Địa điểm thực hiện - TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU- 123docz.net

PHẦN 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.3. Địa điểm thực hiện

- M u lá được tách chiết PC v tinh sạch tại Ph ng Th nghiệm Công nghệ gen - Viện công nghệ sinh h c m Nghiệp ĐH m Nghiệp.

- iải tr nh tự ADN tại Malaysia.

2.4 Vật liệu hóa chất v các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu:

2.4.1 Vật liệu nghiên cứu:

Tiến hành lấy hai mẫu lá cây Dó bầu trung quốc (Aquilaria simensis (Lour) Gilg.) tại Quảng Ninh Việt Nam

Tên m u Tên khoa h c K hiệu m u Địa điểm thu m u

Dó bầu trung quốc (Cây 01)

Aquilaria

sinensis HBQN01

Hồnh Bồ, Quảng Ninh, Việt Nam Dó bầu trung quốc

(Cây 02)

Aquilaria

sinensis TDC01

Tân Dân, Quảng Ninh, Việt Nam

2.4.2 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

- chất d ng trong tách chiết ADN tổng số

- Thí nghiệm sử dụng bộ Kit tách chiết ADN tổng số của bằng bộ Kit "DNA mini kit Qiagen" của Đức.

- chất C

H2O deion. Master Mix Primer

- chất tinh sạch sản ph m C

Thí nghiệm sử dụng bộ Kit tách chiết ADN tổng số của bằng bộ Kit "DNA mini kit Qiagen" của Đức.

- chất điện di

Agarose Red safe Đệm TAE 1X

Đệm màu Loading Dye ADN marker 100bp

2.4.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

- Một số thiết bị chính dc sử dụng trong nghiên cứu này gồm: ể ổn nhiệt, Cân kĩ thuật điện tử, Máy li tâm lạnh, Máy voltex, Lị vi sóng, Thiết bị chạy điện di, Máy nhân gen PCR, Máy soi gen, Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 hương pháp tách chiết ADN tổng số

Thực hiện tách chiết ADN từ mẫu lá Dó bầu trung quốc bằng bộ Kit "DNA mini kit Qiagen" của Đức.

Quy trình tách chiết  Quá trình thủy phân

- Nghiền 100 mg lá bằng nitơ lỏng cho vào ống eppendorf 1,7 mL có trong bộ Kit. Thêm 400 l uffer AP1 và 1 l RNAse A;

- Ủ 65oC trong 10 phút. Đảo mẫu 2-3 lần trong quá trình ủ;

- Thêm 130µl Buffer P3, trộn bằng vortex và ủ đá trong 5 phút;

- Ly tâm 5 phút, 13000 vòng;

- Hút dịch nổi chuyển vào cột lọc cột màu tím đƣợc đặt trong ống thu dịch colledtion tube .

- Ly tâm 13000v/p trong 2 phút.

- Hút dịch qua cột lọc lƣu ý kh ng hút cặn) chuyển sang ống 1,7 ml mới.

- Thêm 1,5 thể tích buffer AW1 và trộn ngay bằng pipet.  Gắn vào cột

- Hút 650µl hỗn hợp dịch trên sang cột ly tâm (màu trắng . Ly tâm 8000v/p trong 1 phút và loại bỏ dịch đi cột lọc.

(Lặp lại bƣớc trên cho đến khi hết hỗn hợp dịch chiết với AW1)  Rửa cột

- Đặt cột ly tâm vào ống thu 2 ml mới

- Thêm 500 l buffer AW2. Để 1 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 1 phút, 8000 vòng.

(Kiểm tra màng lọc, nếu bẩn có thể lặp lại bƣớc này thêm 1-2 lần) - Đặt cột sang ống 1,5 ml mới. Ly tâm 1 phút, 13000 vịng để làm khơ màng hồn tồn.

- Thêm 50µl AE hoặc nƣớc dion vào chính giữa màng. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 1 phút, 8000 vòng.

 ảo quản ADN

ADN dùng ngay đƣợc bảo quản ở 0C vài ngày ; -20o

C lâu ngày .

2.5.2 hương pháp điện di kiểm tra sản ph m ADN sau tách chiết

Sản phẩm ADN sau tách chiết đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TE ở hiệu điện thế 80V.

