GIÁO TRÌNH MÔN HỌC HUYẾT HỌC TRUYỀN MÁU NGÀNH XÉT NGHIỆM TRÌNH ĐỘ CAO ĐẲNG

UBND TỈNH KHÁNH HÒA TRƯỜNG CAO ĐẲNG Y TẾ GIÁO TRÌNH MƠN HỌC: HUYẾT HỌC TRUYỀN MÁU NGÀNH: XÉT NGHIỆM TRÌNH ĐỘ: CAO ĐẲNG Ban hành kèm theo Quyết định số: /QĐ-CĐYT ngày…….tháng….năm 2018 Hiệu Trưởng trường Cao đẳng Y tế Khánh Hòa Khánh Hòa, năm 2018 Tham gia biên soạn: ThS Đậu Thị Thạch - Giảng viên trường CĐ Y tế Khánh Hòa MỤC LỤC BÀI 1: HỆ NHÓM MÁU ABO, RHESSUS MỘT SỐ HỆ NHÓM MÁU KHÁC BÀI 2: NGƯỜI CHO MÁU TÌNH NGUYỆN: TIÊU CHUẨN TUYỂN CHỌN,QUYỀN LỢI VÀ TRÁCH NHIỆM 14 BÀI 3: SÀNG LỌC CÁC BỆNH NHIỄM TRÙNG 19 BÀI 4: CÁC CHẾ PHẨM MÁU:ĐẶC ĐIỂM, ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN VÀ CHỈ ĐỊNH SỬ DỤNG 30 BÀI 5: AN TOÀN TRUYỀN MÁU VÀ CÁC BIỆN PHÁP ĐỂ BẢO ĐẢM AN TOÀN TRUYỀN MÁU 37 BÀI 6: TAI BIẾN DO TRUYỀN MÁU 41 BÀI 7: KỸ THUẬT SẢN XUẤT HỒNG CẦU MẪU .47 BÀI 8: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM ĐỊNH NHÓM MÁU ABO 49 BÀI 9: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM ĐỊNH NHÓM MÁU RHESUS 53 BÀI 10: KỸ THUẬT LÀM PHẢN ỨNG CHÉO 54 BÀI 11: NGHIỆM PHÁP COOMBS .57 Tài liệu tham khảo: 59 GIÁO TRÌNH MƠN HỌC Tên môn học: HUYẾT HỌC TRUYỀN MÁU Mã môn học: 6160205 Vị trí, tính chất mơn học: - Vị trí: môn học chuyên nghành đào tạo cho sinh viên năm thứ 3, nghành xét nghiệm - Tính chất: Mơn học môn học thuộc Khoa Kỹ Thuật Y học – Bộ Môn Xét Nghiệm, thuộc danh mục môn học bắt buộc Gồm có phần: + Phần lý thuyết: Nội dung phần lý thuyết giới thiệu kháng nguyên kháng thể hệ nhóm máu hồng cầu, tiêu chuẩn người hiến máu, biện pháp an toàn truyền máu Giới thiệu chế phẩm máu phản ứng bất lợi xẩy truyền máu + Phần thực hành: Nội dung phần thực hành hướng dẫn sinh viên thao tác số kỹ thuật xét nghiệm truyền máu Hình thành rèn luyện tác phong nghiêm túc, thận trọng, xác, khoa học thực hành phịng thực tập Mục tiêu mơn học: - Kiến thức + Trình bày hệ nhóm máu hồng cầu, biện pháp an tồn truyền máu + Trình bày chế phẩm máu, tai biến truyền máu - Kỹ + Thực kỹ thuật xét nghiệm truyền máu - Thái độ + Hình thành rèn luyện tác phong nghiêm túc, tỷ mỉ, xác khoa học làm xét nghiệm cho bệnh nhân BÀI 1: HỆ NHÓM MÁU ABO, RHESSUS MỘT SỐ HỆ NHĨM MÁU KHÁC MỤC TIÊU HỌC TẬP: Trình bày đặc điểm kháng nguyên kháng thể nhóm máu hệ ABO Trình bày đặc điểm hệ nhóm máu Rhesus số nhóm máu khác I HỆ NHĨM MÁU ABO Đại cương - Năm 1900, Karl Landsteiner (Áo, giải Nobel Y học 1930) phát hiện nhóm máu A (có kháng nguyên A hồng cầu), nhóm máu B (có kháng nguyên B hồng cầu), và nhóm máu O (không có kháng nguyên A và B hồng cầu) - Năm 1902, Decastello và Sturli phát hiện nhóm máu AB (có KN A và KN B hồng cầu bị ngưng kết KT chống A chống B) - Các KN nhóm máu hệ ABO được quy định bởi các allele A, B, O, đó allele A và B là trội so với allele O, allele A và B là đồng trội Kháng nguyên hệ ABO 2.1 Cấu trúc và sự tổng hợp kháng nguyên A, B, H - Các gen ABO không trực tiếp tạo kháng nguyên mà tạo men glycosyltransferase để tổng hợp nên kháng nguyên Sơ đồ: Các giai đoạn tổng hợp KN nhóm máu hệ ABO AA/AO   N-acetylgalactosaminyltransferase HH/Hh BB/BO Tiền chất KN H D-galactosaminyltransferase L-fucosyltransferase OO KN A KN B KN H AB KN A, B N-acetylgalactosaminyltransferase D-galactosaminyltransferase   - Kháng nguyên hệ ABO (gồm KN ABH; H KN hệ KN ABO), bắt đầu hình thành từ ngày thứ 37 thai kỳ phát triển hoàn toàn tuổi Hồng cầu trẻ sơ sinh có khoảng 25-50% số vị điểm KN so với người lớn Sự bộc lộ kháng nguyên hệ ABO phụ thuộc vào chủng