khác biệt so với vi khuan gram dương Không giống VI khuẩn gram dương, vách tế bào Corynebacterineae chứa lớp kị nước đặc trưng [34], lớp màng giữ vai trò quan trọng việc địrih tính thấm chất thuốc điều trị Ngược lại với VI khuẩn gram âm có thành phần màng ngồi phospholipid lipopolysacchande Corynebacterineae lại mycolic acid ester hóa Chính đặc diểm khác biệt mà nhiều nghiên cứu tiến hành nhằm làm sáng tỏ cấu trúc, thàrih phần chức màng bao Corynebacterineae 1.2 CẤU TRÚC MÀNG BAO CỦA c glutamicum : Các nghiên cứu cấu trúc thành phần hóa học cho thấy màng bao c glutamicum vi khuẩn Corynebacterineae bao gồm Nocardia, Rhodococci Mycobacteria tương đồng VỚI [4], Quan sát kính hiển VI điện tử, màng bao c gỉutamicum cho thấy bốn lớp nêng biệt (Hình 1.3), bao gồm: - Màng sinh chất (PM) có bề dày 6-7 nm - Lớp ED (thick electron-dense layer) có bề dày 15-20 nm - Lớp ET ( electron-transparent layer) có bề dày 7-8 nm - Lớp ngồi (OL: outer layer) có bề dày 30-35 nm ■ LiL ■ ỉ l>l PM ii ị i : au % lí ỉ ; II ỉ r l i n 'j nn L II ìi - '■ * ■ ! ' ' V 1-1 Hình 1.3: Mơ hình câu trúc màng bao c glutamỉcum [39],Màng sinh chất chủ yếu hợp thành phospholipid phân cực với phần thân mạch acid béo palmitic (Ci6 :o) octadecenoic (C :i), phần đầu nhóm phosphatidylglycerol.diphosphatidylglycerol, 18 phosphatidylinoitol phosphatidylinositol dimannoside [39], Lớp ED bao gồm peptidoglycan (PG) heteropolysaccharide arabinogalactan (AG) PG hình thành N-acetylglucosamine N-actyl muramic acid liên kết với tri- hay tetrapeptide chẳng hạn L-Ala-D-Glu-meso- diaminopimelic hay L-Ala-D-Glu-mesodiaminopimelic acid-D-Ala AG hợp thành khung sườn Ị3-D-galactofuranosyl liên kết với a-D-arabinofuranosyl Mạch khung galactofuranosyl liên kết với PG thông qua liên kết phosphodiester Vùng tận arabinofuranosyl ester hóa vị trí thứ năm mycolic acid [39], Lớp ET tương ứng với phần kị nước hình thành mycolate lipid kết hợp màng Mycolic acid ester hóa với AG với dẫn xuất mycolic acid hình thành lớp màng đôi đối xứng ngăn cản vào chất ưa nước [9] ETL không chứa mycolic acid liên kết cộng hóa trị mà cịn chứa mycolic acid tự Điều hồ trợ chứng: M tuberculosis chứa lượng mycolic acid liên kết cộng hóa trị gấp mười lần so với c glutamicum vừa đủ để bao phủ tịan bề mặt tế bào, điều cho thấy ngồi mycolic acid cộng hóa trị, c glutamicum cần lượng lớn mycolic acid tự do, bao gồm trehalose dimycolate (TDM) trehalose monomycolate (TMM) diện ETL [16] Lớp cẩu tạo lipid tự hình thành lớp đơn Các lipid tự chủ yếu bao gồm TDM, TMM protein [34], Ngồi ra, lớp tinh thể bề mặt cịn phát nhiều chủng c glutamỉcum [3] Lớp tinh thể hình thành protein PS2 tiết môi trường nuôi cay, protein kháng protease chất tẩy Bởi lóp tinh thể liên kết chặt với vách tê bào nên hoạt động hàng rào bảo vệ tế bào khỏi hợp chất gây độc - Hình 1.4: cẩu trúc màng bào - c glutamicum CGL2005 kính hiển vi điện tử [13] Chính cấu trúc màng bao đặc trưng mà c gỉutamicum vi khuan thuộc họ Corynebacterineae có tính thấm thấp Điều thấy rõ Mycobacterium chelonae, màng bao vi khuẩn có tính thấm