 Cách tiến hành:

Pha gel agarose với nồng độ 0,8%: cân 0,8g agarose cho vào 100ml dung dịch TAE 1X, đun s i bằng lị vi sóng cho agarose tan thật đều.

Để hỗn hợp giảm nhiệt độ xuống còn 50-600c, bổ sung Redsafe, trộn đều và đổ vào khay điện di.

Trƣớc khi đổ bản gel cần lau sạch giấy đổ bằng giấy thấm mềm dễ hút ẩm sau đó cài lƣợc. lƣợc tạo giếng đƣợc đặt ở phía cực âm của bể điện di, tiến hành cân bằng mặt phẳng của giá bể bằng giọt nƣớc trên giá . đổ gel, chờ agarose đ ng và tháo lƣợc.

Đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di, thể tích TAE cần thay đổi sao cho phù hợp để đặt bản gel vào trong bể.

Đặt bản gel vào bể điện di, dung dịch TAE trong bể sao cho bản gel ngập khoảng 1mm so với bề mặt dung dịch điện di.

Lấy 8 ở mỗi mẫu ADN đã đƣợc tách chiết và trộn với 2 Dye trên bề mặt giấy parafilm. Cho cẩn thận hỗn hợp trên vào giếng điện di bằng micropipet. Ghi chép lại thứ tự tra các mẫu ADN vào giếng, chạy điện di ở 80V trong 30 phút. Quan sát sự dịch chuyển của hỗn hợp mẫu.

Sau khi điện di xong, lấy bản gel từ bể soi trực tiếp dƣới đèn tia UV.

2.5.3 hương pháp nhân gen đích bằng kĩ thuật PCR

a. Th nh phần phản ứng PC :

Thể tích mỗi phản ứng PCR mỗi mẫu là 50 l.

Bảng .1: Tr nh tự v thông tin về c p mồi

Kí hiệu Tên mồi Tr nh tự mồi ( -3 ) Nhiệt độ gắn mồi Kích thước gen mP1F matK ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC 520C 850 mP1R matK CGTACAGTACTTTTGTGTCGAG trnPF1 trnH CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 500C

25 psbPR1 psbA GTTATGCATGAACGTAATGCTC 450 rP1F rbcL ATGTCACAACAAACAGAGACTAAAGC 520C 600 rP1R rbcL GTAAAATCAAGTCCACCRCG Bảng . : Th nh phần v nồng độ các chất sử dụng trong một phản ứng PCR STT Th nh phần Nồng độ Thể t ch ( l) 1 H2O deion 19 2 Master mix 2 X 25 3 Mồi xuôi F 10 pM 2 4 Mồi ngƣợc R 10 pM 2 5 ADN khn 2 Tổng thể tích 50

Bảng .3: Chu k nhiệt cho phản ứng PC mồi matK

ƣớc Số chu kì Nhiệt độ o C) Thời gian Khởi động 1 94 3 phút Tách mạch 40 94 30 giây Gắn mồi 52 30 giây Kéo dài 72 1 phút Ổn định 1 72 5 phút ảo quản 4 ∞

Bảng . : Chu k nhiệt cho phản ứng PC mồi psbA

ƣớc Số chu kì Nhiệt độ o C) Thời gian Khởi động 1 94 3 phút Tách mạch 40 94 30 giây Gắn mồi 50 30 giây Kéo dài 72 1 phút Ổn định 1 72 5 phút ảo quản 4 ∞

Bảng . : Chu k nhiệt cho phản ứng PC mồi rbcL Bước ố chu k Nhiệt độ (o

C) Thời gian Khởi động 1 94 3 phút Tách mạch 40 94 30 giây Gắn mồi 52 30 giây Kéo dài 72 1 phút Ổn định 1 72 5 phút ảo quản 4 ∞ b. Các bước tiến h nh:

- ƣớc 1: Cho các thành phần phản ứng PCR. Thực hiện ở nhiệt độ thấp. - ƣớc 2: Trộn đều hỗn hợp bằng pipet hoặc máy Vortex.

- ƣớc 3: Lập chƣơng trình và chạy PCR trên máy

Chu trình nhiệt: Nhiệt độ gắn mồi thay đổi phụ thuộc vào loại mồi của phản ứng

Sau khi PCR kiểm tra mẫu ADN bằng phƣơng pháp điện di: tra mẫu vào gen Agarose có hịa tan Redsafe trong bể điện di, thêm 1 giếng cho marker để đo độ dài bADN ADN. chạy điện di ở 80V trong 50 phút. Soi UV và chụp kết quả.