tộc, tình trạng bệnh lý tương tác với gen NM khác Lewis, Ii, P… - Ngồi HC, KN ABH cịn tìm thấy TB biểu mô, tuỷ xương, thận, tinh trùng, TB nước ối, Lymphocyte, Tiểu cầu…Khơng có KN ABH BC hạt, TB thần kinh, TB gan, TB Malpighi… - Về mặt di truyền: Hệ nhóm máu ABH quy định hệ thống gen di truyền độc lập ABO Hh + Người nhóm máu O: có gen H mà khơng có gen A gen B, bề mặt HC có kháng nguyên H + Người nhóm máu A: có gen H gen A, bề mặt HC có kháng nguyên H kháng nguyên A + Người nhóm máu B: có gen H gen B, bề mặt HC có kháng nguyên H kháng nguyên B + người gen H (đồng hợp tử hh) bề mặt HC khơng có kháng ngun H Nhóm máu gọi NM O Bombay (Oh) - Oh gặp Tần suất 1/8.000 người Taiwan, 1/10.000 người Ấn độ, 1/1triệu người châu âu 2.2 Di truyền của nhóm máu hệ ABO Gen ABO nằm NST số 9, có allele là A, B, O và di truyền theo định luật Mendel Allele A, B đồng trội, Allele O gen lặn 2.3 Tần suất của hệ nhóm máu ABO Tần suất nhóm máu ABO khác giữa các cộng đồng dân cư và các chủng tộc thế giới 2.4 Các phân nhóm ABO 2.4.1 Nhóm máu A - Có nhóm là A1 và A2 (chiếm 99% nhóm máu A, tương ứng với allele A1 và A2) và các nhóm A yếu (chiếm 1% lại) Gen A1 tạo enzyme glycosyltransferase hiệu quả gen A2 đó hồng cầu A1 có nhiều vị điểm KN và cũng ít KN H hồng cầu A2 Anti-A (từ người nhóm máu B) có cả loại kháng thể anti-A và anti-A1, vì thế nó phản ứng với cả hồng cầu A1 và hồng cầu A2 Anti-A1 (được tách từ anti-A của người máu B hay triết xuất từ đậu Dolichos biflorus) chỉ phản ứng với hồng cầu A1 - Phần lớn trẻ em mới sinh là nhóm máu A2 (do kháng nguyên ABO chưa phát triển đầy đủ thời gian này), nhiên sau vài tháng thì đa số hồng cầu A2 sẽ chuyển sang hồng cầu A1 - Ở người Việt Nam theo nghiên cứu Trần Văn Bé nhóm A1 chiếm 91%, A2 chiếm khoảng 9%, theo nghiên cứu Cazal (1984) tiến hành nhân viên công tác bệnh viện Bạch Mai 100% A1 - Tương tự nhóm máu AB cũng có phân nhóm là A1B và A2B Có khoảng 22-35% người mang nhóm máu A2B có anti-A1 - Các nhóm A yếu: đó là những nhóm máu có phản ứng yếu phản ứng của A2 đối với anti-A Phần lớn các nhóm A yếu là các biến thể allele đột biến từ allele A (A3, Ax ), một vài nhóm máu hiếm thì tác dụng của một gen khác với gen ABO ức chế sự hình thành KN A (Ay) 2.4.2 Nhóm máu B - Gen B tạo enzyme galactosetransferase có tác dụng gắn galactose vào chất H Người ta đã tìm thấy có enzyme B khác nhau, hoạt động tối ưu ở pH 6,5 và cần sự có mặt của đồng yếu tố Mn++ Cả enzyme này đều chuyển galactose từ UDP-Gal vào chất H Tuỳ dạng chất H mà hình thành KN B là B1, B2, B3, B4 - Các nhóm B yếu: các KN phản ứng với anti-B yếu bình thường được gọi là nhóm B yếu gồm có B3, Bx, Bm, Bel Nhóm B yếu rất hiếm gặp  2.4.2 Nhóm máu Bombay - Do Bhende phát hiện năm 1952 ở thành phố Bombay, có kiểu gen là hh đó khơng tạo thành chất H (có khoảng 130 trường hợp báo cáo) - Một số tính chất NM Bombay (Oh) + Không có KN A, B, H hồng cầu, không ngưng kết với anti-A, anti-B, anti-A,B hoặc anti-H + Trong huyết có anti-A, anti-B và anti-H (anti-H hoạt động 37oC) + Không có KN A, B, H dịch tiết + Không có men fucosyltransferase huyết và hồng cầu + Có thể có enzyme N-acetylgalactosaminyltransferase hay galactosaminyltransferase tuỳ theo thể có gen A hay B - Do những đặc tính bản mà người ta ký hiệu sau: oh: không có gen H, A, B oA: không có gen H và B Có gen A không có KN A OhB: không có gen H và A Có gen B không có KN B O hAB: không có gen H Có gen A và B không có KN A, B Tần suất nhóm máu Bombay rất thấp (ở Ấn