KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT TRÂM HƯƠNG THEO HƯỚNG BỀN VỮNG Ở VIỆT NAM

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể thầy cô hƣớng dẫn PGS TS Hà Văn Huân ThS.Nguyễn Thị Thơ, tận tình hƣớng dẫn, bảo suốt q trình thực khóa luận Khóa luận tốt nghiệp đƣợc hỗ trợ kinh phí từ đề tài Nghị Định thƣ với Đức “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất trầm hương theo hướng bền vững Việt Nam” Em xin chân thành cảm ơn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam giúp đỡ, bảo tận tình, khơng q trình làm khóa luận mà q trình học tập, bồi dƣỡng trƣờng Đặc biệt giúp đỡ tồn thể thầy mơn Tài nguyên thực vật rừng Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ngƣời thân động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuân lợi trình học tập, sinh hoạt, làm nghiên cứu khoa học hồn thành khóa luận tốt nghiệp Vì điều kiện thời gian, khả thân cịn có hạn chế nên khóa luận tốt nghiệp cịn có thiếu sót, em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp quý báu thầy cô giáo, nhà khoa học nhƣ bạn sinh viên để khóa luận em đƣợc hồn thiện Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 11 tháng năm 2018 Sinh viên Phạm Minh Thùy i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Chi Trầm hƣơng 1.1.2 Giới thiệu tổng quan Aquilaria sinensis 1.1.3 Sơ lƣợc hình thái: 1.1.4 Phân bố giá trị kinh tế 1.2 Tổng quan mã vạch ADN (ADN mã vạch) 1.2.1 Các đặc điểm trình tự mã vạch 1.2.2 Một số locus đƣợc sử dụng phƣơng pháp ADN mã vạch thực vật 1.3 Tình hình nghiên cứu ADN mã vạch thực vật 15 1.3.1 Những thành tựu giới 15 1.3.2 Những thành tựu nghiên cứu Việt Nam 16 1.3.3 Nghiên cứu Mã vạch ADN Trầm hƣơng Aquilaria 19 PHẦN MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 21 2.2 Nội dung nghiên cứu 21 2.3 Địa điểm thực 21 2.4 Vật liệu, hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu: 21 2.4.1 Vật liệu nghiên cứu: 21 2.4.2 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu bao gồm: 22 ii 2.4.3 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 22 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.5.1 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số 22 2.5.2 Phƣơng pháp điện di kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết 23 2.5.3 Phƣơng pháp nhân gen đích kĩ thuật PCR 24 2.5.4 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR giải trình tự 26 2.5.5 Điện di kết tinh 27 2.5.6 Giải trình tự gen 27 2.5.7 Phƣơng pháp phân tích số liệu 27 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số 28 3.2 Kết nhân gen với cặp mồi nghiên cứu 28 3.2.1 Kết nhân gen matK 28 3.2.2 Kết nhân gen trnH- psbA 30 3.2.3 Kết nhân gen rbcL 30 3.3 Phân tích kết 31 3.3.1 Kết so sánh đoạn gen matK 31 3.3.2 Kết so sánh đoạn gen trnH-psbA 33 3.3.3 Kết so sánh với đoạn gen rbcL 34 3.4 Xây dựng pháp sinh chủng loại 37 PHẦN KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 38 Kết luận 38 Tồn 38 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Thông tin số mồi ADN Mã vạch thiết kế cho hệ gen 11 lục lạp 11 ảng 2.1: Trình tự th ng tin cặp mồi 24 ảng 2.2: Thành phần nồng độ chất sử dụng phản ứng PCR 25 ảng 2.3: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR mồi matK 25 ảng 2.4: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR mồi psbA 25 ảng 2.5: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR mồi rbcL 26 iv DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình thái hoa loài Trầm huơng Hình 1.a Hình thái cành Aquilaria sinensis Hình 1.b Hình thái Aquilaria sinensis Hình 3.1: Kết điện di ADN tổng số hai mẫu Dó bầu trung quốc; giếng 1: HBQN01; giếng 2: TDC01 28 Hình 3.2 Ảnh diện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK từ mẫu ADN Dó bầu trung quốc M-thang ADN chuẩn 100bp, Giếng 1: HBQN01; Giếng 2: TDC01 29 Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnH-psbA từ mẫu ADN Dó bầu trung quốc M-thang ADN chuẩn 100bp, Giếng 1: HBQN01; Giếng 2: TDC01 30 Hình 3.4 Ảnh diện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen rbcL từ mẫu ADN Dó bầu