2.5.4 hương pháp tinh sạch sản ph m PCR và giải trình tự

Những sản phẩm sau khi dƣợc khuếch đại thành c ng sẽ đƣợc tinh sạch bằng kit Prification Kit "DNA mini kit Qiagen" của Đức. Các bƣớc tinh sạch nhƣ sau:

 Chuẩn bị mẫu và thực hiện bám dính vào cột

- Thêm 5 lần thể tích inding uffer C vào ống eppendorf chƣa sản phẩm PCR, mix vortex.

- Chuẩn bị cột spin kèm ống thu. chuyển mẫu sang cột spin, ly tâm 1 phút lƣu ý thể tích lớn nhất cho cột spin là 750 l, nếu thể tích mẫu vƣợt quá số lƣợng trên, tách làm 2 lần thực hiện .

- Sau khi ly tâm, loại bỏ dịch.  Rửa liên kết ADN

- Thêm 500 l Wash Solution A vào cột, ly tâm 10000v/p trong 1 phút. - Loại bỏ dịch sau ly tâm

- Ly tâm 14000v/p trong 2 phút để loại hoàn toàn dịch cho mẫu.  Tinh sạch ADN

- Chuyển cột spin chứa mẫu sang ống eppendorf 1,7 ml đƣợc cung cấp trong bộ Kit .

- Thêm 50 l Elution uffer vào chính giữa cột spin. - Để nguyên ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.

- Ly tâm 14000v/p trong 2 phút.

2.5.5 iện di kết quả tinh sạch

Điện di kiểm tra kết quả tinh sạch sản phẩm PCR trên gel agarose 1% với mẫu ADN đƣợc trộn với Loading Dye nhƣ điện di ADN tổng số.

2.5.6 Giải trình tự gen

Sản phẩm PCR sau tinh sạch đƣợc gửi đi giải trình tự tại Selangor, Malaysia.

2.5.7 hương pháp phân tích số liệu

Sản phẩm PCR sau khi đƣợc khuếch đại đƣợc gửi đi đọc trình tự Nucleotide. Kết quả đƣợc xử lý bằng công cụ Reverse Complement nhằm thu đƣợc trình tự đảo chiều và bổ sung với trình tự ADN đọc theo mồi ngƣợc trên phần mềm BioEdit, sử dụng công cụ BLAST trên NCBI, phần mềm ioedit để so sánh trình tự nucleotide phân lập đƣợc với trình tự gen đã đăng ký trên NC I.

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số

Hình 3.1: Kết quả điện di ADN tổng số của hai mẫu Dó bầu trung quốc; giếng 1: HBQN01; giếng 2: TDC01

Chất lƣợng của ADN tổng số thu đƣợc độ sạch, độ nguyên vẹn và hàm lƣợng) ảnh hƣởng trực tiếp đến kết quả tiếp theo trong cả quá trình nghiên cứu.

Kết quả thí nghiệm cho thấy cả 2 mẫu tách chiết đều cho băng vạch rõ nét, sáng; ADN thu đƣợc với hàm lƣợng lớn, không bị đứt gãy, khơng có băng phụ.

ADN thu đƣợc đảm bảo hàm lƣợng và chất lƣợng để làm khuôn tổng hợp.

3.2 Kết quả nh n bản gen với các c p mồi nghiên cứu

3.2.1 Kết quả nhân bản gen matK

Gen matK có kích thƣớc khoảng 1.550 bp theo lý thuyết, xuất hiện hầu hết ở các loài thực vật nên đã đƣợc sử dụng nhƣ một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật. Kết quả cho thấy với

hai mẫu nghiên cứu gen matK có kích thƣớc khoảng 850 bp, kh ng có băng

phụ hình 3.2 . Đây là kết quả tốt có thê sử dụng để tiếp tục nghiên cứu

Hình 3.2 Ảnh diện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK từ mẫu ADN Dó bầu trung quốc. M-thang ADN chuẩn 100bp, Giếng 1: HBQN01;

Giếng 2: TDC01. M 1 2

900bp

3.2.2 Kết quả nhân bản gen trnH- psbA

Gen trnH-psbA có kích thƣớc trung bình khoảng 450 bp theo lý thuyết, nhƣng thay đổi từ 296 đến 1120 bp. trnH-psbA có khả năng xác định lồi cao. Kết quả cho thấy với các mẫu nghiên cứu gen trnH-psbA có kích thƣớc vào

khoảng 450 bp, kh ng có băng phụ hình 3.3 . Đây là kết quả tốt có thê sử dụng để tiếp tục nghiên cứu.

Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnH-psbA từ các mẫu ADN Dó bầu trung quốc. M-thang ADN chuẩn 100bp, Giếng 1: HBQN01;

Giếng 2: TDC01.

3.2.3 Kết quả nhân bản gen rbcL

rbcL là trình tự gen nằm trong lục lạp có thể nhân bản một cách dễ

dàng ở nhiều loài thực vật. Ở các lồi khác nhau kích thƣớc của gen này cũng khác nhau, đối với cây dó bầu gen rbcL có kích thƣớc khoảng 750 bp.

Kết quả kiểm tra sản phẩm điện di gen rbcL trên gel agarose 0,8% (hình 3.4) cho thấy gen rbcL đƣợc khuếch đại tốt ở tất cả các mẫu dó bầu

nghiên cứu, các băng thu đƣợc đều sáng và rõ chỉ có một băng vạch duy nhất M 1 2

với kích thƣớc khoảng 600bp (khi so sánh với thang ADN chuẩn 100bp . Đây kết quả tốt tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.4 Ảnh diện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen rbcL từ các mẫu ADN Dó bầu trung quốc. M- thang ADN chuẩn 100bp; Giếng 1: mẫu HBQN01;

Giếng 2 mẫu TDC01.

3.3 Ph n t ch kết quả

3.3.1 Kết quả so sánh đoạn gen matK

A.yunnanensis ----CTGGTTAAAAGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATT HBQN01 -TCGCTGCTGGTAAGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATT TDC01 TTCGCTGCTGGTAAGATGCCTCTTTTTTGCATTTATTACGGTTTTTTTTCTACGAGTATT *** * ************************************************ A.yunnanensis TGAATTTGAAGAGTCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAA HBQN01 TGAATTTGAAGAGTCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAA TDC01 TGAATTTGAAGAGTCTTATTACTTCAAAGAAATCCATTTCTATTTTGAATTTGAATCCAA ************************************************************ A.yunnanensis GATTCTTTTTTTTCCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTC HBQN01 GATTCTTTTTTTTCCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTC TDC01 GATTCTTTTTTTTCCTATATAATTCTCATATATGTGAGTGCGAATTCATTTTCCTTTTTC ************************************************************ M 1 2 600bp

32 A.yunnanensis TCCGTAACCAATCCTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCT HBQN01 TCCGTAACCAATCCTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCT TDC01 TCCGTAACCAATCCTATCATTTACGATCAACATCTTCTGCAATCTTTCTTGAACGGATCT ************************************************************ A.yunnanensis ATTTCTATGGAAAAATCGAACATCTTGTAGAAGTTTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACC HBQN01 ATTTCTATGGAAAAATCGAACATCTTGTAGAAGTTTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACC TDC01 ATTTCTATGGAAAAATCGAACATCTTGTAGAAGTTTTTTCTAATGATTTTCAGAACAACC ************************************************************ A.yunnanensis TATCCTTGTTCAAGGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTG HBQN01 TATCCTTGTTCAAGGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTG TDC01 TATCCTTGTTCAAGGATCCCTTCATACATTTTGTTAGATATCAAGGAAAATCTATTCTTG ************************************************************ A.yunnanensis CTTCAAACGATACGCCTCTTATGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGC HBQN01 CTTCAAACGATACGCCTCTTATGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGC TDC01 CTTCAAACGATACGCCTCTTATGATGAATAAGTGGAAATATTACTTTATCAATTTATGGC ************************************************************ A.yunnanensis AATATCATTTTTATGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAAT HBQN01 AATATCATTTTTATGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAAT TDC01 AATATCATTTTTATGTGTGGTCTCAATCAGGAGGGGTCCGTATAAACCAATTATGCAAAT ************************************************************ A.yunnanensis ATTCTCTTGACTTTCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCA HBQN01 ATTCTCTTGACTTTCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCA TDC01 ATTCTCTTGACTTTCTAGGCTATCTTTCAAATGTGCGATTAAATCCTTCAGTGGTACGCA ************************************************************ A.yunnanensis GTCAAATGCTAGAAAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAA HBQN01 GTCAAATGCTAGAAAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAA TDC01 GTCAAATGCTAGAAAACTTCTTTCTAATAGATAATACTATTAAAAAGCTAGATACAAAAA ************************************************************ A.yunnanensis TGCCAATGATTTCTCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTC HBQN01 TGCCAATGATTTCTCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTC TDC01 TGCCAATGATTTCTCTGATTGGATCATTGTCTAAAGCGAATTTTTGTAACGCATCGTGTC ************************************************************ A.yunnanensis ATCCTATTAGTAAGCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTT HBQN01 ATCCTATTAGTAAGCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTT TDC01 ATCCTATTAGTAAGCCAACTTGGGTCGATTCATCAGATTCTGATATTATCGACCGATTTT ************************************************************