Độ khoảng 0,0066%) Kháng thể hệ ABO 3.1.Kháng thể tự nhiên - Gồm anti-A ở người NM B, anti-B ở người NM A, anti-A và B ở người NM O, antiA1 ở người NM A2, A2B, anti-H ở người NM Bombay - Đây là những kháng thể xuất hiện không thông qua một quá trình miễn dịch rõ ràng - Các kháng thể thường xuất hiện sau sinh vài tháng, khoảng đến tháng đầu các KT này có chuẩn độ rất thấp không thể phát hiện được Đôi có thể tìm thấy KT ở trẻ sơ sinh, phần lớn các trường hợp này là KT của mẹ truyền qua thai - Sự sản suất KT cao nhất ở 5-10 tuổi, sau đó thì giảm dần theo thời gian Người 65 tuổi thường có chuẩn độ KT thấp nên cũng có thể không phát hiện được - Sự vắng mặt anti-A, anti-B ở người bình thường (trừ nhóm máu AB) là rất hiếm, tần suất anti-A (máu B) Anti-A (máu B) > anti-B (máu A) Anti-A,B (máu O) > anti-A (máu B), anti-B (máu A) đó anti-A,B thường dùng để phát hiện các kháng nguyên ABO yếu - Anti-A1 thường không hoạt động ở 370C nên chỉ gây tiêu huỷ một phần nhỏ hồng cầu A1 - Anti-H (nếu có) thì thường hiện diện với nồng độ thấp Anti-H hoạt động ở nhiệt độ thấp, có bản chất thường là IgM Do đó nó không có vai trò quan trọng truyền máu - Do những đặc điểm trên, KT tự nhiên hệ ABO là những KT ngưng kết mạnh, làm tan hồng cầu mang KN tương ứng, hậu quả là gây nên những tai biến tiêu huyết trầm trọng lòng mạch, có thể đưa đến tử vong 3.2 Kháng thể miễn dịch - Kháng thể chống A & chống B KTMD, có chất IgG, hoạt động thích hợp 370C, tạo thành qua trình đáp ứng MD, tiếp xúc với KN NM hệ ABO: bất đồng NM mẹ-con, truyền máu khơng hồ hợp, truyền huyết tương hay tủa lạnh có chứa chất A hay B …những KT lọt qua hàng rào thai, có khả kết hợp bổ thể gây tan máu nội mạch - Người nhóm máu O vừa có KT tự nhiên vừa có KT miễn dịch gọi người có nhóm máu O "nguy hiểm" Sự thay đổi kháng nguyên, kháng thể ABH cuộc sống và bệnh lý - Bình thường KN nhóm máu tồn tại suốt đời, nhiên người ta nhận thấy về già có một sự suy yếu vừa phải, đặc biệt là KN A - Trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho hoặc u lympho, có hiện tượng suy giảm tính KN (KN A không còn ngưng kết với anti-A), thời gian lui bệnh, hiện tượng này biến mất và hoạt tính KN được phục hồi - Ở một số bệnh nhân tắc ruột, ung thư đại trực tràng, hoặc những rối loạn ở đường tiêu hoá thấp có hiện tượng "B mắc phải", hồng cầu của bệnh nhân nhóm máu A1 trở nên phản ứng với anti-B - Một số bệnh nhân bị nhiễm khuẩn, enzyme của vi khuẩn làm thay đổi và bộc lộ kháng nguyên T (bình thường không xuất hiện bề mặt hồng cầu), dẫn đến hiện tượng đa ngưng kết (tất cả huyết người bình thường đều có anti-T)  - Ngoài ra, hiện tượng không phát hiện được KN còn gặp ở một số bệnh nhân ung thư tuỵ, dạ dày KN hồng cầu ở những bệnh nhân này không thay đổi, huyết có quá nhiều chất giống với KN ABH và chúng đã trung hoà kháng thể xét nghiệm định nhóm máu Để giải quyết vấn đề này cần phải rửa sạch hồng cầu bằng nước muối trước định nhóm máu - Trong một số bệnh lý cũng có hiện tượng giảm hoặc không có kháng thể bệnh bạch cầu kinh dòng lympho (do giảm  globulin máu), bệnh không có  globulin bẩm sinh Ở người già và trẻ sơ sinh hoạt tính của KT cũng không mạnh Hiện tượng nghịch lý di truyền nhóm máu: số cá thể enzym A và/hoặc enzym B lý khơng tổng hợp chất A chất B, nên định nhóm máu kết luận NM O Tuy nhiên gen A và/hoặc gen B truyền lại cho hệ sau Vì vậy, có kết bố O, mẹ O lại A B II Hệ nhóm máu Rh Lịch sử phát Hệ thống nhóm máu Rh nghiên cứu lần vào năm 1939 Levine, ông