TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Tổng quan về mã vạch ADN (ADN mã vạch)
Phương pháp phân loại hình thái đã phát triển lâu đời, tạo ra hệ thống phân loại sinh vật và thực vật khá toàn diện, dựa vào sự khác biệt về hình thái giữa các cơ quan, đặc biệt là cơ quan sinh sản hoa Tuy nhiên, phương pháp này gặp khó khăn trong việc xác định mẫu vật chưa ra hoa, những mẫu có đặc điểm giống nhau, hoặc khi có nhiều điểm tương đồng ở cấp độ phân loại thấp như loài và dưới loài Việc giám định loài qua sản phẩm sơ chế hoặc bộ phận rời rạc cũng rất khó khăn Hơn nữa, phương pháp phân loại hình thái chỉ có thể thực hiện bởi các chuyên gia hình thái học, gây tốn nhiều thời gian và công sức.
Thuật ngữ “ADN mã vạch” được giới thiệu lần đầu vào năm 1993 (Arnon, 1993) và đề cập đến việc sử dụng trình tự ADN như một phương tiện nhận diện để xác định nhanh chóng và chính xác các loài Kỹ thuật này chủ yếu dựa vào việc phân tích các đoạn ADN đặc trưng của từng loài.
Kỹ thuật ADN mã vạch sử dụng một khu vực ADN từ 400-800 bp như một tiêu chuẩn để nhận dạng các loài một cách nhanh chóng và chính xác, hỗ trợ các nhà phân loại học trong việc phân loại và xác định loài Phương pháp này nâng cao khả năng kiểm soát, hiểu biết và tận dụng sự đa dạng sinh học, đồng thời có triển vọng nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như khoa học cuộc sống, khoa học pháp y, y tế, nghiên cứu y dược, và sản xuất cũng như kiểm soát chất lượng thực phẩm Kỹ thuật này còn có ý nghĩa quan trọng trong việc giám định các mẫu vật sinh học đã qua xử lý, chế biến như thuốc và thực phẩm.
Nghiên cứu của Hebert và cộng sự (2002) cho thấy rằng có thể xác định chính xác 100% các cá thể từ bộ sưu tập 200 loài gần gũi trong bộ cánh vảy thông qua gen ty thể cytochrome c oxidase tiểu đơn vị I (COI), enzyme cuối cùng trong chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể Nhiều nghiên cứu tiếp theo đã áp dụng phương pháp định danh loài bằng chỉ thị ADN cho các động vật như chim, cá, ốc tiền, nhện và một số loài côn trùng thuộc bộ Cánh cứng Năm 2003, Hebert đã đề xuất khái niệm "mã vạch ADN" như một phương pháp hiệu quả để xác định loài.
ADN mã vạch không thay thế phân loại nhưng là công cụ hữu ích để cung cấp thông tin về các đơn vị phân loại chưa biết Để thúc đẩy việc sử dụng ADN mã vạch cho tất cả sinh vật nhân chuẩn trên hành tinh, CBOL (Consortium for the Barcode of Life) đã được thành lập vào tháng 5 năm 2004, với hơn 120 tổ chức từ 45 quốc gia Mục tiêu ban đầu của CBOL là xây dựng một thư viện trực tuyến trình tự mã vạch cho tất cả các loài chưa được biết đến, làm tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ mẫu ADN nào Theo The Barcode of Life Data Systems, tính đến năm 2011, đã lưu trữ hơn 1.100.000 ADN mã vạch từ hơn 95.000 đối tượng sinh vật khác nhau Trong hơn 10 năm qua, đã có trên 180.000 trình tự ADN mã vạch của thực vật được lưu trữ trong ngân hàng gene quốc tế và liên kết với hơn 2000 bài nghiên cứu.
