NGÔ GIAO THÔNG NGHIÊN cứu xây DỰNG và ỨNG DỤNG TƯƠNG QUAN GIẢI PHÓNG IN VITRO ở điều KIỆN dài hạn và cấp tốc của VI cầu LEUPROLID ACETAT GIẢI PHÓNG kéo dài KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ GIAO THÔNG Mã sinh viên: 1701548 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG TƯƠNG QUAN GIẢI PHÓNG IN VITRO Ở ĐIỀU KIỆN DÀI HẠN VÀ CẤP TỐC CỦA VI CẦU LEUPROLID ACETAT GIẢI PHÓNG KÉO DÀI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Trần Thị Hải Yến TS Nguyễn Trần Linh Nơi thực hiện: Bộ môn Bào Chế HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến: PGS TS Trần Thị Hải Yến Đã tận tâm dẫn, hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian nghiên cứu, thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Trần Linh quan tâm dẫn giúp đỡ em suốt thời gian nghiên cứu, thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô, anh chị kĩ thuật viên Bộ mơn Bào chế, Bộ mơn Hóa phân tích, Bộ mơn Cơng nghiệp Dược, Bộ mơn Vật lý – Hóa lý hết lòng quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn quý thầy Ban giám hiệu nhà trường, phịng ban cán nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội, người tạo điều kiện cho em học tập tiếp thu kiến thức suốt năm qua Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, tập thể sinh viên đồng hành, giúp đỡ em suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên khóa 72 Ngơ Giao Thơng MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan leuprolid acetat 2 1.1.1 Cơng thức hóa học 1.1.2 Tính chất vật lý, hóa học 1.1.3 Độ ổn định 2 1.1.4 Ứng dụng điều trị 1.2 Tổng quan q trình giải phóng dược chất khỏi cốt PLGA 3 1.3 Mơ hình hóa q trình giải phóng dược chất in vitro từ dạng bào chế 1.3.1 Phương pháp khơng phụ thuộc mơ hình 1.3.2 Phương pháp phụ thuộc mơ hình 1.4 Ứng dụng tương quan giải phóng in vitro điều kiện dài hạn điều kiện cấp tốc 11 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị sử dụng 12 2.1.1 Nguyên vật liệu 12 2.1.2 Thiết bị 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp bào chế vi cầu PLGA-LA 2.3.2 Đo kích thước vi cầu 2.3.3 Chụp hình thái bề mặt vi cầu 2.3.4 Phương pháp thử giải phóng dược chất in vitro dài hạn 2.3.5 Phương pháp thử giải phóng dược chất in vitro cấp tốc 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 13 13 14 14 16 16 16 18 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 21 3.1 Xây dựng tương quan giải phóng dược chất in vitro điều kiện dài hạn với điều kiện cấp tốc 21 3.1.1 Mơ hình hóa q trình giải phóng dược chất từ vi cầu 21 3.1.2 Thiết lập mối tương quan mức độ giải phóng dược chất in vitro điều kiện dài hạn - cấp tốc 24 3.2 Ứng dụng tương quan giải phóng dài hạn – cấp tốc khảo sát cơng thức vi cầu 32 3.2.1 Thử giải phóng dài hạn dự đốn kết thử giải phóng cấp tốc vi cầu đối chiếu 32 3.2.2 Bào chế khảo sát công thức vi cầu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 33 41 DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Tên viết tắt DCM Dicloromethan DMSO Dung môi dimethyl sulfoxid L/G Lactic acid/Glycolic acid KTTP Kích thước tiểu phân LA Leuprolid acetat N/D Nước/Dầu N/D/N Nước/Dầu/Nước PLGA Poly acid lactic-co-glycolic PLGA-LA Vi cầu PLGA chứa dược chất leuprolid acetat kl/kl Khối lượng/khối lượng kl/tt Khối lượng/thể tích PVA Poly vinyl alcohol HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High-performance liquid chromatography) DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential scanning calorimetry) SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope) DĐVN Dược điển Việt Nam GnRH Hormon giải phóng gonadotropin (Gonadotropin release hormon) FSH Hormon kích thích nang trứng phát triển (Follicle-stimulating hormone) LH Hormon làm noãn trưởng thành (Luteinizing hormone) NSX Nhà sản xuất EP Dược điển châu Âu DĐVN V Dược điển Việt Nam V TKPT Tinh khiết phân tích TKHH Tinh khiết hóa học PBS Đệm phosphat saline pH 7,4 PBS-T Đệm phosphat saline pH 7,4 chứa 0,02% Tween 80 PBS-TN Đệm phosphat saline pH 7,4 chứa 0,02% Tween 80 