gặp phụ nữ vừa sinh con, đứa trẻ bị thiếu máu tan máu sơ sinh Huyết người phụ nữ có chứa loại kháng thể lạ làm ngưng kết hồng cầu người chồng không làm ngưng kết hồng cầu chị Cùng thời điểm 1940 Landsteiner Wiener dùng hồng cầu khỉ Macacus Rhesus tiêm cho thỏ để tạo kháng thể Kháng thể gây ngưng kết hồng cầu khỉ đồng thời gây ngưng kết 85% mẫu máu không gây ngưng kết 15% mẫu máu người da trắng thử vùng da trắng New York Lúc người ta cho hai loại kháng thể Levine Landsteiner phát có chung đặc tính nên gọi kháng thể chống Rh Người có máu ngưng kết với kháng thể chống Rh gọi Rh+, người có máu khơng ngưng kết với kháng thể chống Rh goi Rh âm Kháng nguyên hồng cầu hệ Rh 2.1.Kháng nguyên hệ Rh Hệ Rh di truyền độc lập với hệ ABO Cũng di truyền trội theo định luật Mendel Hệ Rh có gen: Cc,Dd,Ee tương ứng với kháng nguyên C,c,D,d,E,e Trên thực tế người ta chưa phát kháng thể kháng d, kháng nguyên d chưa xác định gen hệ Rh tổ hợp theo cặp, cặp nhận gen từ cha từ mẹ Các gen có mặt kết hợp như: DCE, dce, Dce, Cde….trên nhiễm sắc thể Trong gen gen D quan trọng Khi người mang gen D hồng cầu họ ngưng kết với kháng thể chống D, người mang Rh dương, ngược lại người khơng có gen D hồng cầu họ khơng ngưng kết với kháng thể chống D, người mang Rh âm Sự phát triển kháng nguyên D: Kháng nguyên hệ Rh phát triển đầy đủ từ ngày đầu thai trì suốt đời Tế bào hồng cầu dây rốn hồng cầu trẻ sơ sinh định nhóm hệ Rh phản ứng mạnh giống tế bào hồng cầu người trưởng thành - Kháng nguyên D yếu(Du): biến thể kháng nguyên D Kháng nguyên D yếu chủ yếu phát nghiệm pháp comb gián tiếp 10 3.5 - Tác nhân gây bệnh: lây nhiễm chủ yếu gặp giai đoạn cửa sổ Triệu chứng lâm sàng: hội chứng giảm miễn dịch mắc phải sau truyền máu Dự phòng: sàng lọc người cho máu nhiễm HIV Nhiễm viêm gan siêu vi Tác nhân gây bệnh: HCV, HBV, hay gặp viêm gan C sau truyền máu, gặp tới 95% - Lâm sàng: Các triệu chứng khơng rầm rộ khơng điển hình, thường có biểu nhiễm virus, thời gian ủ bệnh dài đặc biệt viêm gan C Giai đoạn toàn phát thường có biểu vàng da, tăng bilirubin - Phòng bệnh: Sàng lọc người cho máu với xét nghiệm HBsAg, Anti-HCV NHIỄM CHẤT SẮT DO TRUYỀN MÁU QUÁ NHIỀU Người truyền máu thường xuyên bệnh nhân thalassemia sau nhiều năm bị tích tụ sắt tổ chức - Triệu chứng lâm sàng: da sạm đen, gan xơ cứng, tổn thương tim, hệ nội tiết Dự phòng: - Dùng thuốc thải sắt qua đường uống tiêm Desferal 500 mg/ ngày Kelfer 75 mg/ ngày TAI BIẾN QUÁ TẢI TUẦN HOÀN, RỐI LOẠN ĐÔNG MÁU VÀ NHIỄM ĐỘC CITRAT 5.1 Quá tải tuần hoàn - Nguyên nhân: Do truyền khối lượng lớn máu với tốc độ nhanh gây tải tuần hoàn bệnh nhân bị bệnh tim, bệnh phổi, người già, trẻ sơ sinh… - Triệu chứng lâm sàng: Khó thở dội, nhịp tim nhanh, tăng huyết áp, mặt tái xanh, phù phổi cấp - Dự phòng xử trí: Khơng truyền máu q nhanh bệnh nhân có nguy tải tuần hoàn Dùng thuốc trợ tim lợi tiểu 5.2 Rối loạn đông máu - Nguyên nhân: Truyền máu khối lượng lớn (Máu toàn phần, khối hồng cầu), dẫn đến máu bệnh nhân bị hịa lỗng máu người nhận, tiểu cầu yếu tố đông máu bị giảm hệ thống tuần hoàn gây rối loạn đơng máu gây chảy máu - Xử trí: Làm xét nghiệm kiểm tra tiểu cầu yếu tố đơng máu để điều chỉnh, giảm truyền tiểu cầu, giảm yếu tố đơng máu truyền huyết tương tương tủa lạnh yếu tố VIII 5.3 Nhiễm độc citrate 44 - Nguyên nhân: Truyền máu khối lượng lớn (Máu toàn phần, khối hồng cầu), dẫn đến đưa chất chông đông vào máu người nhận, làm tăng citrate máu gây rối loạn chức tim giảm canxi máu - Xử trí: Tiêm tĩnh