Các kỹ thuật chủ yêu trong phan tich axit nucleic
-Cac phuong phap tach chiét DNA, RNA -Cac phuong phap phan tich DNA
1) Kỹ thuật PCR và nhóm phương pháp phụ thuộc
PCR
Trang 2Tach chiét, dinh lwong va dinh tinh axit nucleic Yêu cầu:
-DNA đảm bảo độ tinh khiết
-Đảm bảo LAO LG về cau tric dé thực hiện các bước
nghiên cứu tiêp Các bước chính:
S0 0/00/00 hÄẠy: ligu ban đầu) giải phóng các DNA/RNA: cơ hoc, nito long, chat tay (SDS) là phân tử lưỡng cực cg hợp với protein màng và photpholipid làm phá vỡ màng tê bào và nhân
-Bồ sung các chất chống các chất hoạt hóa enzyme DNAase và làm biên tính các phân tử protein, các chât hữu cơ
-Tách DNA khỏi các tạp chất khác
Trang 3Quy trinh chung:
1 Phá vỡ tế bào:
- Nghiền mẫu trong nito lỏng thành bột mịn -Xử lý mẫu trong đệm CTAB ở 55-65 C 2 Loại bỏ protein và photpholipid:
-Ly tâm loại cặn, thu dịch nôi
-Xu ly voi chloroform:isoamil -Ly tam loai bo cac protein 3 Thu nhan DNA:
-Tia DNA bang isopropanol or ethanol
-Ly tam thu tia DNA và rửa lại bang ethanol 70% -Hòa tan DNA trong TE or nước cất
Trang 4Vai trò một số chất thông dụng:
-Nito lỏng: làm cho màng (thành) tế bào cứng, giòn, dễ vỡ Hạn chế hoạt động của các enzyme phá hủy nucleotide
-EDTA: Hạn chế các enzyme phân hủy nội bào vì sự liên kết các 1on liên quan quá trình xúc tác thủy phân DNA (ion hóa trị 2 Mg,
Ca, )
-Tris: điều chỉnh pH, tránh sự đứt gãy DNA trong môi trường kiềm or acid
-CTAB (cetryl ammonium bromide): loai bo polysacaride hoa tan DNA cao, hiệu quả cao ở 55-65 C
-Chloroform: làm biến tính protein và loại bỏ liên kết DNA-CTAB -Ethanol (2:1): tủa DNA trong điêu kiện có luc ion, nong d6 mudi cao
- isopropanol (2:1) tủa DNA trong điều kiện không có muối, loại bỏ RNA, DNA đứt gãy
-RNAse: loại bó RNA, Dnase: loại bỏ DNA
Trang 51.1 Phuong phap tach chiét ADN
-DNA co kích thước lớn do đó cần tránh các tách
nhân gây đứt gãy
- DNA genome (BV, TV) sau khi tách chiết phải có
kích thước lớn (15kb-300kb)
- Phương pháp tách chiết cơ bản gồm 4 bước:
> Bước 1 Phá vở màng tế bào và màng nhân Ở tế bao BV hoặc TV, bằng cách nghiền tế bào hoặc mô
Trang 6> Bước 2 Loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu, như các protein, polysaccharide Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol:
chloroform: isoamine tỉ lệ 25:24:1), lắc mạnh cho
Trang 7Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha: + Pha trên cùng là pha nước chứa DNA, RNA
+ Pha giữa là pha chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa
Trang 8> Bước 3 Tủa axit nucleic
+ Tủa bằng ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở
-20°C trong 30 phút hoặc ở 0°C qua đêm Hâu như toàn bộ các phân tử axít nucleic déu két tua
+ Tủa bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1) ở 0°C, các phan tử DNA có trọng lượng phân tử thâp không bị kết tủa
>>> Sau đó ly tâm ta sẽ thu được cặn (DNA, RNA), cặn được rửa bằng cồn 70% để loại bỏ muối và isopropanol
còn lại
> Bước 4 Hoà tan căn (DNA, RNA) và xử ly loại bỏ