trung quốc M- thang ADN chuẩn 100bp; Giếng 1: mẫu HBQN01; Giếng mẫu TDC01 31 Hình 3.5 Cây phân loại dựa đoạn gen rbcL xây dựng trang web: https:/www.ebi.ac.uk/Tool/msa/muscle/ 37 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Nghĩa đầy đủ Chữ viết tắt ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic Bp Base pair CBOL Consortium for the Mã vạch of life CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide Dntp Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ITS – rADN Internal Transcribed Spacer – rADN IUCN International Union for Conservation of Nature ADN Natural Resources (Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế) Kb Kilobase PCR Polymerase Chain Reaction rADN Ribosome axit deoxyribonucleic Rnase Ribonuclease TAE Tris- Acetic acide - EDTA vi ĐẶT VẤN ĐỀ Trầm hƣơng (Aquilaria sinensis (Lour) Gilg.) thuộc chi Dó trầm Aquilaria , họ Trầm Thymelaeaceae , gỗ Là loài đặc hữu Trung Quốc, phân bố Việt Nam Có khả tạo trầm từ tác động đứt gãy học xâm nhiễm loài nấm Cryptosphaerica mangifera, nấm Melanotus flavolives Tinh dầu Trầm hƣơng dầu Trầm mang giá trị kinh tế cao, đƣợc sử dụng nhiều ngành công nghiệp nƣớc hoa, đƣợc liệu, sản xuất hƣơng, làm chất thơm, giấy, đồ dùng nghi lễ, thuộc hàng sản phẩm giá trị cao… Do giá trị kinh tế cao việc sử dụng khai thác bất hợp pháp kiến cho số lƣợng giảm sút rõ rệt, loài bị khai thác mức tự nhiên, đƣợc liệt kê dễ bị tổn thƣơng IUCN (Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế) Cùng với việc làm giả phân phối với giá trị cao ngày phổ biến Vì vậy, địi hỏi cần có cơng cụ xác định nguồn gốc xác lồi Trầm nói riêng nhƣ lồi dƣợc liệu nói chung Trong cơng tác kiểm nghiệm dƣợc liệu nay, phƣơng pháp chủ yếu đƣợc sử dụng dựa hình thái học (quan sát mắt qua tiêu hiển vi) Tuy nhiên, phƣơng pháp gặp trở ngại sau nguyên liệu thực vật qua xử lý hình thái gần giống nhau, nhầm lẫn loài gần giống hình thái gần tƣơng đƣơng gây cản trở q trình phân tích gây khó khăn việc phân loại nghiên cứu nhân giống Hiện nay, sử dụng phƣơng pháp mã vạch ADN công cụ hữu hiệu phục vụ định danh lồi xác, nhanh chóng, tự động hóa cách sử dụng vùng ADN chuẩn hay gọi thị ADN (mã vạch ADN) Chính vậy, tơi thực đề tài nghiên cứu “Xác định mã vạch ADN cho loài Dó bầu trung quốc (Aquilaria sinensis (Lour) Gilg.) Việt Nam” PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Chi Trầm hương Chi Trần hƣơng gọi chung cho chi thuộc họ Trầm gồm 15 loài sống Châu Á Trên giới, chi trầm phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đ ng Nam Á miền Nam Trung Quốc Ở nƣớc ta phát loài chi trầm phân bố rải rác rừng rậm nhiệt đới thƣờng xanh, ẩm nguyên sinh: A crassna, A baillonii, A rugosa, A malaccensis, A sinensis, A banaensis Trong số loài có khả tạo trầm Aquilaria sinensis có khả tạo trầm có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên loài bị khai thác mức tự nhiên, đƣợc liệt kê dễ bị tổn thƣơng IUCN Phân loại khoa học Giới (Regnum): Plantae Ngành (Division): Magnoliophyta Lớp (Classis): Magnoliopsita Bộ (Ordo): Malvales Họ (Familia): Thymelaeaceae Chi (Genus): Aquilaria Hình 1.1 Hình thái hoa loài Trầm huơng 1.1.2 Giới thiệu tổng quan Aquilaria sinensis Aquilaria sinensis loài địa họ Thymelaeaceae, thƣờng xanh cao từ đến 20m Vỏ màu xám nhạt xám đậm, xếp luân phiên, vân bên mỏng dày đặc, gần nhƣ song song với Hoa thơm có màu vàng Quả viên nang gỗ màu xanh (hình 1.b) Hình 1.a Hình thái cành Hình 1.b Hình thái Aquilaria Aquilaria sinensis sinensis Theo tài liệu y học Trung Quốc, nhựa đƣợc chiết xuất lớn số lƣợng nhiễm nấm tự nhiên tổn thƣơng bên lên đến cm vào vỏ cây) Thu hoạch bền vững nhựa đƣợc gây cách mở vết thƣơng 3-4 cm vào vỏ cây, với nhựa thu thập vài năm sau sau tích lũy Hoặc lƣợng nhỏ nhựa đƣợc chiết xuất từ khối gỗ sƣởi ấm đốt cháy, để nhựa hóa lỏng thấm từ khối gỗ[28] 1.1.3 Sơ lược hình thái: Cây gỗ thƣờng xanh, cao – 20 m, đƣờng kính thân đạt 60 – 80 cm, thân thƣờng thẳng, đ i có rãnh dạng lịng máng; bạch gốc cao tới m; vỏ nhẵn, màu nâu xám, thịt vỏ màu trắng có nhiều chất xơ celluloz , nứt