33 A.yunnanensis TGCGTATATGCAGAAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGT HBQN01 TGCGTATATGCAGAAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGT TDC01 TGCGTATATGCAGAAATTTTTCTCATTATCACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGGGTTTGT ************************************************************ A.yunnanensis ATCGAATAAAATATATACTTCGGCTTTCTTGTCTTA HBQN01 ATCGAATAAAATATATAC-TCGGCT------TCTT- TDC01 ATCGAATAAAATATATAC-TCGGCT------TCTTC ****************** ****** ****

Đoạn gen có trình tự 815bp phù hợp với độ dài lý thuyết, so sánh 2 mẫu với loài Aquilaria yunnanesis trên Ngân hàng gen có độ tƣơng đồng cao tới 98,1% và có 16 vị trí sai khác, trong đó 4 nucleotide ở vị trí đầu tiên, vị trí nucleotide số 8, 10, 11, 12, 798, 805, 806, 807, 808, 809, 810và 815. Vị trí: 1,2,3,4 do lồi Aquilaria yunnanensis khuyết. Vị trí 8 Aquilaria yunnanensis

là nucleotide loại G, 2 mẫu nghiên cứu là nucleotide loại C. Vị trí 798, 805, 806, 807, 808, 809, 810: 2 mẫu nghiên cứu đều khuyết thiếu. Vị trí 815: Mẫu HBQN01 khuyết, TDC02 nucleotide loại C, loài Aquilaria yunnanensis có

nucleotide loại A. Kết quả trên cho thấy trình tự sai khác thƣờng xuất hiện ở đầu và cuối các đoạn gen nên chƣa thể đƣa ra kết luận. Trình tự sai khác có thể xuất phát từ sai xót từ q trình giải trình tự gen, hoặc do sai khác bắt nguồn từ mẫu nghiên cứu.

3.3.2 Kết quả so sánh đoạn gen trnH-psbA

TDC01 TCCA A.sinensis TCCA A.yunnanensis TCCA HBQN01 TCCA **** TDC01 CTTTTATCGAATATTAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGA A.sinensis CTTTTAT-GAATATTAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGA A.yunnanensis CTTTTAT-GAATATTAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGA HBQN01 CTTTTAT-GAATATTAGTCTATTTTTTCACTTTCATTTAAAACAGTAAAAGAAAATAAGA ******* **************************************************** TDC01 ACTTCACAAAAGATTGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAG A.sinensis ACTTCACAAAAGATTGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAG

34 A.yunnanensis ACTTCACAAAAGATTGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAG HBQN01 ACTTCACAAAAGATTGGTAAGGACTAATTTAAGGTATGATACTAAACCAAACTCATTAAG ************************************************************ TDC01 ACCACCTTTTCCTATTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGT A.sinensis ACCACCTTTTCCTATTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGT A.yunnanensis ACCACCTTTTCCTATTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGT HBQN01 ACCACCTTTTCCTATTTTGTTATAGTAAAGTTGAGTTAAGGTAAAGAAAAAAACCTAAGT ************************************************************ TDC01 AAATAAAAGACTACTAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAA A.sinensis AAATAAAAGACTACTAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAA A.yunnanensis AAATAAAAGACTACTAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAA HBQN01 AAATAAAAGACTACTAAAAGAAATAAAGGAGCAATACCAATCCTCTTGGGAATGGTAAAA ************************************************************ TDC01 CAAGAAATTGGTTATTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACA A.sinensis CAAGAAATTGGTTATTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACA A.yunnanensis CAAGAAATTGGTTATTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACA HBQN01 CAAGAAATTGGTTATTGCCCCTTTACTTTTTTTCCTTTCAAAAAATCATATACA ******************************************************