8 báo khác nhau Với sự hỗ trợ của CBOL, ADN mã vạch ngày càng phát triển và trở thành một phương pháp phân loại và định danh loài mới
1.2.1 Các đặc điểm cơ bản của trình tự mã vạch Đặc điểm quan trọng nhất của ADN mã vạch là phải phổ biến và đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng Điều này có nghĩa là các đoạn gen đƣợc sử dụng nhƣ một mã vạch nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có sự biến đổi giữa các loài nhƣng ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi kh ng đáng kể Do đó, ADN mã vạch lý tưởng là một đoạn ADN có trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp đƣợc với cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuếch đại bằng PCR
Hệ gen ty thể ở động vật, với các đặc tính di truyền theo dòng mẹ và tốc độ đột biến cao, chủ yếu là các đột biến thay thế, được xem là công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu nguồn gốc các loài ADN ty thể có số lượng bản sao lớn và bền vững trong thời gian dài, trong khi ADN nhân chỉ có một bản sao và nhanh chóng bị phân hủy Do đó, nhiều nghiên cứu sử dụng vùng ADN ngắn của gen ty thể mã hóa cytochrome c oxidase subunit I (COI) làm chỉ thị ADN, và mặc dù có vài ngoại lệ, COI được coi là chỉ thị ADN điển hình và chung cho các loài động vật.
Quá trình tìm kiếm chỉ thị ADN chung cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là ở hệ gen lục lạp và hệ gen nhân Vùng ADN giữa các gen, hay còn gọi là ITS (Internal Transcribed Spacer), thường được sử dụng làm chỉ thị ADN trong một số nghiên cứu Mặc dù nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất làm chỉ thị ADN cho thực vật, nhưng chưa có chỉ thị nào được hầu hết các nhà phân loại học thực vật chấp nhận.
Nhiều nghiên cứu đã thống nhất rằng để xác định loài thực vật, cần sử dụng nhiều vùng ADN chỉ thị khác nhau.
Theo Taberlet P và cộng sự (2007), hệ thống mã vạch ADN lý tưởng phải đáp ứng các yêu cầu sau đây:
Đoạn ADN chỉ thị cần có độ biến thiên đủ lớn để phân biệt các loài, nhưng cũng phải đảm bảo rằng sự khác biệt giữa các cá thể trong cùng một loài không quá nhiều.
- Thứ hai, hệ thống định danh bằng ADN phải đƣợc chuẩn hóa, với cùng một vùng ADN có thể đƣợc sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau
- Thứ ba, đoạn ADN chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ,…
Thứ tư, phương pháp này có thể áp dụng cho các mẫu vật thô và vị trí cặp mồi nhân gen với độ bảo thủ cao, giúp dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự ADN.
- Đoạn ADN nghiên cứu nên có kích thước ngắn để quá trình nhân bản ADN không bị sai lệch Th ng thường, đoạn ADN nghiên cứu có kích thước
150 bp trở lại, nếu dài hơn sẽ dễ bị sai lầm trong quá trình nhân bản ADN
1.2.2 Một số locus được sử dụng trong phương pháp ADN mã vạch ở thực vật
Các trình tự mã vạch được nhân bản từ ADN của bố mẹ hứa hẹn cung cấp thông tin phong phú hơn về các loài cần xác định Tuy nhiên, việc khuếch đại PCR từ gen nhân gặp khó khăn do gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc có số lượng bản sao thấp Điều này, kết hợp với sự suy thoái và chất lượng ADN genome cũng như khả năng phân biệt dưới loài, có thể là nguyên nhân chính dẫn đến hạn chế trong số lượng gen nhân được thử nghiệm trong xác định loài bằng phương pháp ADN mã vạch.
1.2.2.2 Vùng gen mã hóa ribosome
Gen rADN là hệ thống đa gen mã hóa ARN ribosome, với các gen ADN ribosome mang trình tự vừa bảo thủ vừa đa dạng, giúp phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rADN được sắp xếp thành các đơn vị lặp lại ngẫu nhiên, bao gồm ADN mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 nằm ở hai bên vùng 5,8S Vùng mã hóa của ba gen rADN có độ bảo tồn cao hơn so với hai vùng ITS Các đơn vị rADN lặp lại hàng nghìn lần và tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể Một đặc điểm nổi bật của rADN là sự tiến hóa phối hợp của các đơn vị trong hệ thống đa gen, mang lại mức độ ổn định cao hơn trong loài nhưng vẫn duy trì sự khác biệt giữa các loài khác nhau.
Hiện nay, vùng ITS của gen nrITS được coi là công cụ quan trọng trong việc đánh giá sự phát sinh loài ở thực vật và động vật Điều này là do vùng gen này phổ biến trong tự nhiên, có khả năng kế thừa từ bố mẹ và có mức độ biến đổi cao, ít bị hạn chế về chức năng Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng cả cây sinh sản hữu tính và vô tính đều cho thấy sự biến đổi đáng kể ở số lượng bản sao của trình tự ITS1.