0,02% natri diazid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Cơ chế giải phóng dược chất pha nghiên cứu Bảng 1.2 Cơ chế giải phóng dược chất từ hệ polyme theo tham số mũ Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng nghiên cứu 12 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 13 Bảng 2.3 Công thức bào chế vi cầu PLGA-LA 14 Bảng 3.1 Khớp mơ hình tốn học dựa liệu giải phóng dài hạn 23 Bảng 3.2 Khớp mơ hình tốn học dựa liệu giải phóng cấp tốc 25 Bảng 3.3 Xác định thời điểm đạt mức % dược chất giải phóng 26 Bảng 3.4 Tính tốn số kết dựa phương trình mơ hình giải phóng phương trình tương quan thời gian giải phóng dài hạn-cấp tốc 30 Bảng 3.5 Khớp mơ hình dự đốn số kết giải phóng cấp tốc .33 Bảng 3.6 Thành phần PLGA công thức vi cầu (1) .33 Bảng 3.7 Kết so sánh mẫu M1, M2, M3 với M0 35 Bảng 3.8 Thành phần PLGA công thức vi cầu (2) .36 Bảng 3.9 Kết so sánh mẫu M1, M4, M5 với M0 37 Bảng 3.10 Thành phần PLGA công thức vi cầu (3) 38 Bảng 3.11 Kết so sánh mẫu M1, M6, M7, M8 với M0 39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Công thức phân tử leuprolid acetat Hình 1.2 Các trình hóa lý xảy bên vi cầu dẫn đến giải phóng dược chất Hình 2.1 Sơ đồ bào chế vi cầu PLGA-LA đông khô 15 Hình 3.1 Đồ thị giải phóng điều kiện dài hạn mẫu M1 M2 (n=3, TB±SD) 21 Hình 3.2 Pha giải phóng ổn định (điều kiện dài hạn) mẫu M1 M2 22 Hình 3.3 Đồ thị giải phóng điều kiện cấp tốc mẫu M1 M2 (n=3, TB±SD) 24 Hình 3.4 Phương trình hóa học thủy phân PLGA 25 Hình 3.5 Phương trình tương quan thời gian giải phóng dài hạn – cấp tốc 28 Hình 3.6 Mối liên hệ liệu giải phóng dài hạn cấp tốc 29 Hình 3.7 Phương trình tương quan % dược chất giải phóng điều kiện dài hạn – cấp tốc 31 Hình 3.8 Đồ thị giải phóng dài hạn dự đốn giải phóng cấp tốc 32 Hình 3.9 Ảnh hưởng phối hợp loại PLGA đến khả giải phóng (n=3, TB±SD) 34 Hình 3.10 Ảnh hưởng tỉ lệ loại PLGA đến khả giải phóng 37 Hình 3.11 Ảnh hưởng chất tạo lỗ xốp đến khả giải phóng (n=3, TB±SD) 39 Hình 3.12 Đường giải phóng cấp tốc mẫu M0, M7, M8 vẽ đồ thị 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Leuprolid acetat (LA) nonapeptid tổng hợp, có cấu trúc tương tự với hormon giải phóng gonadotropin nội sinh (GnRH), dùng để điều trị bệnh liên quan đến hormon dậy sớm phụ thuộc gonadotropin, ung thư tuyến tiền liệt giai đoạn muộn, ung thư vú, u trơn tử cung [29], [36], [38] LA có thời gian bán thải tương đối ngắn, bào chế dạng thuốc tiêm giải phóng phải dùng hàng ngày Trong đó, thời gian điều trị bệnh liên quan đến hormon thường kéo dài từ vài tháng đến vài năm Vì vậy, để đảm bảo tuân thủ điều trị bệnh nhân, việc bào chế thuốc tiêm giải phóng kéo dài vơ cần thiết Trên giới, số công ty thành công việc sản xuất thuốc tiêm giải phóng kéo dài chứa LA nạp vi cầu poly acid lactic-co-glycolic (PLGA) số lượng sản phẩm nhập vào Việt Nam hạn chế Với việc tăng cường sử dụng vi cầu PLGA nạp dược chất LA (PLGA-LA) đường tiêm để kéo dài thời gian tác dụng, nhiệm vụ đánh giá giải phóng dược chất từ dạng bào chế trở thành khía cạnh quan trọng nghiên cứu - phát triển cơng thức thuốc Tuy nhiên, q trình đánh giá giải phóng dược chất từ vi cầu điều kiện in vivo in vitro dài hạn vừa tốn thời gian vừa tốn kém, đặc biệt giai đoạn xây dựng cơng thức thuốc kiểm sốt chất lượng sản phẩm lưu hành thị trường Một phương pháp đáng tin cậy để đánh giá, dự đoán trình giải phóng dược chất từ vi cầu thời gian ngắn giúp tiết kiệm chi phí Ngồi ra, phương pháp phải đơn giản, lặp lại điều kiện nghiên cứu áp dụng cho công thức vi cầu phân hủy sinh học Điều nêu rõ “Hướng dẫn thử hòa tan/giải phóng in vitro dạng bào chế mới/đặc biệt” Hiệp hội nhà khoa học dược phẩm Hoa Kỳ/Liên đoàn dược phẩm quốc tế (AAPS/FIP) [35] Trước đây, trường Đại học Dược Hà Nội, nhóm nghiên cứu bào chế thành công đánh giá số đặc tính vi cầu PLGA-LA [1], [2], [3], [4], [5] Tuy nhiên, việc đánh giá khả giải phóng dược chất in vitro từ vi cầu điều kiện dài hạn điều kiện cấp tốc chưa thực đầy đủ Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây dựng ứng dụng tương quan giải phóng in vitro điều kiện dài hạn cấp tốc vi cầu leuprolid acetat giải phóng kéo dài” với mục tiêu sau: Mơ hình hóa q trình giải phóng leuprolid acetat in vitro từ vi cầu PLGA Thiết lập mối tương quan mức độ giải phóng dược chất in vitro điều kiện dài hạn với điều kiện cấp tốc Ứng dụng mối tương nghiên cứu xây dựng công thức bào chế vi cầu leuprolid acetat đơng khơ giải phóng kéo dài CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan leuprolid acetat 1.1.1 Cơng thức hóa học Hình 1.1 Công thức phân tử leuprolid acetat - Công thức phân tử: C59H84N16O12.C2H4O2 - Khối lượng phân tử: 1269,45 g/mol - Danh pháp IUPAC: 5-oxo-L-prolyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosylD-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-N-ethyl-L-prolinamid acetat - Công thức viết tắt: pGlu1-His2-Trp3-Ser4-Tyr5-Leu6-Leu7-Arg8-Pro9NHEt.CH3COOH - Tên chung quốc tế: leuprolid acetat 1.1.2 Tính chất vật lý, hóa học ➢ Tính chất vật lý - Cảm quan: bột kết tinh màu trắng vàng, dễ hút ẩm - Độ tan: tan tốt nước, acid acetic DMSO (100 mg/ml, 25oC) - Nhiệt độ nóng chảy: 150-155oC ➢ Tính chất hóa học [30] Trong môi trường nước, leuprolid acetat bị phân hủy theo đường: - Thủy phân: phân cắt đầu N – đuôi C pGlu1, His2, Trp3, Ser4, Tyr5, Leu6, Leu7; khử hóa-β Ser4; acetyl hóa Ser4, Tyr5, Leu6; đóng vịng His2 Trp3 - D, L-Isomer hóa His2, Trp3, Ser4, Tyr5, Leu6, Leu7 - Oxy hóa Trp3 1.1.3 Độ ổn định Năm 2016, Mehdi Rahimi cộng nghiên cứu độ ổn định LA môi trường nước điều kiện khác [30] Kết thu sau: - Ảnh hưởng pH: nghiên cứu độ ổn định LA nhiệt độ 37ºC mơi trường đệm phosphat có pH từ - 7,4 , nhóm tác giả nhận thấy có suy giảm đáng kể nồng độ LA pH 2, 3, dược chất LA có độ ổn định cao pH 7,4 - Ảnh hưởng nhiệt độ: hòa tan leuprolid acetat dung dịch đệm phosphat pH 7,4, sau bảo quản nhiệt độ khác (-10ºC, 4ºC, 25ºC, 37ºC) thời gian 35 ngày Kết cho thấy dung dịch LA bảo quản 4ºC có độ ổn định cao - Ảnh hưởng oxy dung dịch: hòa tan LA dung dịch đệm phosphat có/khơng loại oxy, sau bảo quản 35 ngày Kết quả: 4ºC, việc dùng nước loại oxy giúp làm tăng ổn định dung dịch LA 1.1.4 Ứng dụng điều trị Leuprolid nonapeptid tổng hợp, tương tự hormon giải phóng gonadotropin nội sinh (GnRH) Tuy nhiên, leuprolid có hoạt tính chủ vận mạnh GnRH có lực cao với thụ thể GnRH Nhờ có acid amin D cấu trúc hóa học (Hình 1.1) mà độ ổn định sinh học leuprolid tăng lên đáng kể [36], dẫn đến thời gian bán hủy leuprolid dài GnRH (thời gian bán hủy leuprolid khoảng giờ, thời gian bán hủy GnRH nội sinh - phút) [38] Leuprolid chủ yếu sử dụng dạng muối acetat Sinh khả dụng leuprolid acetat qua đường tiêm tĩnh mạch đường tiêm da tương đương [36] Về chế tác dụng, leuprolid acetat thúc đẩy tiết tuyến yên, làm tăng mạnh nồng độ LH FSH huyết thanh, dẫn đến làm tăng nồng độ hormon sinh dục vòng ngày kể từ ngày sử dụng leuprolid acetat Tuy nhiên, việc kích thích liên tục vào tuyến yên cách sử dụng leuprolid acetat liều điều trị dẫn đến q trình điều hịa ngược âm tính, làm ức chế hoạt động tuyến yên, ức chế tiết LH FSH, làm giảm nồng độ hormon sinh dục máu vịng - tuần Đây sở cho ứng dụng lâm sàng leuprolid acetat sản phụ khoa ung thư học [38] Chỉ định leuprolid acetat: dậy sớm phụ thuộc gonadotropin, ung thư tuyến tiền liệt giai đoạn muộn, ung thư vú giai đoạn muộn phụ nữ sau mãn kinh, bệnh lạc nội mạc tử cung, u trơn tử cung [29], [36] 1.2 Tổng quan q trình giải phóng dược chất khỏi cốt PLGA Các chế giúp giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA bao gồm [17]: a) Khuếch tán qua hệ thống lỗ xốp: chế giải phóng dược chất chủ yếu Q trình phụ thuộc vào độ xốp vi cầu tốc độ hình thành đóng lỗ xốp b) Khuếch tán qua mạng lưới polyme: chế thường gặp dược chất kỵ nước Tốc độ trình phụ thuộc vào tính linh động chuỗi polyme Khả khuếch tán dược chất tăng lên polyme chuyển từ trạng thái thủy tinh sang trạng thái lỏng nhớt c) Bơm thẩm thấu: chế xuất vi cầu tiếp xúc với mơi trường giải phóng, hấp thu nước làm tăng áp suất thẩm thấu