Đoạn gen có trình tự 389-392bp phù hợp với độ dài lý thuyết, so sánh 2 mẫu với 2 loài Aquilaria yunnanensis, Aquilaria sinensis trên ngân hàng gen có độ tƣơng đồng cao 99,97% và có 1 điểm sai khác ở vị trí 12. Tại vị trí sai khác tại mẫu TDC01 có thêm nucleotide loại C, các loài khác và mẫu HBQN01 là trình tự khuyết.

3.3.3 Kết quả so sánh với đoạn gen rbcL

HBQN01 ATGTCACCCCCAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGAGTA TDC01 ATGTCACCCCCAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGAGTA sinensis1 ATGTCA-CCACAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGAGTA crassna ATGTCA-CCACAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAGGCTGGTGTTAAAGAGTA sinensis2 ATGTCA-CCACAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGAGTA malaccensis ATGTCA-CCACAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGAGTA ****** ** ******************************** ***************** HBQN01 TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT TDC01 TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT sinensis1 TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT

35 crassna TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT sinensis2 TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT malaccensis TAAATTGACTTATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT ************************************************************ HBQN01 CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA TDC01 CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA sinensis1 CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA crassna CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA sinensis2 CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA malaccensis CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGA ************************************************************ HBQN01 ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA TDC01 ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA sinensis1 ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA crassna ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA sinensis2 ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA malaccensis ATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGACGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTA ************************************************************ HBQN01 CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA TDC01 CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA sinensis1 CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA crassna CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA sinensis2 CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA malaccensis CAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAAGAAAATCAATATATATGTTA ************************************************************ HBQN01 TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT TDC01 TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT sinensis1 TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT crassna TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT sinensis2 TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT malaccensis TGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCAT ************************************************************ HBQN01 TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT TDC01 TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT sinensis1 TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT crassna TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT sinensis2 TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT malaccensis TGTTGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAAGATCTGCGAAT ************************************************************

36 HBQN01 CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA TDC01 CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA sinensis1 CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA crassna CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA sinensis2 CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA malaccensis CCCTACTTCTTATATTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGA ************************************************************ HBQN01 TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT TDC01 TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT sinensis1 TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT crassna TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT sinensis2 TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT malaccensis TAAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTT ************************************************************ HBQN01 ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGTGGTGGATTGGAATTTTA TDC01 ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGTGGTGGATTGGAATTTTA sinensis1 ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGAGGTGGACTTGATTTTAC crassna ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGTGGTGGACTTGATTTTAC sinensis2 ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGTGGTGGACTTGATTTTAC malaccensis ATCCGCTAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTACGTGGTGGACTTGATTTTAC ****************************************** ****** * ** ***

Đọan gen có độ dài 599bp phù hợp với độ dài lý thuyết, so sánh với

Aquilaria sinensis, Aquilaria crassna và Aquilaria malaccensis có độ tƣơng đồng cao 99%, trong đó H QN01 có độ tƣơng đồng 100%. Các vị trí sai khác của 2 mẫu với các lồi ở vị trí 7, 10, 43, 582, 589, 591, 594, 598 và 599.Vị trí số 7: 2 mẫu HBQN01 và TDC01 nucleotide loại C, các lồi cịn lại khuyết.Vị trí số 10: 2 mẫu HBQN01 và TDC01 nucleotide loại C, các lồi cịn lại nucleotide loại A. Vị trí 43: có sự sai khác Aquilaria crassna là nucleotide loại G, tất cả các loài so sánh cùng với mẫu là nucleotide loại A. Vị trí 582: sai khác nucleotide loại A của loài Aquilatia sinensis KY927292.1, tất cả các loài so sánh cùng với mẫu là nucleotide loại T. Vị trí 589, 591, 594, 598 và 599: chỉ có 2 mẫu HBQN01 và TDC01 có trình tự giống nhau và khác so với các lồi Aquilaria đem so sánh.

Từ kết quả trên cho thấy các vị trí sai khác thƣờng nằm ở đầu và kết thúc các đoạn gen, chƣa nhận định đƣợc chính xác điểm sai khác do đoạn gen nghiên