mạch chậm cloruacanxi, gluco-canxi 10% (2 ml) HẠ THÂN NHIỆT - Nguyên nhân: Truyền máu khối lượng lớn máu bảo quản lạnh vào thể người bệnh làm hạ thân nhiệt gây giảm canxi máu, giảm trao đổi oxy tổ chức gây rối loạn nhịp tim, đe dọa tính mạng người bệnh - Xử trí: Máu phải làm ấm trước truyền vào thể người bệnh PHÙ PHỔI CẤP DO TRUYỀN MÁU - Ngun nhân: Do có kháng thể đồng lồi đặc hiệu chống bạch cầu tiểu cầu có sẵn máu người cho người bệnh Thường gặp bệnh nhân truyền máu nhiều lần phụ nữ sinh đẻ nhiều lần Do có tương tác kháng nguyên kháng thể làm ngưng tập tế bào bạch cầu tiểu cầu vi mạch phổi, giải phóng chất hoạt mạch làm tăng tính thấm thành mạch dẫn tới thoát huyết tương tế bào máu gây phù phổi cấp - Xử trí: Ngừng truyền, điều trị corticoid, điều trị phù phổi cấp - Dự phòng: Truyền máu phần, truyền máu có lọc bạch cầu, tiểu cầu truyền hồng cầu rửa BỆNH GHÉP CHỐNG CHỦ - Nguyên nhân: Do lympho T máu người cho truyền vào người nhận bị suy giảm miễn dịch Các kháng nguyên phản ứng với kháng nguyên tương đồng tổ chức người nhận, hoạt hóa TCD8 TCD4, sản xuất cytokine gây hủy hoại tổ chức người nhận - Lâm sàng: Bệnh nhân có biểu sốt, rối loạn tiêu hóa xuất ban xuất huyết - Điều trị: Dùng thuốc ức chế miễn dịch - Dự phòng: Chiếu tia xạ túi máu để bất hoạt lympho 45 BÀI 7: KỸ THUẬT SẢN XUẤT HỒNG CẦU MẪU MỤC TIÊU HỌC TẬP: Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ để sản xuất hồng cầu mẫu Trình bày nguyên tắc sản xuất hồng cầu mẫu Thực thành thạo kỹ thuật sản xuất hồng cầu mẫu NGUYÊN TẮC: Hồng cầu mẫu hồng cầu biết kháng nguyên dùng để định nhóm máu với huyết bệnh nhân Khác với huyết mẫu, hồng cầu mẫu không sản xuất hang loạt khơng bảo quản lâu nên sản xuất với số lượng phịng xét nghiệm DỤNG CỤ - THUỐC THỬ 2.1 Dụng cụ - Các dụng cụ lấy máu tĩnh mạch 46 - ống nghiệm ly tâm có chia độ - Lam kính, pipette, que thủy tinh, bút chì sáp - Máy li tâm 2.2 Hóa chất - NaCl 0,9% - Natricitrate 3,8% - Anti -A anti- B 2.3 Người cho máu - Đạt tiêu chuẩn sức khỏe - Đã xác định nhóm máu ABO TIẾN HÀNH KỸ THUẬT - Lấy máu tĩnh mạch cho vào ống có chất chống đông - Lắc nhẹ ống máu - Lấy ba ống nghiệm ly tâm ghi A,B,O tương ứng - Cho vào ống A 1ml nhóm máu A, ống B ml máu nhóm B ống O ml nhóm máu O - Cho thêm dung dịch NaCl 0,9% vào ống nghiệm Trộn máu với nước muối - Ly tâm phút với tốc độ 1000 vòng/ phút - Hút hết phần nước trên, cho thêm nước muối NaCl 0,9% vào ống nghiệm - Dùng gịn khơng thấm đậy miệng ống nghiệm lắc nhẹ nhàng để trộn máu nước muối - Ly tâm lần tiếp tục để rửa hồng cầu ba lần - Lần ly tâm thứ để 10 phút cho hồng cầu lắng kỹ - Dùng ống hút, hút hết phần nước trên, đọc mức hồng cầu lắng ống ly tâm - Cho thêm nước muối sinh lý vào để có hồng cầu mẫu 5% - Nếu phần nước bên có màu hồng sau lần rửa thứ khơng nên dùng - Phải phân loại máu lại sau điều chế để có hồng cầu mẫu xác - Phải lưu trữ hồng cầu mẫu 2-4oc Tốt điều chế để sử dụng ngày 47 BÀI 8: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM ĐỊNH NHÓM MÁU ABO MỤC TIÊU HỌC TẬP: Trình bày ngun tắc định nhóm máu trực tiếp gián tiếp Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ thuốc thử Thực thành thạo kỹ thuật định nhóm máu ABO ĐẠI CƯƠNG Nhóm máu hệ ABO xác định nhờ có mặt kháng nguyên bề mặt hồng cầu kháng thể huyết Hai thành phần gặp gây phản ứng ngưng kết đặc hiệu DỤNG CỤ - THUỐC THỬ 2.1 Dụng cụ - Phiến đá hay đĩa thủy tinh có phân - Ống nghiệm thủy tinh 10x 75mm 48 - Máy li tâm - Đũa thủy tinh - Pipet Paster - Viết chì