thấp mười lần so với Pseudomonas aeruginosa thấp nghìn lân so với E coll Nhiều chủng Mycobacterium nhạy số kháng sinh Các nghiên cứu lý sinh vách tế bào Mycobacteria Corynebacteria cho thấy thành phần mycolate định tính thấm tính dịng lỏng màng bao [30] Ngồi ra, mycolate cịn liên quan đến nhiều chức sinh học quan trọng khác chức sinh lý độc tính M tuberculosis Bởi nguyên nhân trên, đường sinh tổng hợp mycolate giữ vai trò thiết yếu vi khuẩn Corynebacterineae 1.3 SINH TỎNG HỢP MYCOLIC ACID VÀ MYCOLATE: Mycolic acid acid béo a-alkyl-Ị3-hydroxy, đặc trưng cho vi khuẩn Corynebacterineae Mycolic acid có cơng thức chung Rl-CH(OH)-CH(R2)- COOH, với Rl R2 mạch alkyl (Hình 1.5) cấu trúc mycolic acid đơn giản ừong c glutamỉcum lại phức tạp M tuberculosis Độ dài mạch carbon mycolic acid phụ thuộc nhóm vi khuẩn, dài Mycobacteria Corynebacteria (C22-C36) (CÔO-CỌO), Nocardia (C4 -C5 ), ngắn Mặc dù có biến động độ dài cấu trúc mycolic acid vi khuấn Corynebacterineae, tất có chung motif mycolic Đặc điểm cho phép dự đoán đường sinh tổng hợp mycolate chung cho tất vi khuẩn thuộc nhóm [1 ] R2 Hình 1.5: cẩu trúc hóa học my colic acỉd M tuberculosis glutamicum [12], c Mycolic acid kết phản ứng cô đặc Claisen (Claisen condensation) hai phân tử palmitic acid Gần đây, enzyme polyketide synthase Pksl3 nhận biết enzyme xúc tác cho phản ứng [12] Các bước đường sinh tổng hợp mycolate vấn đề gây tranh luận Phân tử trehalose tổng họfp bào tương vận chuyển đến màng, đây, phosphoryl hóa vị trí số sáu để hình thành trehalose-6 -phosphate (T-6 -P) T-6 -P kết hợp với mycolic acid vừa tổng hợp để hình thành trehalose- - mycolate-6 ’phosphate, sản phẩm nhanh chóng bị khử phospho tạo nên trehalose monomycolate (TMM) Ở bước cuối cùng, enzyme mycoloyltransferase xúc tác việc chuyển nhóm mycoloyl từ TMM đến vị trị số sáu phân tử trehalose TMM khác để hình thành trehalose dimycolate (TDM) mycoloyl chuyển đến lớp arabinogalactan để hình thành arabinogalactan mycolate [1 ] (Hình 1.6) Palmitic acid PỈCSỈ3 Mycolic acid ^'''Trehalose-ố-phũsphate T rehaIose-6-mycolate-6 ’-phosphate Trehalose moromycolate Arabinogalactan Trehalose dimyicolate Arabinogalactan rnycolate Hình 1.6: Các bước sinh tổng hợp mycolate c glutamicum [12] Những nghiên cứu gần cho thấy: bất hoạt gene fbpC mã hóa cho fibronectin-binding protein c (có hoạt tính mycoloyltransferase ) M tuberculosis làm giảm 40 % lượng mycolate liên kết màng, điều dẫn đến thay - 10 - - 11 - đơi đáng kê tính thâm màng bao [21] Kết tương tự quan sát chủng c glutamicum bị đột biến cmytA (tên trước cspl), gene mã hóa cho mycoloyltransferase [23] Đối với Mycobacteria, TDM cịn đóng vai trị quan trọng đáp ứng miễn dịch vật chủ Ở mức độ đó, nói sổng sót vi khuẩn Mycobacteria liên quan đến khả TDM ức chế trình dung họp túi phospholipid bên đại thực bào vật chủ, điều giúp vi khuẩn lẩn tránh yếu tố miễn dịch tồn bền vững bên mô vật chủ Các chứng cho thấy gene mã hóa cho enzyme mycoloyltransferase đóng vai trị quan trọng hoạt động sinh lý Corynebacterineae 1.4 CÁC GENE MYCOLOYLTRANSFERASE (