dọc lăn tăn, dễ bóc tƣớc ngƣợc từ gốc lên; cành mảnh, cong queo, màu nâu nhạt, có lơng nhẵn, tán thƣa Lá đơn, mọc cách (so le); cuống dài – mm; phiến hình trứng, bầu dục thu n đến mác thu n, kích thƣớc – 15 x 2,5 – cm, mỏng nhƣ giấy dai gần nhƣ da, mặt màu lục bóng, mặt dƣới nhạt có lơng mịn; gốc thon nhọn dần hay tù; chóp nhọn, thn nhọn, tận có mũi; gân bên 15 – 18 đ i, thay đổi thất thƣờng, rõ mặt dƣới Cụm hoa hình tán chùm tán, mọc nách đầu cành, cuống cụm hoa mảnh, dài – cm Hoa nhỏ, mẫu 5; đài hợp phần dƣới, hình chng, màu vàng lục, trắng nhạt vàng xám, phía ngồi có l ng thƣa; mặt gần nhƣ nhẵn, có 10 đƣờng gân rõ; tồn quả; thùy dài hình trứng thn, dài 12 – 15 mm Phần phụ dạng cánh hoa, đính gần họng đài; nhị 10; bầu hình trứng, ô, có lông rậm, gốc bầu có tuyến mật Quả nang gần hình trứng ngƣợc, hình lê, dài cm, đƣờng kính 2,5 – cm, có lơng mềm, ngắn, có mang dài tồn tại, khơ nứt làm mảnh, thƣờng có hạt[3] 1.1.4 Phân bố giá trị kinh tế Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg, 1894 (ISC, 2: 948; CCI: 233)_ Ophispermun sinense Lour 1790.- Bạch mộc hƣơng, Thổ trầm hƣơng, Nữ nhi hƣơng, Trầm giả Phân bố: Việt Nam, gặp Trung Quốc (Quảng Tây, Quảng Đ ng, Phúc Kiến , Đài Loan[3] Aquilaria sinensis nguồn cung cấp trầm hƣơng trầm, thơm có giá trị cao nhƣ loại hƣơng, nƣớc hoa dƣợc liệu Ngƣời ta sử dụng phần gỗ hố trầm có lồi nấm Cryptosphaerica mangifera gây nhiễm, ngồi cịn phát nấm Melanotus flavolives chứa khối trầm từ loài A sinensis Trầm hƣơng có hình dáng kích thƣớc khơng định nhƣng có mùi thơm, đốt Khi dùng làm thuốc ngƣời ta chẻ thành mảnh nhỏ, phơi râm mát cho kh , tán bột mịn Bộ phận dùng: Gỗ thân PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số Hình 3.1: Kết điện di ADN tổng số hai mẫu Dó bầu trung quốc; giếng 1: HBQN01; giếng 2: TDC01 Chất lƣợng ADN tổng số thu đƣợc độ sạch, độ nguyên vẹn hàm lƣợng) ảnh hƣởng trực tiếp đến kết q trình nghiên cứu Kết thí nghiệm cho thấy mẫu tách chiết cho băng vạch rõ nét, sáng; ADN thu đƣợc với hàm lƣợng lớn, khơng bị đứt gãy, khơng có băng phụ ADN thu đƣợc đảm bảo hàm lƣợng chất lƣợng để làm khuôn tổng hợp 3.2 Kết nh n gen với c p mồi nghiên cứu 3.2.1 Kết nhân gen matK Gen matK có kích thƣớc khoảng 1.550 bp theo lý thuyết, xuất hầu hết loài thực vật nên đƣợc sử dụng nhƣ thị nghiên cứu mối quan hệ loài phát sinh loài thực vật Kết cho thấy với 28 hai mẫu nghiên cứu gen matK có kích thƣớc khoảng 850 bp, kh ng có băng phụ hình 3.2 Đây kết tốt có thê sử dụng để tiếp tục nghiên cứu M 900bp Hình 3.2 Ảnh diện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK từ mẫu ADN Dó bầu trung quốc M-thang ADN chuẩn 100bp, Giếng 1: HBQN01; Giếng 2: TDC01 29 3.2.2 Kết nhân gen trnH- psbA Gen trnH-psbA có kích thƣớc trung bình khoảng 450 bp theo lý thuyết, nhƣng thay đổi từ 296 đến 1120 bp trnH-psbA có khả xác định lồi cao Kết cho thấy với mẫu nghiên cứu gen trnH-psbA có kích thƣớc vào khoảng 450 bp, kh ng có băng phụ hình 3.3 Đây kết tốt có thê sử dụng để tiếp tục nghiên cứu M 500pb Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnH-psbA từ mẫu ADN Dó bầu trung quốc M-thang ADN chuẩn 100bp, Giếng 1: HBQN01; Giếng 2: TDC01 3.2.3 Kết nhân gen rbcL rbcL trình tự gen nằm lục lạp nhân cách dễ dàng nhiều lồi thực vật Ở lồi khác kích thƣớc gen khác nhau, dó bầu gen rbcL có kích thƣớc khoảng 750 bp Kết kiểm tra sản phẩm điện di gen rbcL gel agarose 0,8% (hình 3.4) cho thấy gen rbcL đƣợc khuếch đại tốt tất mẫu dó bầu nghiên cứu, băng thu đƣợc sáng rõ có băng vạch 30 với kích thƣớc khoảng 600bp (khi so sánh với thang ADN chuẩn 100bp Đây kết tốt tạo sở cho nghiên cứu M 600bp Hình 3.4 Ảnh diện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen rbcL từ mẫu ADN Dó bầu trung quốc M- thang ADN chuẩn 100bp; Giếng 1: mẫu HBQN01; Giếng mẫu TDC01 3.3 Ph n t ch kết 3.3.1 Kết so sánh đoạn gen matK A.yunnanensis CTGGTTAAAAGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATT HBQN01 -TCGCTGCTGGTAAGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATT TDC01 TTCGCTGCTGGTAAGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATT *** * ************************************************ A.yunnanensis TGAATTTGAAGAGTCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAA HBQN01 TGAATTTGAAGAGTCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAA TDC01 TGAATTTGAAGAGTCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAA ************************************************************ A.yunnanensis GATTCTTTTTTTTCCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTC HBQN01 GATTCTTTTTTTTCCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTC TDC01 GATTCTTTTTTTTCCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTC ************************************************************ 31 A.yunnanensis TCCGTAACCAATCCTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCT HBQN01 TCCGTAACCAATCCTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCT TDC01 TCCGTAACCAATCCTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCT ************************************************************ A.yunnanensis ATTTCTATGGAAAAATCGAACATCTTGTAGAAGTTTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACC HBQN01 ATTTCTATGGAAAAATCGAACATCTTGTAGAAGTTTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACC TDC01 ATTTCTATGGAAAAATCGAACATCTTGTAGAAGTTTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACC ************************************************************ A.yunnanensis TATCCTTGTTCAAGGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTG HBQN01 TATCCTTGTTCAAGGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTG TDC01 TATCCTTGTTCAAGGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTG ************************************************************ A.yunnanensis CTTCAAACGATACGCCTCTTATGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGC HBQN01 CTTCAAACGATACGCCTCTTATGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGC TDC01 CTTCAAACGATACGCCTCTTATGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGC ************************************************************ A.yunnanensis AATATCATTTTTATGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAAT HBQN01 AATATCATTTTTATGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAAT TDC01 AATATCATTTTTATGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAAT ************************************************************ A.yunnanensis ATTCTCTTGACTTTCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCA HBQN01 ATTCTCTTGACTTTCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCA TDC01 ATTCTCTTGACTTTCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCA ************************************************************ A.yunnanensis GTCAAATGCTAGAAAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAA HBQN01 GTCAAATGCTAGAAAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAA TDC01 GTCAAATGCTAGAAAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAA ************************************************************ A.yunnanensis TGCCAATGATTTCTCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTC HBQN01 TGCCAATGATTTCTCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTC TDC01 TGCCAATGATTTCTCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTC ************************************************************ A.yunnanensis ATCCTATTAGTAAGCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTT HBQN01 ATCCTATTAGTAAGCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTT TDC01 ATCCTATTAGTAAGCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTT ************************************************************ 32 A.yunnanensis TGCGTATATGCAGAAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGT HBQN01 TGCGTATATGCAGAAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGT TDC01 TGCGTATATGCAGAAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGT ************************************************************ A.yunnanensis ATCGAATAAAATATATACTTCGGCTTTCTTGTCTTA HBQN01 ATCGAATAAAATATATAC-TCGGCT TCTT- TDC01 ATCGAATAAAATATATAC-TCGGCT TCTTC ****************** ****** **** Đoạn gen có trình tự 815bp phù hợp với độ dài lý thuyết, so sánh mẫu với