thúc đẩy vận chuyển dược chất từ lòng vi cầu ngồi mơi trường Khảo sát tỉ lệ loại polyme PLGA công thức Tiến hành bào chế vi cầu với công thức bảng 2.3, thành phần polyme PLGA bảng 3.8 quy trình mục 2.3.1 Kết thử giải phóng thể hình 3.10 phụ lục 3.3 Bảng 3.8 Thành phần PLGA công thức vi cầu (2) Tỉ lệ loại PLGA Mẫu PLGA (L/G=50:50) 7-17 kDa PLGA (L/G=50:50) 24-38 kDa M4 M1 M5 *Nhận xét: Theo hình 3.10 phụ lục 3.3, so sánh lượng dược chất giải phóng pha giải phóng ạt, mẫu M5 cao (32,28%), sau đến M1 (29,27%), cuối M4 (16,54%) Điều cho thấy, tăng tỉ lệ polyme PLGA (L/G=50:50) 7-17 kDa, lượng dược chất giải phóng pha giải phóng ạt tăng theo Có thể giải thích tượng thơng qua nhiệt độ chuyển kính PLGA Theo kết đo DSC từ nghiên cứu trước nhóm, PLGA (50:50) 7-17 kDa có nhiệt độ chuyển kính thấp PLGA (50:50) 24-38 kDa [2] Càng tăng tỉ lệ PLGA phân tử lượng thấp, nhiệt độ chuyển kính vi cầu giảm thấp nhiệt độ mơi trường thử giải phóng, thời gian chuyển từ trạng thái “thủy tinh” sang trạng thái “nhớt” rút ngắn, tính linh động mạng lưới polyme tăng lên dẫn đến tăng đáng kể lượng dược chất giải phóng pha giải phóng ạt [28] Xét lượng dược chất giải phóng sau 72 giờ, mẫu M5 cao (89,86%), sau đến M1 (81,96%), cuối M4 (66,45%) Nguyên nhân tăng dần tỉ lệ PLGA phân tử lượng thấp từ vi cầu M4, M1 đến M5 Phân tử PLGA bao gồm đuôi carboxyl thân nước chuỗi monome kị nước, PLGA phân tử lượng thấp kị nước so với PLGA phân tử lượng cao Khi bào chế, PLGA phân tử lượng thấp có xu hướng nằm phía ngồi bề mặt vi cầu [28] Một mặt, PLGA phân tử lượng thấp tạo điều kiện cho nước xâm nhập vào mạng lưới polyme để tạo nhiều lỗ xốp chứa nước Mặt khác, PLGA phân tử lượng thấp bị phân huỷ nhanh chóng, tạo sản phẩm phân huỷ có tính axit, sản phẩm tiếp tục làm tăng tốc độ suy thoái mạng lưới PLGA [39] Kết mạng lưới PLGA bị ăn mịn tồn Vì tỉ lệ PLGA phân tử lượng thấp tăng, tốc độ suy thoái mạng lưới PLGA lớn, tốc độ giải phóng dược chất nhanh 36 100 89,86 81,96 % dược chất giải phóng 80 66,45 60 40 M1 32,28 29,27 M4 20 M5 16,54 0 12 18 24 30 36 42 Thời gian (giờ) 48 54 60 66 72 Hình 3.10 Ảnh hưởng tỉ lệ loại PLGA đến khả giải phóng (n=3, TB±SD) So sánh kết thử giải phóng mẫu M1, M4, M5 với liệu dự đốn giải phóng mẫu vi cầu đối chiếu (mẫu M0) (bảng 3.5), kết trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết so sánh mẫu M1, M4, M5 với M0 Cặp so sánh f1 f2 M1 M0 17,46 45,93 M4 M0 36,55 32,89 M5 M0 19,57 44,06 Từ bảng 3.9 thấy mẫu M1, M4, M5 có khác biệt so với mẫu vi cầu đối chiếu Trong đó, mẫu M1 có liệu % dược chất giải phóng điều kiện cấp tốc gần với vi cầu đối chiếu nhất, thể việc có số f1 nhỏ số f2 lớn Mẫu M4 có liệu % dược chất giải phóng điều kiện cấp tốc khác mẫu vi cầu đối chiếu nhất, thể việc có số f1 lớn số f2 nhỏ *Kết luận: Trong mẫu vi cầu M1, M4, M5, mẫu M1 có liệu % dược chất giải phóng thời điểm gần với mẫu vi cầu đối chiếu Khảo sát ảnh hưởng chất tạo lỗ xốp công thức Tiến hành bào chế vi cầu với công thức bảng 2.3, thành phần polyme PLGA bảng 3.10 quy trình mục 2.3.1 Kết thử giải phóng thể hình 3.11, phụ lục 3.3 37 Bảng 3.10 Thành phần PLGA công thức vi cầu (3) Tỉ lệ loại PLGA Amoni PLGA PLGA PLGA (L/G=50:50) 7-17 kDa (L/G=50:50) 24-38 kDa (L/G=75:25) 4-15 kDa M1 - M6 - - M7 - 20 M8 - - 20 Mẫu bicarbonat (mg) *Nhận xét: Đối với nhóm vi cầu giải phóng pha (M1 M7), thêm amoni bicarbonat, đồ thị giải phóng bị biến dạng đáng kể Mẫu M7 có có lượng dược chất giải phóng pha giải phóng ạt (54,57%) cao gấp 1,86 lần so với M1 (29,27%), pha giải phóng ổn định rút ngắn lại đáng kể, pha xói mịn kéo dài (từ thời điểm 24 đến thời điểm 72 giờ) Đối với nhóm vi cầu giải phóng pha (M6 M8), thêm amoni bicarbonat, đồ thị giải phóng có biến đổi chủ yếu giai đoạn ban đầu: 24 đầu, mẫu M8 giải phóng nhanh mẫu M6 (a) 100 % dược chất giải phóng 80 58,70 54,57 60 40 M1 20 29,27 M7 0 12 18 24 30 36 42 Thời gian (giờ) 38 48 54 60 66 72 % dược chất giải phóng 100 (b) 80 60 40 M6 20 M8 0 12 18 24 30 36 42 48 Thời gian (giờ) 54 60 66 72 Hình 3.11 Ảnh hưởng