ITS2 bị ảnh hưởng bởi nhiều nguyên nhân như lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và sự hình thành gen giả của các gen chức năng, dẫn đến những thay đổi đáng kể Dựa trên cơ sở này, nrADN có thể được sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả các loài thực vật có đặc điểm lịch sử sống khác nhau, bao gồm một năm, lâu năm, trên cạn và dưới nước, cũng như nguồn gốc tiến hóa khác nhau.
Tình hình nghiên cứu ADN mã vạch ở thực vật
1.3.1 Những thành tựu trên thế giới
Nghiên cứu mã vạch ở thực vật tập trung vào việc đánh giá hiệu quả của các đoạn gen chỉ thị trong phát sinh loài Việc tìm kiếm chỉ thị ADN chung cho các loài thực vật gặp nhiều thách thức do hệ gen ty thể thường quá bảo thủ, không phù hợp cho chỉ thị ADN Ngược lại, hệ gen lục lạp có nhiều đặc điểm ưu việt cho việc xác định chỉ thị ADN, tương tự như hệ gen ty thể ở động vật Trong khi đó, vùng ADN giữa các gen, được gọi là ITS, cũng đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu mã vạch thực vật.
(Internal Transcribed Spacer cũng đƣợc sử dụng làm ADN chỉ thị trong một số nghiên cứu [4;18;22]
Mặc dù một số locus trong hệ gen lục lạp và gen nhân đã được nghiên cứu làm chỉ thị trong ADN mã vạch, nhưng kết quả vẫn còn hạn chế Việc kết hợp các locus để nâng cao hiệu quả trong đánh giá và phân loại thực vật là cần thiết Gen rbcL đã được sử dụng lâu dài trong nghiên cứu phát sinh loài, trong khi gen matK có tỷ lệ tiến hóa cao và khả năng phân biệt loài tốt Kết hợp hai locus rbcL và matK mang lại hiệu quả phân biệt lên đến 70% và giảm chi phí cho các nghiên cứu về mối quan hệ và phân loại thực vật Sự kết hợp này phù hợp cho các nghiên cứu tương tác thực vật - động vật, xác định loài cây được bảo vệ, khảo sát đa dạng sinh học quy mô lớn và phân biệt cây giống trong các chương trình tái sinh rừng.
Spooner đã chỉ ra rằng trình tự psbA - trnH, matK và nrITS không cung cấp đủ thông tin về loài cụ thể trong 63 loài khoai tây dại Gen lạp thể không thể hiện sự khác biệt rõ ràng, trong khi nrITS cho thấy sự phân biệt cao giữa các loài Tương tự, những khó khăn này cũng xuất hiện trong chi Magnolioideae, họ Magnoliaceae và Lauraceae khi xác định mối quan hệ giữa các loài Qua nghiên cứu trên ba nhóm thực vật khác nhau, các nhà phân loại đã kết luận rằng việc kết hợp các locus gen lạp thể như rbcL + rpoC1 + matK + trnH-psbA mang lại hiệu quả cao như một hệ thống mã vạch duy nhất cho việc xác định các nhóm loài rộng.
Trong các dự án giám định loài sử dụng chỉ thị mã vạch, việc đề xuất mã vạch hai locus tiêu chuẩn không đủ do sự phân ly lớn trong loài và quần thể của nhiều thực vật hạt kín Sự thay đổi của một hoặc hai trình tự gen lạp thể không thể đánh dấu ranh giới loài, đặc biệt trong các khu vực phân bố có giao phối và giao phối cận huyết Các vấn đề sinh học như đa bội thể, sinh sản vô tính, chuyển gen, chọn dòng, phân ly và tiến hóa nhanh hình thái học gây khó khăn trong việc xác định loài Do đó, cần lựa chọn các vùng ADN khác nhau cho việc xác định các loài khác nhau.
Hệ thống ADN mã vạch cho thực vật vẫn chưa hoàn chỉnh, nhưng các trình tự ADN hiện có đã giúp các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng hiệu quả trong việc xác định loài thực vật Điều này mở ra triển vọng mới cho công tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinh học.