sáp, bút lơng 2.2 Thuốc thử 2.2.1 Huyết mẫu - HT mẫu chống A (Anti A) - HT mẫu chống B (Anti B) - HT mẫu chống AB (Anti AB) 2.2.2 Hồng cầu mẫu - Hồng cầu mẫu A 5% - Hồng cầu mẫu B 5% 2.2.3 Mẫu thử Máu có chống đông máu đông không bị tiêu huyết hay nhiễm trùng PHƯƠNG PHÁP 3.1 Định nhóm máu trực tiếp 3.1.1 Nguyên tắc: Dùng huyêt mẫu chứa kháng thể đặc hiệu biết để định loại kháng nguyên nhóm máu hồng cầu dựa vào phản ứng ngưng kết 3.1.2 Tiến hành kỹ thuật 3.1.2.1 Kỹ thuật kính Bước 1- Trên phiến đá men hay kính ghi mã số tên bệnh nhân, chia thành ô đánh dấu A, B,AB Bước 2- Cho vào ô giọt huyết mẫu tương ứng, đầu ống hút thuốc thử cách phiến đá hay phiến kính từ 1.5 – 2.5 cm Bước 3- Cho tiếp vào ô giọt máu bệnh nhân Bước 4- Dùng que thủy tinh trộn máu huyết mẫu ô Mỗi que trộn loại thuốc thử Bước 5- Lắc nghiêng trịn phiến kính hay phiến đá từ 1- phút Bước 6- Đọc kết sau phút - Ngưng kết (+) : Thấy cụm hồng cầu đứng tách rời rõ rệt dung dịch - Không Ngưng kết(-): Hỗn dịch đỏ 3.1.2.2 KT ống nhiệm 49 Bước 1- Cho vào ống nghiệm khô giọt máu bệnh nhân, rửa hồng cầu lần với nước muối sinh lý 0.9% Sau pha thành huyền dịch 5% Bước 2- Lấy ống nghiệm ghi mã số tên bệnh nhân đánh dấu A,B,AB Bước 3- Cho vào ống nghiệm giọt huyết kháng tương ứng Bước 4- Dùng ống hút nhỏ vào ống giọt huyền dịch hồng cầu bệnh nhân % Bước 5- Lắc ống nghiệm Bước Đọc kết quả: + Ngưng kết: Khi lắc khối hồng cầu ngưng kết tách khỏi đáy ống nghiệm tách thành nhiều khối nhỏ, dung dịch có màu thuốc thử + Khơng ngưng kết: lắc hồng cầu trở lại dạng hỗn dịch đỏ đục 3.2 Định nhóm máu gián tiếp( Kỷ thuật Simonin) 3.2.1 Nguyên tắc: Dùng hồng cầu mẫu chứa kháng nguyên đặc hiệu biết để định loại kháng thể huyết dựa vào phản ứng ngưng kết 3.2.2 Tiến trình kỹ thuật 3.2.2.1 Kỹ thuật phiến đá( phiến kính) Bước 1: Ghi tên hay mã số bệnh nhân lên phiến đá Bước 2: Trên phiến đá nhỏ giọt hồng cầu mẫu A 5% giọt Hồng cầu mẫu B 5% vào ô 4, 5(tiếp theo thứ tự định nhóm máu trực tiếp phiến đá) Bước 3: Cho thêm giọt huyết hay huyết tương bệnh nhân vào ô Bước 4: Trộn huyết cần thử với hồng cầu mẫu làm thành vịng trịn có đường kính 20-30 cm Lắc nghiêng trịn kính hay phiến đá Bước 5: Đọc kết ngưng kết sau phút 3.2.2.2.Kỹ thuật ống Bước 1:- Ghi tên hay mã số bệnh nhân vào ống nghiệm Bước 2:- Nhỏ giọt hồng cầu mẫu A 5%, giọt hồng cầu mẫu B5% vào ống nghiệm Bước 3:- Thêm vào ống nghiệm giọt huyết bệnh nhân Bước 4:- Trộn đều, ly tâm 1000 vòng/ phút/ phút Bước – Lấy lắc mạnh đọc kết Kết quả: * Ngưng kết: Tùy vào lượng kháng thể mà ngưng kết mạnh hay yếu, quan săt mắt thường nhỏ giọt dung dịch lên lam kính quan sát vật kính X10 50 * Không ngưng kết: Sau lắc hồng cầu trở thành dạng hỗn dịch đỏ 3.2.3 Nhận định kết định nhóm máu hệ ABO 3.2.4 Biện luận Kết nhóm máu có gía trị kết phân loại trực tiếp gián tiếp có kết phù hợp - Trường hợp máu cuống rốn: kháng thể tự nhiên chưa phát triển đầy đủ để phát Do đó, việc xác định nhóm máu chủ yếu dựa vào kết phân loại trực tiếp - Trường hợp bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch thiếu hụt miễn dịch: kháng thể tự nhiên yếu khơng phát Do việc gọi tên nhóm máu phải dựa vào kết phân loại trực tiếp - Trường hợp mẫu máu có kháng thể lạnh tự sinh Đặc điểm kháng thể lạnh tự sinh làm ngưng kết hồng cầu thân nhóm máu nào, nhiệt độ hoạt động mạnh 2-10 O c hoạt động yếu nhiệt độ phòng thí nghiệm khơng hoạt động 37 O c Nếu phân loại trực tiếp nhầm lẫn với trường hợp nhóm máu AB Để giải khó khăn ta đưa nhiệt độ phản