chất tạo lỗ xốp đến khả giải phóng (n=3, TB±SD) Có thể nhận thấy, amoni bicarbonat ảnh hưởng mạnh đến giai đoạn giải phóng ban đầu, ảnh hưởng đến giai đoạn giải phóng cuối vi cầu Bởi amoni bicarbonat chất dễ bị phân hủy, tiến hành nhũ hóa lần 1, tác dụng lực đồng hóa lực ma sát, amoni bicarbonat bị phân hủy tạo thành khí amoniac khí carbonic Các khí làm hình thành hệ thống lỗ xốp dày đặc với kích thước lớn bề mặt vi cầu Ảnh chụp SEM bề mặt mẫu vi cầu đông khô (phụ lục 3.6) chứng minh điều Ở giai đoạn đầu, mẫu vi cầu giải phóng theo chế khuếch tán, việc vi cầu có nhiều lỗ xốp tạo điều kiện thuận lợi để dược chất khuếch tán từ bên lịng vi cầu ngồi mơi trường Cịn giai đoạn giải phóng cuối cùng, vi cầu giải phóng theo chế ăn mịn polyme nên khơng có vai trị amoni bicarbonat Do đó, thêm amoni bicarbonat vào thành phần cơng thức vi cầu làm tăng lượng dược chất giải phóng pha giải phóng ạt khơng làm tăng tổng lượng dược chất giải phóng từ vi cầu So sánh kết thử giải phóng mẫu M1, M6, M7, M8 với liệu dự đốn giải phóng mẫu vi cầu đối chiếu (mẫu M0) (bảng 3.5), kết trình bày bảng 3.11 Bảng 3.11 Kết so sánh mẫu M1, M6, M7, M8 với M0 Cặp so sánh f1 f2 M1 M0 17,46 45,93 M6 M0 18,01 46,09 M7 M0 6,48 68,13 M8 M0 4,34 75,72 39 Từ bảng 3.11 nhận thấy so sánh với mẫu vi cầu đối chiếu, mẫu vi cầu M7 M8 (nhóm vi cầu có chứa amoni bicarbonat thành phần cơng thức) có f1 ≤ 15 50 ≤ f2 ≤ 100, đồ thị giải phóng mẫu M7 M8 tương đồng với đồ thị giải phóng mẫu vi cầu đối chiếu Trong đó, mẫu M8 giống vi cầu đối chiếu nhất, thể việc có số f1 nhỏ số f2 lớn Tuy nhiên, xét chế giải phóng, mẫu M7 giải phóng theo mơ hình pha, lượng dược chất giải phóng pha giải phóng ạt lớn (54,57%), giai đoạn đến 24 lượng dược giải phóng lại (chỉ có 4,13%) Điều cho thấy mẫu M7 giải phóng khơng ổn định, nên khơng thể chọn mẫu vi cầu tối ưu Mẫu M8 giải phóng theo mơ hình pha, giống vi cầu đối chiếu, tốc độ giải phóng dược chất ổn định theo thời gian Do đó, lựa chọn vi cầu M8 mẫu vi cầu tối ưu để sử dụng nghiên cứu sâu 100 % dược chất giải phóng 80 60 40 M0 (vi cầu đối chiếu) 20 M7 M8 0 12 18 24 30 36 42 Thời gian (giờ) 48 54 60 66 72 Hình 3.12 Đường giải phóng cấp tốc mẫu M0, M7, M8 vẽ đồ thị 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Đề tài đạt số kết sau: Đã mơ hình hóa q trình giải phóng leuprolid acetat in vitro từ vi cầu PLGA điều kiện dài hạn cấp tốc - Sử dụng mơ hình Duvvuri để mơ hình hóa q trình giải phóng pha sử dụng mơ hình Korsmeyer-Peppas để mơ hình hóa q trình giải phóng pha vi cầu Đã thiết lập mối tương quan mức độ giải phóng dược chất in vitro điều kiện dài hạn với điều kiện cấp tốc - Phương trình tương quan thời gian giải phóng điều kiện dài hạn (37 oC, mơi trường PBS-TN) điều kiện cấp tốc (50oC, môi trường PBS-T): y = 2,1717x – 7,539 (R² = 0,9675) Trong đó: x thời gian thử giải phóng dài hạn (ngày), y thời gian thử giải phóng cấp tốc (giờ) - Phương trình tương quan % dược chất giải phóng điều kiện dài hạn (37oC, mơi trường PBS-TN) điều kiện cấp tốc (50oC, môi trường PBS-T) y = 1,1055x - 4,8136 (R² = 0,9282) Trong đó: x % dược chất giải phóng điều kiện dài hạn, y % dược chất giải phóng điều kiện cấp tốc Đã ứng dụng mối tương mức độ giải phóng dược chất in vitro điều kiện dài hạn với điều kiện cấp tốc nghiên cứu xây dựng công thức bào chế vi cầu leuprolid acetat đơng khơ giải phóng kéo dài - Từ kết thu được, lựa chọn mẫu vi cầu M8 mẫu vi cầu tối ưu KIẾN NGHỊ Do thời gian có hạn nên nghiên cứu đánh giá q trình giải phóng in vitro điều kiện cấp tốc mẫu vi cầu tối ưu (M8) Nghiên cứu đưa kiến nghị sau: - Thử giải phóng dài hạn mẫu vi cầu M8 so kết với kết giải phóng dài hạn tính tốn theo phương trình tương quan kết giải phóng dài hạn vi cầu đối chiếu 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Thị Phương Liên (2021), Nghiên cứu đánh giá khả giải phóng kéo dài in vitro vi cầu leuprolid acetat, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Thị Ngọc Minh (2021), Tiếp tục nghiên cứu bào chế đánh giá vi cầu leuprolid acetat