1.3.2 Những thành tựu nghiên cứu tại Việt Nam Ở Việt Nam, đến nay đã có một số c ng trình nghiên cứu về mã vạch ADN đƣợc triển khai ở một số cơ sở nghiên cứu Tuy nhiên, các nghiên cứu này vẫn còn rất nhỏ lẻ, trên một vài đối tƣợng sinh vật, chƣa có tính hệ thống,
Hiện tại, 17 đồng bộ chưa đủ để xây dựng cơ sở dữ liệu về mã vạch ADN Nhiều đề tài nghiên cứu liên quan đang được triển khai tại các viện nghiên cứu và trường đại học trên toàn quốc.
Tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, nhiều đề tài nghiên cứu quan trọng liên quan đến bảo tồn và đa dạng sinh học đã được thực hiện, bao gồm các nghiên cứu về mối quan hệ di truyền của các loại cây gỗ quý thuộc chi trắc Dalbergia, xác định các loài chi tre Bambusa Schreb bằng phương pháp ADN, và nghiên cứu tính đa dạng nguồn gen của một số loài lá kim ở Tây Nguyên Đặc biệt, đề tài cấp nhà nước TN3/T15 (2012-2015) do PGS.TS Đinh Thị Phòng thực hiện đã đề xuất giải pháp bảo tồn và phát triển bền vững Ngoài ra, nghiên cứu của TS Nguyễn Minh Tâm về hai loài Dầu nước đang bị đe dọa cũng đã góp phần quan trọng vào lĩnh vực ứng dụng công nghệ ADN trong nghiên cứu đa dạng di truyền tại Việt Nam Các kết quả từ những đề tài này đã tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này.
Kết hợp phương pháp sinh học phân tử và hình thái trong nghiên cứu phân loại các họ Thiên lý Asclepiadaceae và Trúc đào Apocynaceae ở Việt Nam (2009-2010) đã được thực hiện tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật Đồng thời, nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của cây dó bầu tại Việt Nam bằng kỹ thuật chỉ thị ADN nhằm bảo tồn và nâng cao hiệu quả sản xuất trầm hương diễn ra từ 2010-2011 tại Viện Công nghệ sinh học Ngoài ra, định loại phân tử cũng được áp dụng để giám sát thương mại và thương mại hóa các lâm sản ngoài gỗ ở Campuchia, Lào và Việt Nam vào năm 2010.
Năm 2012, Viện Công nghệ sinh học đã tiến hành nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN nhằm định danh sâm Ngọc Linh và cây á bệnh Kết quả cho thấy gen 18S rARN có thể được sử dụng để phân loại các loài thuộc chi Bình vôi, đồng thời xác định mối quan hệ họ hàng giữa các loài sa mộc nhập từ Trung Quốc và mọc tự nhiên tại Việt Nam Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các chỉ thị gen lục lạp là công cụ hữu hiệu trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và xuất xứ các loài cây lâm nghiệp Đề tài giám định phân tử và di truyền quần thể của rừng gỗ Pơ Mu, đánh giá đa dạng di truyền của chi Lan huệ, và nghiên cứu hệ thống phân loại các loài cây thuộc họ Dầu cũng được thực hiện trong giai đoạn 2010-2012 Nhóm nghiên cứu của Trần Hoàng Dũng đã xác định các đoạn ADN đặc trưng làm mã vạch cho các thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và dược tính như Lan Hài, Hoàng Thảo, Sâm Ngọc Linh, và một số loài nấm dược liệu Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Nga và cộng sự cũng đã đánh giá đa dạng di truyền của một số loài cây dược liệu Việt Nam.
Nghiên cứu đã xác định 19 loài thuộc chi Đảng Sâm Codonopsis sp bằng kỹ thuật ADN mã vạch, với việc khuếch đại thành công hai vùng gen ITS và matK, đồng thời phân tích sự đa hình trên mỗi vùng gen Kết quả cho thấy rằng mã vạch ADN có thể hỗ trợ trong việc phân tích đa dạng di truyền của các loài Codonopsis tại Việt Nam, khẳng định rằng vùng gen ITS và matK có khả năng nhận diện loài và dưới loài, phục vụ cho nghiên cứu tiến hóa học phân tử và bảo tồn nguồn gen Hoàng Đăng Hiếu và cộng sự (2012) đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phân tích đa dạng cây Dó bầu Aquilaria SP tại Hà Tĩnh, tách chiết ADN tổng số từ 18 mẫu, bao gồm 3 loài từ Lào và 4 mẫu từ Phú Quốc Hà Văn Huân (2013, 2014) đã xây dựng cơ sở dữ liệu chỉ thị phân tử ADN mã vạch cho loài Sến mật (Madhuca pasquierii) và phân lập đoạn ADN barcoding cho loài Trà hoa vàng Tam đảo (Camellia tamdaoensis) nhằm bảo tồn và phát triển loài trà quý hiếm của Việt Nam.