ứng 37 o c Tất chất tham gia phản ứng phải ủ nhiệt độ 37 O c 60 phút, sau lấy đọc kết 51 BÀI 9: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM ĐỊNH NHÓM MÁU RHESUS MỤC TIÊU HỌC TẬP: Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ thuốc thử Thực thành thạo kỹ thuật định nhóm máu Rhesus NGUYÊN TẮC Cho huyết chống D tác dụng với hồng cầu bệnh nhân muốn phân loại Hồng cầu mang kháng nguyên D bị ngưng kết huyết kháng D DỤNG CỤ - THUỐC THỬ 1.1.1 Dụng cụ - Đá men kính phân - Que trộn, viết chì sáp 1.1.2 Thuốc thử - Anti D 1.1.3 Mẫu máu xét nghiệm Máu cịn khơng bị tiêu huyết, khơng bị nhiễm trùng Có thể dùng máu đơng hay máu có chất chống đông để phân loại TIẾN HÀNH KỸ THUẬT Bước 1: Ghi mã số hay tên bệnh nhân lên đá men ghi chữ D 52 Bước 2: Nhỏ lên lam kính giọt huyết chống D Bước 3: Cho tiếp vào lam kính giọt máu bệnh nhân muốn phân loại Rhesus Bước 4: Dùng que trộn thật máu thuốc thử thành vòng tròn Bước 5: Nghiêng nhẹ sau phút đọc kết Ngưng kết: Rh dương Không ngưng kết: không nên kết luận vội Rh âm, kiểm tra lại thuốc thử kỹ thuật có khơng Nếu phải tìm kháng nguyên Du kỹ thuật kháng globulin gián tiếp Kháng nguyên Du dạng yếu kháng nguyên D Nếu trắc nghiệm tìm kháng nguyên D u - Âm tính: bệnh nhân Rh âm - Dương tính : bệnh nhân Rh dương NGUYÊN NHÂN SAI LẦM - Phản ứng âm giả huyết chống D hiệu lực - Phản ứng dương giả dụng cụ thủy tinh bẩn - Sai lầm thủ tục giấy tờ, viết sai BÀI 10: KỸ THUẬT LÀM PHẢN ỨNG CHÉO MỤC TIÊU HỌC TẬP: Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ thuốc thử Trình bày nguyên tắc phản ứng chéo Thực thành thạo phản ứng chéo NGUYÊN TẮC - Mục đích phản ứng chéo để kiểm tra máu người cho có phù hợp với máu người nhận hay khơng, để đảm bảo an tồn truyền máu có nghĩa kháng thể huyết bệnh nhân không làm ngưng kết kháng nguyên bề mặt hồng cầu người cho ngược lại kháng thể huyết người cho không làm ngưng kết kháng nguyên bề mặt hồng cầu bệnh nhân, phat kháng thể bất thường hệ ABO CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - THUỐC THỬ - Bình cách thủy 37oC - Pipet pasteur - Ống nghiệm 10x 75mm - Máy li tâm - Lam kính - Kính hiển vi 53 MẪU MÁU - Máu người cho: 2ml không chống đông - Máu người nhận : 2ml không chống đông THUỐC THỬ - Huyết coombs, NaCl 0,9% - Huyết mẫu chống A, chống B, Chống AB - Hồng cầu mấu A, B TIẾN HÀNH - Định lại nhóm máu bệnh nhân người cho hai phương pháp hồng cầu mẫu huyết mẫu - Pha chế huyền dịch hồng cầu 5% BN người cho - Chuẩn bị ống nghiệm cho theo thứ tự: Ông I( chéo chính) Huyết bệnh nhân ống II (chéo phụ) giọt Hồng cầu bệnh nhân 5% giọt Huyết người cho giọt Hồng cầu người cho 5% giọt Lắc ống nghiệm - Tiến hành phản ứng chéo qua giai đoạn ► Giai đoạn + Ly tâm ống phút( tốc độ 1000 v/phút) + Lấy ống nghiệm lắc nhẹ + Đọc kết kính hiển vi với vật kính 10 Nếu ngưng kết máu người cho người nhận không phù hợp → không truyền Nếu không ngưng kết chuyển làm sang giai đoạn ► Giai đoạn 2: 54 - - - + Đặt ống vào bình cách thủy 37 c từ 30 – 50 phút,lấy Ly tâm 1000 vòng/ phút đọc kết ngưng kết + Nếu ống I âm tính chuyển giai đoạn III ► Giai đoạn III + Rửa ống nghiệm I II lần với nước muối sinh lý, gạt bỏ phần nước để lại cặn hồng cầu +Cho vào ống giọt huyết coombs ( AHG) + Trộn đều, ly tâm 1000 vòng /phút phút, đọc kết Kết quả: - Nếu ống khơng ngưng kết máu người cho người nhận phù hợp - Trường hợp ống ngưng kết hay ống ngưng kết truyền khối hồng cầu ống ngưng kết truyền huyết tương không truyền BIỆN LUẬN Trường hợp truyền máu toàn