loài Aquilaria yunnanesis Ngân hàng gen có độ tƣơng đồng cao tới 98,1% có 16 vị trí sai khác, nucleotide vị trí đầu tiên, vị trí nucleotide số 8, 10, 11, 12, 798, 805, 806, 807, 808, 809, 810và 815 Vị trí: 1,2,3,4 lồi Aquilaria yunnanensis khuyết Vị trí Aquilaria yunnanensis nucleotide loại G, mẫu nghiên cứu nucleotide loại C Vị trí 798, 805, 806, 807, 808, 809, 810: mẫu nghiên cứu khuyết thiếu Vị trí 815: Mẫu HBQN01 khuyết, TDC02 nucleotide loại C, lồi Aquilaria yunnanensis có nucleotide loại A Kết cho thấy trình tự sai khác thƣờng xuất đầu cuối đoạn gen nên chƣa thể đƣa kết luận Trình tự sai khác xuất phát từ sai xót từ trình giải trình tự gen, sai khác bắt nguồn từ mẫu nghiên cứu 3.3.2 Kết so sánh đoạn gen trnH-psbA TDC01 TCCA A.sinensis TCCA A.yunnanensis TCCA HBQN01 TCCA **** TDC01 CTTTTATCGAATATTAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGA A.sinensis CTTTTAT-GAATATTAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGA A.yunnanensis CTTTTAT-GAATATTAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGA HBQN01 CTTTTAT-GAATATTAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGA ******* **************************************************** TDC01 ACTTCACAAAAGATTGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAG A.sinensis ACTTCACAAAAGATTGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAG 33 A.yunnanensis ACTTCACAAAAGATTGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAG HBQN01 ACTTCACAAAAGATTGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAG ************************************************************ TDC01 ACCACCTTTTCCTATTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGT A.sinensis ACCACCTTTTCCTATTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGT A.yunnanensis ACCACCTTTTCCTATTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGT HBQN01 ACCACCTTTTCCTATTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGT ************************************************************ TDC01 AAATAAAAGACTACTAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAA A.sinensis AAATAAAAGACTACTAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAA A.yunnanensis AAATAAAAGACTACTAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAA HBQN01 AAATAAAAGACTACTAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAA ************************************************************ TDC01 CAAGAAATTGGTTATTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACA A.sinensis CAAGAAATTGGTTATTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACA A.yunnanensis CAAGAAATTGGTTATTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACA HBQN01 CAAGAAATTGGTTATTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACA ****************************************************** Đoạn gen có trình tự 389-392bp phù hợp với độ dài lý thuyết, so sánh mẫu với loài Aquilaria yunnanensis, Aquilaria sinensis ngân hàng gen có độ tƣơng đồng cao 99,97% có điểm sai khác vị trí 12 Tại vị trí sai khác mẫu TDC01 có thêm nucleotide loại C, lồi khác mẫu HBQN01 trình tự khuyết 3.3.3 Kết so sánh với đoạn gen rbcL HBQN01 ATGTCACCCCCAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGAGTA TDC01 ATGTCACCCCCAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGAGTA sinensis1 ATGTCA-CCACAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGAGTA crassna ATGTCA-CCACAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAGGCTGGTGTTAAAGAGTA sinensis2 ATGTCA-CCACAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGAGTA malaccensis ATGTCA-CCACAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGAGTA ****** ** ******************************** ***************** HBQN01 TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT TDC01 TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT sinensis1 TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT 34 crassna TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT sinensis2 TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT malaccensis TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT ************************************************************ HBQN01 CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA TDC01 CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA sinensis1 CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA crassna CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA sinensis2 CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA malaccensis CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA ************************************************************ HBQN01 ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA TDC01 ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA sinensis1 ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA crassna ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA sinensis2 ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA malaccensis ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA ************************************************************ HBQN01 CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA TDC01 CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA sinensis1 CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA crassna CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA sinensis2 CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA malaccensis CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA ************************************************************ HBQN01 TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT TDC01 TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT sinensis1 TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT crassna TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT sinensis2 TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT malaccensis TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT ************************************************************ HBQN01 TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT TDC01 TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT sinensis1 TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT crassna TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT sinensis2 TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT malaccensis TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT ************************************************************ 35 HBQN01 CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA TDC01 CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA sinensis1 CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA crassna CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA sinensis2 CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA malaccensis CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA ************************************************************ HBQN01 TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT TDC01 TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT sinensis1 TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT crassna TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT sinensis2 TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT malaccensis TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT ************************************************************ HBQN01 ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGTGGTGGATTGGAATTTTA TDC01 ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGTGGTGGATTGGAATTTTA sinensis1 ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGAGGTGGACTTGATTTTAC crassna ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGTGGTGGACTTGATTTTAC sinensis2 ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGTGGTGGACTTGATTTTAC malaccensis ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGTGGTGGACTTGATTTTAC ****************************************** ****** * ** *** Đọan gen có độ dài 599bp phù hợp với độ dài lý thuyết, so sánh với Aquilaria sinensis, Aquilaria crassna Aquilaria malaccensis có độ tƣơng đồng cao 99%, H QN01 có độ tƣơng đồng 100% Các vị trí sai khác mẫu với lồi vị trí 7, 10, 43, 582, 589, 591, 594, 598 599.Vị trí số 7: mẫu HBQN01 TDC01 nucleotide loại C, loài cịn lại khuyết.Vị trí số 10: mẫu HBQN01 TDC01 nucleotide loại C, lồi cịn lại nucleotide loại A Vị trí 43: có sai khác Aquilaria crassna nucleotide loại G, tất loài so sánh với mẫu nucleotide loại A Vị trí 582: sai khác nucleotide loại A loài Aquilatia sinensis KY927292.1, tất loài so sánh với mẫu nucleotide loại T Vị trí 589, 591, 594, 598 599: có mẫu HBQN01 TDC01 có trình tự giống khác so với loài Aquilaria đem so sánh 36 Từ kết cho thấy vị trí sai khác thƣờng nằm đầu kết thúc đoạn gen, chƣa nhận định đƣợc xác điểm sai khác đoạn gen nghiên cứu, hay sai sót q trình giải trình tự đoạn gen 3.4 X y dựng c y pháp sinh chủng loại Dựa vào kết luận sơ trên, xây dựng quan hệ mẫu nghiên cứu loài Aquilaria ngân hàng gen NCBI (Aquilaria crassna KU244189.1, Aquilatia sinensis KY927292.1 KY927336.1, Aquilaria malaccesis KU244220, ) dựa kết phân tích đoạn gene rbcL: Hình 3.5 Cây phân loại dựa đoạn gen rbcL xây dựng trang web: https:/www.ebi.ac.uk/Tool/msa/muscle/ Kết hình 3.5 cho thấy mẫu Trầm có quan hệ gần với Và có quan hệ tƣơng đƣơng với loài Aquilaria malaccesis KU244220, Aquilaria crassna KU244189.1, Aquilatia sinensis KY927336.1 37 KY927292.1 PHẦN KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đã tách chiết đƣợc ADN tổng số mẫu Dó bầu trung quốc thu Quảng Ninh - Đã nhân thành công đoạn gen matK, trnH-psbA, rbcL phƣơng pháp PCR từ ADN tổng số - Đã xác định đƣợc trình tự nucleotide đoạn gen matK, trnHpsbA, rbcL mẫu nghiên cứu - Đánh giá đƣợc tƣơng quan mối quan hệ di truyền loài với loài Aquilaria khác chi Trầm hƣơng Tồn Do thời gian kinh phí có hạn nên chúng t i chƣa có điều kiện làm lặp lại nhiều lần với gen nghiên cứu nhƣ số lƣợng gen nghiên cứu chƣa nhiều Kiến nghị - Với gen nghiên cứu trên, tiếp tục lặp lại trình nhân gen đọc trình tự để có đƣợc trình tự xác dùng cơng bố Ngân hàng gen giới - Nghiên cứu tiếp chuỗi ADN lục lạp khác, kết hợp với số gen nhân để có kết luận đầy đủ mối quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu phân loại, định danh loài Aquilaria sinensis Việt Nam 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Hà Văn Huân 2015 , Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử ADN (mã vạch ADN phân tích đa dạng di truyền giám định sinh vật Việt Nam, Ngân hàng liệu ADN Việt Nam Hoàng Đăng Hiếu (2012), Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích đa dạng định dạng tập đồn Dó bầu (Aquilaria sp.) Hà Tĩnh, Luận Văn Thạc sỹ Trung tâm nghiên cứu Tài nguyên M i trƣờng ĐHQGHN, Danh lục loài thực vật Việt Nam, tập II, NXB Nông nghiệp.(2012) Tài liệu tiếng anh Borsch T., Hilu K.W., QuADNt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms, J Evol Biol, (6), pp 558-576 Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., ADN Vincent S (2005), LADN plants ADN ADN barcodings: short-term ADN long-term goals, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp 1889-1895 Hebert P, Ball S L, De Waard J R., (2003) Biological indentification through DNA barcodes Proc R Soc Lond B Biol Sci, 270:313-321 Kiet L., Kessler PJA ADN Eurlings M (2005), A new species of Aquilaria (Thymelaceaceae) from Vietnam, Blumea, (50), pp 135-141 Kress W J., Erickson D L (2008), ADN barcodings: Genes, genomics, ADN bioinformatics, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 Lichao Jiao, Yafang Yin, Yeming Cheng ADN Xiaomei Jiang (2013),ADN barcoding for identification of the endangered species Aquilaria sinensis: comparison of data from heated or aged wood samples Holzforschung; aop.DOI 10.1515/hf-2013- 0129 10 M Ishihara, T Tsuneya, & K Uneyama, (1993), Fragrant sesquiterpenes from agarwood, Phytochemistry 33: 1147-1155 11 M.C.M Eurlings ADN B Gravendeel (2005), TrnL-trnF sequence data imply paraphyly of Aquilaria ADN Gyrinops (Thymelaeaceae) ADN provide new perspectives for agarwood identification Plant Systematics ADN Evolution DOI 10.1007/s00606-005- 0312-x 12 Michiho I., Ken I O., Toru Y., Gisho H., Fumiyuki K., Yasuo S (2005) ,Induction of sesquiterpenoid production by