giải phóng kéo dài, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Trần Thị Hồng Nhung (2020), Tiếp tục nghiên cứu bào chế đánh giá vi cầu leuprolid acetat, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Mai Văn Tân (2021), Hồn thiện quy trình bào chế vi cầu leuprolid acetat, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Trần Thị Hải Yến (2019), "Nghiên cứu bào chế đánh giá vi cầu leuprolid acetat giải phóng kéo dài sử dụng poly(lactic-co-glycolic) acid làm chất mang", Tạp chí Dược học, tập 59 (số 3), pp 07-10 Tài liệu Tiếng Anh Alexis F., Venkatraman S S., Rath S K., et al (2004), "In vitro study of release mechanisms of paclitaxel and rapamycin from drug-incorporated biodegradable stent matrices", J Control Release, 98(1), pp 67-74 Busatto C., Pesoa J., Helbling I., et al (2018), "Effect of particle size, 10 11 12 polydispersity and polymer degradation on progesterone release from PLGA microparticles: Experimental and mathematical modeling", Int J Pharm, 536(1), pp 360-369 Cascone S (2017), "Modeling and comparison of release profiles: Effect of the dissolution method", Eur J Pharm Sci, 106, pp 352-361 Chen W., Palazzo A., Hennink W E., et al (2017), "Effect of Particle Size on Drug Loading and Release Kinetics of Gefitinib-Loaded PLGA Microspheres", Mol Pharm, 14(2), pp 459-467 Chicco D., Warrens M J., Jurman G (2021), "The coefficient of determination R-squared is more informative than SMAPE, MAE, MAPE, MSE and RMSE in regression analysis evaluation", PeerJ Comput Sci, 7, p e623 Costa P., Sousa Lobo J M (2001), "Modeling and comparison of dissolution profiles", Eur J Pharm Sci, 13(2), pp 123-133 D'souza S., Faraj J A., Dorati R., et al (2014), "A short term quality control tool for biodegradable microspheres", AAPS PharmSciTech, 15(3), pp 530-541 13 D'souza S S., Faraj J A., Deluca P P (2005), "A model-dependent approach to correlate accelerated with real-time release from biodegradable microspheres", AAPS PharmSciTech, 6(4), pp E553-564 14 Du L., Mei X., Wang C., et al (2011), "In-vitro/in-vivo studies of the biodegradable poly-(D,L-lactide-co-glycolide) microspheres of a novel luteinizing hormone-releasing hormone antagonist for prostate cancer treatment", Anticancer Drugs, 22(3), pp 262-272 15 Duvvuri S., Janoria K G., Mitra A K (2005), "Development of a novel formulation containing poly(d,l-lactide-co-glycolide) microspheres dispersed in PLGA–PEG–PLGA gel for sustained delivery of ganciclovir", Journal of Controlled Release, 108(2), pp 282-293 16 17 18 19 20 21 22 23 Faisant N., Akiki J., Siepmann F., et al (2006), "Effects of the type of release medium on drug release from PLGA-based microparticles: Experiment and theory", Int J Pharm, 314(2), pp 189-197 Fredenberg S., Wahlgren M., Reslow M., et al (2011), "The mechanisms of drug release in poly(lactic-co-glycolic acid)-based drug delivery systems a review", Int J Pharm, 415(1-2), pp 34-52 Goel M., Leung D., Famili A., et al (2021), "Accelerated in vitro release testing method for a long-acting peptide-PLGA formulation", Eur J Pharm Biopharm, 165, pp 185-192 Gu B., Wang Y., Burgess D J (2015), "In vitro and in vivo performance of dexamethasone loaded PLGA microspheres prepared using polymer blends", Int J Pharm, 496(2), pp 534-540 Hirota K., Doty A C., Ackermann R., et al (2016), "Characterizing release mechanisms of leuprolide acetate-loaded PLGA microspheres for IVIVC development I: In vitro evaluation", J Control Release, 244(Pt B), pp 302-313 Janoria K G., Mitra A K (2007), "Effect of lactide/glycolide ratio on the in vitro release of ganciclovir and its lipophilic prodrug (GCV-monobutyrate) from PLGA microspheres", Int J Pharm, 338(1-2), pp 133-141 Klose D., Siepmann F., Elkharraz K., et al (2006), "How porosity and size affect the drug release mechanisms from PLGA-based microparticles", Int J Pharm, 314(2), pp 198-206 Lao L L., Venkatraman S S., Peppas N A (2008), "Modeling of drug release from biodegradable polymer blends", Eur