Nghiên cứu đã đặt nền tảng quan trọng cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong phân loại, giám định và đánh giá đa dạng di truyền, từ đó hỗ trợ công tác bảo tồn và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật tại Việt Nam.
1.3.3 Nghiên cứu Mã vạch ADN của cây Trầm hương Aquilaria
Hiện nay, cả trên thế giới và tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu công bố về chỉ thị phân tử và mã vạch ADN của các loài thuộc chi Aquilaria Việc áp dụng mã vạch ADN giúp xác định nhanh chóng các loài và nguồn gốc của Trầm hương, từ đó nâng cao chất lượng sản phẩm Điều này đóng vai trò quan trọng trong công tác tuyển chọn và phát triển nguồn gen Trầm hương.
Trồng các giống Trầm hương chất lượng cao và sử dụng nguồn giống tốt là rất quan trọng để nuôi cấy in vitro, nhằm tạo ra tinh dầu trầm chất lượng.
Hoàng Đăng Hiếu (2012), sử dụng 4 trình tự gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, ITS để phân loại 18 mẫu Dó bầu thu thập từ tập đoàn Dó bầu tại Hà
Các gen Tĩnh trnH-psbA và rpoB có ít sự khác biệt, do đó khó khăn trong việc xác định các mẫu Dó bầu (Aquilaria sp.) Ngược lại, các chỉ thị rbcL và ITS lại có giá trị cao trong việc phân loại các loài thuộc chi Aquilaria.
Dựa về mặt hình thái hai chi Aquilaria và Gyrinops của họ
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của nghiên cứu là xác định các đoạn mã vạch ADN cho loài Dó bầu Trung Quốc (Aquilaria simensis (Lour) Gilg.), từ đó xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch Việc này sẽ hỗ trợ trong việc giám định loài và quản lý nguồn tài nguyên sinh vật hiệu quả hơn.
Nhân bản đƣợc các đoạn gen rbcL, matK,(trnH-psbA) của loài Dó bầu trung quốc (Aquilaria simensis (Lour) Gilg.)
Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết, tinh sạch ADN tổng số từ mẫu lá cây Dó bầu trung quốc;
- Nhân bản các đoạn gen matK, (trnH-psbA), rbcL;
- Xác định và phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen.
Vật liệu, hóa chất và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
PHẦN 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu
Xác định mã vạch ADN cho loài Dó bầu Trung Quốc (Aquilaria simensis) là bước quan trọng trong việc xây dựng cơ sở dữ liệu ADN, hỗ trợ cho công tác giám định loài và quản lý nguồn tài nguyên sinh vật hiệu quả.
Nhân bản đƣợc các đoạn gen rbcL, matK,(trnH-psbA) của loài Dó bầu trung quốc (Aquilaria simensis (Lour) Gilg.)
- Tách chiết, tinh sạch ADN tổng số từ mẫu lá cây Dó bầu trung quốc;
- Nhân bản các đoạn gen matK, (trnH-psbA), rbcL;
- Xác định và phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen
- M u lá được tách chiết PC v tinh sạch tại Ph ng Th nghiệm Công nghệ gen - Viện công nghệ sinh h c m Nghiệp ĐH m Nghiệp
- iải tr nh tự ADN tại Malaysia
2.4 Vật liệu hóa chất v các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu:
Tiến hành lấy hai mẫu lá cây Dó bầu trung quốc (Aquilaria simensis (Lour) Gilg.) tại Quảng Ninh Việt Nam
Aquilaria sinensis HBQN01 Hoành Bồ, Quảng
Aquilaria sinensis TDC01 Tân Dân, Quảng
Hình 2.1Mẫu và kí hiệu mẫu trong nghiên cứu
2.4.2 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:
- chất d ng trong tách chiết ADN tổng số
- Thí nghiệm sử dụng bộ Kit tách chiết ADN tổng số của bằng bộ Kit
"DNA mini kit Qiagen" của Đức
- chất tinh sạch sản ph m C
Thí nghiệm sử dụng bộ Kit tách chiết ADN tổng số của bằng bộ Kit
"DNA mini kit Qiagen" của Đức
Red safe Đệm TAE 1X Đệm màu Loading Dye
2.4.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Nghiên cứu này sử dụng một số thiết bị chính bao gồm: ể ổn nhiệt, cân kỹ thuật điện tử, máy li tâm lạnh, máy voltex, lò vi sóng, thiết bị chạy điện di, máy nhân gen PCR, máy soi gen và các cặp mồi.
Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 hương pháp tách chiết ADN tổng số
Thực hiện tách chiết ADN từ mẫu lá Dó bầu trung quốc bằng bộ Kit
"DNA mini kit Qiagen" của Đức
- Nghiền 100 mg lá bằng nitơ lỏng cho vào ống eppendorf 1,7 mL có trong bộ Kit Thêm 400 l uffer AP1 và 1 l RNAse A;
- Ủ 65 o C trong 10 phút Đảo mẫu 2-3 lần trong quá trình ủ;
- Thờm 130àl Buffer P3, trộn bằng vortex và ủ đỏ trong 5 phỳt;
- Hút dịch nổi chuyển vào cột lọc cột màu tím đƣợc đặt trong ống thu dịch colledtion tube
- Hút dịch qua cột lọc lưu ý kh ng hút cặn) chuyển sang ống 1,7 ml mới
- Thêm 1,5 thể tích buffer AW1 và trộn ngay bằng pipet
- Hỳt 650àl hỗn hợp dịch trờn sang cột ly tõm (màu trắng Ly tõm 8000v/p trong 1 phút và loại bỏ dịch đi cột lọc
(Lặp lại bước trên cho đến khi hết hỗn hợp dịch chiết với AW1)
- Đặt cột ly tâm vào ống thu 2 ml mới
- Thêm 500 l buffer AW2 Để 1 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm 1 phút,
(Kiểm tra màng lọc, nếu bẩn có thể lặp lại bước này thêm 1-2 lần)
- Đặt cột sang ống 1,5 ml mới Ly tâm 1 phút, 13000 vòng để làm khô màng hoàn toàn
- Thờm 50àl AE hoặc nước dion vào chớnh giữa màng Ủ 5 phỳt ở nhiệt độ phòng Ly tâm 1 phút, 8000 vòng
ADN dùng ngay đƣợc bảo quản ở 0C vài ngày ; -20 o C lâu ngày
2.5.2 hương pháp điện di kiểm tra sản ph m ADN sau tách chiết
Sản phẩm ADN sau tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TE ở hiệu điện thế 80V
Để pha gel agarose với nồng độ 0,8%, bạn cần cân 0,8g agarose và hòa tan vào 100ml dung dịch TAE 1X Sử dụng lò vi sóng để đun sôi cho agarose tan hoàn toàn, sau đó để hỗn hợp nguội xuống khoảng 50-60 độ C Tiếp theo, bổ sung Redsafe vào hỗn hợp, trộn đều và đổ vào khay điện di để chuẩn bị cho quá trình điện di.
Trước khi đổ gel, cần lau sạch giấy đổ bằng giấy thấm mềm để hút ẩm, sau đó cài lược Lược tạo giếng được đặt ở phía cực âm của bể điện di, tiến hành cân bằng mặt phẳng của giá bể bằng giọt nước trên giá Sau khi đổ gel và chờ agarose đông, tháo lược ra Đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di, điều chỉnh thể tích TAE cho phù hợp để đặt bản gel vào bể Cuối cùng, đặt bản gel vào bể điện di sao cho dung dịch TAE ngập khoảng 1mm so với bề mặt của bản gel.