phần phải làm đầy đủ ống ống phụ Truyền khối hồng cầu cần làm ống Truyền huyết tương hay khối tiểu cầu cần làm ống chéo phụ Giai đoạn 1: sử dụng nhiệt độ phịng thí nghiệm mơi trường nước muối để phát kháng thể tự nhiên, kháng thể thuộc hệ ABO Lewis Giai đoạn 2: Sử dụng môi trường albumin, nhiệt độ 37oc nhằm phát kháng thể miễn dịch, chất chúng thường IgG hoạt động tốt nhiệt độ nóng môi trường albumin, kháng thể thuộc hệ Rh, Kidd, kell, duffy Giai đoạn 3: sử dụng huyết coombs, huyết coombs làm cầu nối hồng cầu bị cảm ứng giúp phát kháng thể miễn dịch thuộc hệ Rh, kell, dufy… NGUYÊN NHÂN SAI LẦM Mẫu máu lấy không quy cách Lam kính, ống nghiệm bẩn gây ngưng kết giả Ly tâm không tốc độ thời gian Nhiệt độ bình cách thủy khơng Mẫu máu bị tiêu huyết hay nhiễm trùng 55 BÀI 11: NGHIỆM PHÁP COOMBS MỤC TIÊU HỌC TẬP: Nêu nguyên tắc làm nghiệm pháp coombs Thực thành thạo nghiệm pháp coombs Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ làm kỹ thuật nghiệm pháp coombs I NGUYÊN TẮC số bệnh nhân bề mặt có gắn loại kháng thể bất thường, kháng thể thiếu thuộc typ Ig G vào kháng nguyên tương ứng không làm ngưng kết hồng cầu Ta dùng kháng thể globulin người làm cầu nối để làm hồng cầu ngưng kết với Đó nghiệm pháp coombs trực tiếp huyết bệnh nhân có kháng thể miễn dịch chống hồng cầu không gắn lên kháng nguyên bề mặt kết hồng cầu, dùng hồng cầu O người bình thường gây cảm nhiễm ( gắn kháng thể có huyết thanh) sau làm tiếp tục nghiệm pháp coombs trực tiếp II CHUẨN BỊ - Dụng cụ + ống nghiệm nhỏ + Pipette pasteu + Máy li tâm 56 + Phiến kính + Bình cách thủy - Hóa chất + Huyết kháng globulin người đa giá + Huyết kháng D loại yếu + Hồng cầu O RH +, Chống đông citrat natri + nước muối sinh lý + Máu xét nghiệm + Máu bệnh nhân chống đông không chống đông III TIẾN HÀNH 2.1 Nghiệm pháp coombs trực tiếp - Láy giọt hồng cầu bệnh nhân ống nghiệm có chất chống đông cho vào ống nghiệm thứ - Cho thêm nước muối sinh lý vào, rửa lần - Pha thành huyền dịch 5% - Cho vào ống nghiệm 2: giọt hồng cầu bệnh nhân pha 5% giọt huyết kháng globulin người - Lắc - Li tâm 1000 vòng / phút, phút - Dùng pipette pasteu hút hỗn dịch cho lên lam kính - Đọc kết kính hiển vi 1.2 Nghiệm pháp coombs trực tiếp - Lấy giọt hồng cầu O Rh + cho vào ống nghiệm thứ - Rửa lần với nước muối sinh lý - Pha thành huyền dịch % - Trong ống nghiệm hai cho vào: giọt huyết bệnh nhân giọt hồng cầu O Rh + 5% - Lắc - ủ 37 oc, 45 phút - Lấy lắc - Rửa lần với nước muối sinh lý - Sau lần rử thứ bỏ hết phần nước để gitoj hồng cầu cảm nhiễm với huyết bệnh nhân - Cho thêm giọt huyết globulin người đa giá - Lắc 57 - Li tâm 1000 vòng / phút, phút - Dùng pipette pasteu hút hỗn dịch cho lên lam kính - Đọc kết kính hiển vi III KẾT QUẢ 3.1 Bình thường - Coombs trực tiếp âm tính - Coombs gián tiếp âm tính 3.2 Bệnh lý - Coombs trực tiếp dương tính bề mặt hồng cầu có kháng thể miễn dịch gắn vào kháng nguyên không gây ngưng kết hồng cầu - Coombs gián tiếp dương tính huyết bệnh nhân có kháng thể miễn dịch tự chưa gắn lên màng hồng cầu - Cả hai coombs trực tiếp gián tiếp dương có kháng thể miễn dịch tự huyết bệnh nhân có kháng thể miễn dịch gắn vào kháng nguyên bề hồng cầu bệnh nhân Tài liệu tham khảo: - Kỹ thuật xét nghiệm huyết học – truyền máu, Hà Thị Anh, NXB y học 2009 - Kỹ thuật xét nghiệm Huyết học – Truyền máu ứng dụng lâm sàng, Đỗ Trung Phấn, NXB Y học 2009 - Đông máu ứng dụng lâm sàng, Nguyễn Anh Trí, NXB Y học Hà Nội 2008 - Bài giảng Huyết học đại học Y dược Huế 58