J Pharm Biopharm, 70(3), pp 796803 24 Luan X., Bodmeier R (2006), "Modification of the tri-phasic drug release pattern of leuprolide acetate-loaded poly(lactide-co-glycolide) microparticles", Eur J Pharm Biopharm, 63(2), pp 205-214 25 26 Ma C., Fu H., Huang Z., et al (2019), "Accelerated Dissolution Method to Facilitate In Vitro Evaluation of Risperidone-Containing Microspheres", Dissolution Technologies, 26, pp 48-55 Martinez M., Rathbone M., Burgess D., et al (2008), "In vitro and in vivo considerations associated with parenteral sustained release products: a review based upon information presented and points expressed at the 2007 Controlled Release Society Annual Meeting", J Control Release, 129(2), pp 79-87 27 Nasr M., Awad G A., Mansour S., et al (2013), "Hydrophilic versus hydrophobic 28 29 30 31 32 33 34 35 porogens for engineering of poly(lactide-co-glycolide) microparticles containing risedronate sodium", Pharm Dev Technol, 18(5), pp 1078-1088 Ochi M., Wan B., Bao Q., et al (2021), "Influence of PLGA molecular weight distribution on leuprolide release from microspheres", Int J Pharm, 599, p 120450 Plosker G L., Brogden R N (1994), "Leuprorelin A review of its pharmacology and therapeutic use in prostatic cancer, endometriosis and other sex hormonerelated disorders", Drugs, 48(6), pp 930-967 Rahimi M., Mobedi H., Behnamghader A (2016), "Aqueous stability of leuprolide acetate: effect of temperature, dissolved oxygen, pH and complexation with β-cyclodextrin", Pharm Dev Technol, 21(1), pp 108-115 Ravivarapu H B., Lee H., Deluca P P (2000), "Enhancing initial release of peptide from poly(d,l-lactide-co-glycolide) (PLGA) microspheres by addition of a porosigen and increasing drug load", Pharm Dev Technol, 5(2), pp 287-296 Schwendeman S P., Shah R B., Bailey B A., et al (2014), "Injectable controlled release depots for large molecules", J Control Release, 190, pp 240-253 Shameem M., Lee H., Deluca P P (1999), "A short term (accelerated release) approach to evaluate peptide release from PLGA depot-formulations", AAPS PharmSci, 1(3), p E7 Shang Q., Zhang A., Wu Z., et al (2017), "In vitro evaluation of sustained release of risperidone-loaded microspheres fabricated from different viscosity of PLGA polymers", Polymers for Advanced Technologies, 29 Siewert M., Dressman J., Brown C K., et al (2003), "FIP/AAPS guidelines to dissolution/in vitro release testing of novel/special dosage forms", AAPS PharmSciTech, 4(1), p E7 36 Teutonico D., Montanari S., Ponchel G (2012), "Leuprolide acetate: pharmaceutical use and delivery potentials", Expert Opin Drug Deliv, 9(3), pp 343-354 37 Wang J., Wang B M., Schwendeman S P (2002), "Characterization of the initial burst release of a model peptide from poly(D,L-lactide-co-glycolide) 38 microspheres", J Control Release, 82(2-3), pp 289-307 Wilson A C., Meethal S V., Bowen R L., et al (2007), "Leuprolide acetate: a 39 drug of diverse clinical applications", Expert Opin Investig Drugs, 16(11), pp 1851-1863 Xiao P., Qi P., Chen J., et al (2020), "The effect of polymer blends on initial release regulation and in vitro-in vivo relationship of peptides loaded PLGAHydrogel Microspheres", Int J Pharm, 591, p 119964 40 41 42 43 44 45 Xu Q., Chin S E., Wang C H., et al (2013), "Mechanism of drug release from double-walled PDLLA(PLGA) microspheres", Biomaterials, 34(15), pp 39023911 Xu Q., Czernuszka J T (2008), "Controlled release of amoxicillin from hydroxyapatite-coated poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres", J Control Release, 127(2), pp 146-153 Ye M., Duan H., Yao L., et al (2019), "A method of elevated temperatures coupled with magnetic stirring to predict real time release from long acting progesterone PLGA microspheres", Asian J Pharm Sci, 14(2), pp 222-232 Yoo J., Won Y.