Lấy 8 ở mỗi mẫu ADN đã đƣợc tách chiết và trộn với 2 Dye trên bề mặt giấy parafilm Cho cẩn thận hỗn hợp trên vào giếng điện di bằng micropipet Ghi chép lại thứ tự tra các mẫu ADN vào giếng, chạy điện di ở 80V trong 30 phút Quan sát sự dịch chuyển của hỗn hợp mẫu
Sau khi điện di xong, lấy bản gel từ bể soi trực tiếp dưới đèn tia UV
2.5.3 hương pháp nhân gen đích bằng kĩ thuật PCR a Th nh phần phản ứng PC :
Thể tích mỗi phản ứng PCR mỗi mẫu là 50 l
Bảng 1: Tr nh tự v thông tin về c p mồi
Kí hiệu Tên mồi Tr nh tự mồi ( -3 )
Kích thước gen mP1F matK ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC
52 0 C mP1R matK CGTACAGTACTTTTGTGTCGAG 850 trnPF1 trnH CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 50 0 C
25 psbPR1 psbA GTTATGCATGAACGTAATGCTC 450 rP1F rbcL ATGTCACAACAAACAGAGACTAAAGC
Bảng : Th nh phần v nồng độ các chất sử dụng trong một phản ứng
PCR STT Th nh phần Nồng độ Thể t ch ( l)
Bảng 3: Chu k nhiệt cho phản ứng PC mồi matK ƣớc Số chu kì Nhiệt độ o C) Thời gian
Kéo dài 72 1 phút Ổn định 1 72 5 phút ảo quản 4 ∞
Bảng : Chu k nhiệt cho phản ứng PC mồi psbA ƣớc Số chu kì Nhiệt độ o C) Thời gian
Kéo dài 72 1 phút Ổn định 1 72 5 phút ảo quản 4 ∞
Bảng : Chu k nhiệt cho phản ứng PC mồi rbcL
Bước ố chu k Nhiệt độ ( o C) Thời gian
Kéo dài 72 1 phút Ổn định 1 72 5 phút ảo quản 4 ∞ b Các bước tiến h nh:
- ƣớc 1: Cho các thành phần phản ứng PCR Thực hiện ở nhiệt độ thấp
- ƣớc 2: Trộn đều hỗn hợp bằng pipet hoặc máy Vortex
- ước 3: Lập chương trình và chạy PCR trên máy
Chu trình nhiệt: Nhiệt độ gắn mồi thay đổi phụ thuộc vào loại mồi của phản ứng
Sau khi thực hiện PCR để kiểm tra mẫu ADN, tiến hành điện di mẫu trên gel Agarose hòa tan với Redsafe Thêm một giếng chứa marker để xác định độ dài của ADN Chạy điện di ở mức 80V trong 50 phút, sau đó soi dưới ánh sáng UV và chụp lại kết quả.
2.5.4 hương pháp tinh sạch sản ph m PCR và giải trình tự
Sau khi các sản phẩm được khuếch đại, chúng sẽ được tinh sạch bằng bộ kit Prification Kit "DNA mini kit Qiagen" của Đức Quy trình tinh sạch bao gồm các bước cụ thể để đảm bảo chất lượng DNA đạt yêu cầu.
Chuẩn bị mẫu và thực hiện bám dính vào cột
- Thêm 5 lần thể tích inding uffer C vào ống eppendorf chƣa sản phẩm PCR, mix vortex
Chuẩn bị cột spin và ống thu để chuyển mẫu sang cột spin Ly tâm trong 1 phút, lưu ý rằng thể tích tối đa cho cột spin là 750 µl Nếu thể tích mẫu vượt quá giới hạn này, hãy tách mẫu và thực hiện ly tâm thành 2 lần.
- Sau khi ly tâm, loại bỏ dịch
- Thêm 500 l Wash Solution A vào cột, ly tâm 10000v/p trong 1 phút
- Loại bỏ dịch sau ly tâm
- Ly tâm 14000v/p trong 2 phút để loại hoàn toàn dịch cho mẫu
- Chuyển cột spin chứa mẫu sang ống eppendorf 1,7 ml đƣợc cung cấp trong bộ Kit
- Thêm 50 l Elution uffer vào chính giữa cột spin
- Để nguyên ở nhiệt độ phòng trong 1 phút
2.5.5 iện di kết quả tinh sạch Điện di kiểm tra kết quả tinh sạch sản phẩm PCR trên gel agarose 1% với mẫu ADN đƣợc trộn với Loading Dye nhƣ điện di ADN tổng số
Sản phẩm PCR sau tinh sạch đƣợc gửi đi giải trình tự tại Selangor, Malaysia
2.5.7 hương pháp phân tích số liệu
Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại sẽ được gửi đi để đọc trình tự nucleotide Kết quả sẽ được xử lý bằng công cụ Reverse Complement để thu được trình tự đảo chiều và bổ sung với trình tự ADN đọc theo mồi ngược trên phần mềm BioEdit Sau đó, sử dụng công cụ BLAST trên NCBI và phần mềm ioedit để so sánh trình tự nucleotide phân lập với các trình tự gen đã đăng ký trên NCBI.