methyl jasmonate in Aquilaria sinensis cell suspension culture, Journal of Essential Oil Research, 17(2), pp 175-180 13 Nurita T M., Dewi R., Anidah (2009), Genetic variations among aquilaria species ADN gyrinops vetseegii using amplified fragment length polymorphism markers, Biotropia,Vol 16 (No.2), pp 88 - 95 14 Ole S ADN Gitte P (2009), How many loci does it take to ADN mã vạch a crocus?, PLoS ONE, 4(2), pp 4598 15 Phialophora parasitica Crous, P W et al (1996), Phaeoacremonium gen nov associated with wilt ADN decline diseases of woody hosts ADN human infections Mycologia 88(5): pp 786–796 16 Qi S H., He M L., Lin D L., Zhang C H., Hu L J., ADN Zhang H Z (2005).Production of 2-(2-phenylethyl) chromones in cell suspension cultures of Aquilaria sinensis Biomedical ADN Life Science , 83(2), pp.217-221 17 Savolainen V., ADN Chase M W (2003), A decade of progress in plant molecular phylogenetics, Trends Genet, (19), pp 717-724 18 Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L (2007), Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms, The tortoise ADN the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 19 Steinke, D., T S Zemlak, J A Boutillier & P D N Hebert 2009 , ADN barcoding of pacific Canada’s fishes Marine Biology, 156: 2641-2647 20 Storchova H., M S Olson (2007), The architecture of the chloroplast psbA-trnH non coding region in angiosperms, Plant systematic ADN evolution Biomedical ADN life sciences, Vol 268, No 1-4, pp 235-256 21 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., ADN Eske W (2007), Power ADN limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant ADN barcoding, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 22 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), ADN barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives, (Hydrocotyle Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091 23 Vijayan K ADN Tsou C H (2010), ADN barcoding in plants: taxonomy in a new perspective, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 24 Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010), ADN barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots, BMC Plant Biology (10), pp.205 25 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), Combining bioinformatics ADN phylogenetics to identify large sets of singlecopy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary ADN systematic studies: A test case in the euasterid plant clade, Genetics (174), pp 1407-1420 26 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), Use of ITS2 region as theuniversal ADN mã vạch for plants ADN animals, PLoS ONE (5), pp.13102 27 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L ADN Hui Y (18 December, 2010), Authentication of Taxillus chinensis using ADN barcoding technique, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 28 Zhou, M; Wang, H; Suolangjiba; Kou, J; Yu, B (May 2008), "Antinociceptive and anti-inflammatory activities of Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg Leaves extract", Journal of Ethnopharmacology, 117 (2): 345– 50 Tài liệu internet 29 http://tropical.theferns.info/viewtropical.php?id=Aquilaria+sinensis 30 http://www.mã vạchoflife.org/ 31 http://www.tramhuongvietnam.com/thongtinbaochip1.php 32 https://www.epd.gov.hk/epd/sites/default/files/epd/english/boards/advisor y_council/files/ncsc_paper03_2013.pdf 33 ... Transcribed Spacer – rADN IUCN International Union for Conservation of Nature ADN Natural Resources (Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế) Kb Kilobase PCR Polymerase Chain Reaction rADN Ribosome axit deoxyribonucleic... lƣợng giảm sút rõ rệt, loài bị khai thác mức tự nhiên, đƣợc liệt kê dễ bị tổn thƣơng IUCN (Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế) Cùng với việc làm giả phân phối với giá trị cao ngày phổ biến... 2010 rpoC1 thị hữu ích đƣợc sử dụng để phân biệt loài bryophytes Do cần có nghiên cứu để chứng minh phù hợp sử dụng rpoB rpoC1 làm thị mã vạch nghiên cứu giám định loài [23; 25] 13 1.2.2.7 Trình