-Y (2020), "Phenomenology of the Initial Burst Release of Drugs from PLGA Microparticles", ACS Biomater Sci Eng, 6(11), pp 6053-6062 Zolnik B S., Burgess D J (2007), "Effect of acidic pH on PLGA microsphere degradation and release", J Control Release, 122(3), pp 338-344 Zolnik B S., Leary P E., Burgess D J (2006), "Elevated temperature accelerated release testing of PLGA microspheres", J Control Release, 112(3), pp 293-300 PHỤ LỤC Phụ lục 3.1 Kết thử giải phóng điều kiện dài hạn mẫu M1 M2 (n=3, TB±SD) % giải phóng dược chất Thời gian (ngày) Mẫu M1 Mẫu M2 14,56±0,84 17,85±0,68 27,42±3,09 33,92±1,38 30,68±3,66 38,93±1,58 14 38,81±3,86 43,84±1,40 21 50,80±3,48 51,25±2,81 28 74,88±2,73 56,77±1,41 35 79,42±2,09 63,14±2,75 42 84,90±1,65 72,96±2,71 49 88,38±0,71 81,47±2,72 56 92,18±0,89 88,60±2,57 Phụ lục 3.2 Kết thử giải phóng điều kiện cấp tốc mẫu M1 M2 (n=3, TB±SD) % giải phóng dược chất Thời gian (giờ) Mẫu M1 Môi trường Tween 80 0,02% Môi trường đệm PBS pH 7,4 (chứa 0,02% Tween 80) 16,36±1,87 19,07±0,38 35,34±2,38 29,27±1,41 49,92±3,04 32,24±1,54 24 52,45±4,43 44,15±1,06 30 63,44±1,87 48,59±2,31 48 82,16±2,74 75,79±1,62 Mẫu M2 Môi trường Tween 80 0,02% 23,31±0,93 35,19±2,47 43,20±3,74 59,43±3,31 65,20±1,72 77,67±2,17 Môi trường đệm PBS pH 7,4 (chứa 0,02% Tween 80) 16,79±0,75 26,44±0,94 32,24±1,21 44,79±1,93 48,25±1,96 57,61±1,08 54 78,28±1,61 60,60±1,48 72 81,96±0,74 71,89±2,73 Phụ lục 3.3 Kết thử giải phóng điều kiện cấp tốc số mẫu môi trường đệm PBS pH 7,4 (chứa 0,02% Tween 80) (n=3, TB±SD) Thời gian % dược chất giải phóng M3 (giờ) M4 M5 M6 M7 M8 30,02±1,50 16,54±0,72 13,98±2,02 12,93±0,51 30,71±0,93 22,92±1,17 39,75±1,85 20,40±1,62 18,10±0,78 20,34±1,40 42,70±0,80 36,91±1,23 47,03±0,73 22,47±1,57 32,28±2,14 26,61±2,62 54,57±2,79 44,23±2,12 24 49,70±0,84 38,88±1,25 47,44±0,83 57,77±3,19 58,70±2,34 60,17±1,24 30 51,94±1,51 46,12±0,89 52,15±1,16 68,10±2,50 65,63±1,19 66,08±0,79 48 58,82±1,86 48,84±0,88 69,49±1,60 87,37±2,93 75,70±1,10 77,79±0,89 54 65,82±1,54 54,94±1,59 79,31±0,95 90,45±2,57 79,45±0,96 81,07±1,17 72 69,29±0,70 66,45±1,26 89,86±0,33 97,35±1,92 85,15±1,13 90,75±2,54 Phụ lục 3.4 Kết thử giải phóng dài hạn dự đốn thử giải phóng cấp tốc mẫu vi cầu đối chiếu (n=3, TB±SD) Thử giải phóng dài hạn Dự đốn thử giải phóng cấp tốc Thời gian (ngày) % giải phóng dược chất Thời gian (giờ) % giải phóng dược chất 27,49±1,38 1,15 31,47 32,82±1,58 7,66 48,73 48,43±1,40 22,86 59,86 14 58,50±2,81 38,07 72,75 21 70,16±1,41 53,27 77,81 28 74,74±2,75 68,47 87,46 35 83,47±2,71 83,67 95,65 42 90,88±2,72 49 96,44±2,57 56 98,84±1.56 Phụ lục 3.5 Kích thước tiểu phân mẫu vi cầu (n=3, TB±SD) Mẫu Dv (90) (µm) D [4,3] (µm) Span M1 19,3±0,1 10,4±0,1 1,755±0,013 M2 30,6±1,7 21,8±1,4 1,582±0,073 M3 44,1± 1,2 28,1± 2,1 1,535± 0,08 M4 24,8±1,6 15,4±0,8 2,291±0,031 M5 27,2±1,1 14,9±0,3 1,230±0,024 M6 29,6±0,8 13,2±0,2 1,103±0,035 M7 30,2±0,4 21,6±0,6 1,671±0,019 M8 27,8±0,2 18,7±0,1 1,803±0,006 (a) (b) Phụ lục 3.6 Ảnh chụp SEM mẫu vi cầu sau đông khô a) M7 chứa PLGA (50:50) 7-17 kDa : PLGA (50:50) 24-38 kDa = 7:3, thêm amoni bicarbonat b) M1 chứa PLGA (c) (d) (50:50) 7-17 kDa : PLGA (50:50) 24-38 kDa = 7:3, không thêm amoni bicarbonat c) M8 chứa PLGA (75:25) 4-15 kDa, thêm amoni bicarbonat d) M6 chứa PLGA (75:25) 4-15 kDa, không thêm amoni bicarbonat BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ GIAO THÔNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG TƯƠNG QUAN GIẢI PHÓNG IN VITRO Ở ĐIỀU KIỆN DÀI HẠN VÀ CẤP TỐC CỦA VI CẦU LEUPROLID ACETAT GIẢI PHÓNG KÉO DÀI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 ... % dược chất giải phóng điều kiện dài hạn, y % dược chất giải phóng điều kiện cấp tốc Đã ứng dụng mối tương mức độ giải phóng dược chất in vitro điều kiện dài hạn với điều kiện cấp tốc nghiên cứu. .. kiện cấp tốc - Mơ hình hóa q trình giải phóng leuprolid acetat in vitro từ vi cầu PLGA - Thiết lập mối tương quan giải phóng dược chất in vitro điều kiện dài hạn với điều kiện cấp tốc - Ứng dụng. .. % dược chất giải phóng điều kiện dài hạn y % dược chất giải phóng điều kiện cấp tốc 3.2 Ứng dụng tương quan giải phóng dài hạn – cấp tốc khảo sát cơng thức vi cầu 3.2.1 Thử giải phóng dài hạn