Trang 91.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số và mRNA
- Chú ý:
+ Phân tử RNA không bên, dễ bị phân huỷ bởi
enzyme Rnase
+ Rnase lại có mặt khắp nơi (ở đầu ngón tay, trong
nước bọt, trong không khí )
+ Rnase là một enzyme có hoạt tính cao, bền nhiệt
Do đó: Thao tác tách chiết ATA tốt nhất là ở điều
Trang 10Phương pháp tách chiết RNA tông số và mRNA
Tách RNA tổng số: tương tự 3 bước khi tách chiết DNA Ngoại trừ:
-Tránh sự đễ phân hủy của RNA bởi enzyme RNase,tất cả các dung
dịch và dụng cụ thí nghiệm được xử lý DEPC và khử trùng ở nhiệt độ
cao
-Cần thận các thao tác tránh sự nhiễm Rnase từ môi trường
-Nghién mẫu trong chất tây mạnh (SDS, sarcosyl), chất gây biến tính (guamidium thiocyanate), chất khử (mercaptoethanol) để ức chế Rnase
nội bào và tách protein liên kết
-Loại bỏ DNA bằng Dnase Tỉnh sạch mRNA:
-rRNA (80-85%); tRNA(15-20%),mRNA(1-5%), snRNA(<1%) -Tach mRNA bang dudi polyA (~100A): sac ký ái lực trên cột (or bề
Trang 11- Dựa vào phân tử mRNA có đuôi poly A
- Do đó sau khi tách chiết được RNA toàn phần, cho qua cột
sắc ký ái lực (oligod T-cellulose hoặc các viên bi từ gắn đoạn oligod T)
- mRNA có đuôi poly A sẽ tiên kết bổ sung với đoạn oligod T
- Dùng dung dịch rửa cột, các rRNA, tRNA sẽ bị rửa trôi chỉ còn mERNA được giữ lại
- Sau đó dùng dd có nồng độ muối thấp rửa cột hoặc li tâm
Trang 121 TTTT #rrr 5S — Ter s TTrTT tRNA - -
rRNA Oligo-dT matrix
Trang 132 Các phương pháp phân tích định tính va
định lượng axít nucleic
2.1 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế
-Các axit nucleic trong dung dịch sẽ hấp thụ ánh sáng tia cực tim
(UV) trong dải từ 210 nm đến 300 nm với độ hấp thụ cực đại ở 260 nm
-Vì các DNA và RNA và các nucleotide cùng có độ hap thu cuc
Trang 152.2 Phan tich dinh tinh bang Phuong phap dién di
Nguyên tắc của điện di:
- Dựa vào đặc tính phân tử (DNA, RNA) mang điện tích âm DNA được phân tách Power source băng phương pháp điện di dựa trên điện tích é và phan tt luong cua chinh no Ethidium
bromide (EtBr) liên kết vào các phân tử DNA
or Cloth wick và khi được kích thích bằng ánh sáng UV sẽ
solution X4
Elecite, ES ¬ phát huỳnh quang da cam Do lượng tee quang tỉ lệ với lượng DNA ro sô, nên sô lượng DNA có trong mẫu có thê được ước tính bằng cách so sánh huỳnh quang được tạo ra bởi mẫu chưa biết với một dãy định lượng
chuẩn Đề định lượng chính xác hơn N ST
lượng DNA thì RNA phải được loại bỏ bằng
Trang 16- Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào:
+ Điện tích, kích thước và cấu trúc không gian của phân tử
+ Nồng độ của chất cấu thành gel
- Gel sau khi điện di được nhuộm với chất ethidium
Trang 18Có 2 loại gel sử dụng điện di:
+ Gel - dùng điện di axít nucleic
+ Gel polyacrylamide dung dé điện di axit nucleic và protein
- Việc chọn loại gel và nồng độ gel tuỳ thuộc vào kích
Trang 19Kiém tra bang điện di: So sánh với mẫu chuẫn dé
kiểm tra nồng độ (tương đối)
- agarose 0,8-1,5% và nhuộm gel bằng EtB
Trang 22after staining