TÌM HIỂU VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CHỒI IN VITRO TỪ MÔ PHÂN SINH NGỌN CỦA CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS (WILLD.). LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH PHẠM MỸ NGỌC TÌM HIỂU VAI TRỊ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CHỒI IN VITRO TỪ MÔ PHÂN SINH NGỌN CỦA CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS (WILLD.) OHWI ET OHASHI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS BÙI TRANG VIỆT TS LÊ THỊ TRUNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS TS Bùi Trang Việt, Trưởng Bộ môn Sinh lý Thực vật Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Tp HCM, người giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm quý báu, tận tình hướng dẫn em suốt q trình học tập hồn chỉnh luận văn TS Lê Thị Trung truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn TS Trần Thanh Hương, Th.S Trần Thị Thanh Hiền, Th.S Phan Ngô Hoang, Th.S Trịnh Cẩm Tú tận tình giúp đỡ đóng góp ý kiến chân tình, kinh nghiệm bổ ích cho luận văn em Quý thầy cô hội đồng dành thời gian đọc đóng góp nhiều ý kiến cho luận văn em Ban chủ nhiệm tồn thể q thầy khoa Sinh Học trường ĐHSP thành phố Hồ Chí Minh Các bạn cao học khoá 19, CN Hồ Thị Mỹ Linh (Chun viên Phịng thí nghiệm khoa Sinh trường ĐHSP thành phố Hồ Chí Minh) động viên, chia sẻ giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Em Như (Cao học khoá 18 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh) em Huyên, Phước, Quỳnh sinh viên năm thứ IV thực đề tài Bộ môn Sinh lý Thực vật Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, hỗ trợ tơi việc tìm kiếm sách tài liệu tham khảo MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 7T T MỤC LỤC 7T T DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 7T 7T MỞ ĐẦU 7T T CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7T T 1.1 Giới thiệu Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi 7T T 1.1.1 Phân loại học T 7T 1.1.2 Mô tả đặc điểm hình thái Đậu T T 1.2 Sự phát sinh hình thái thực vật 7T 7T 1.2.1 Khái niệm T 7T 1.2.2 Mô phân sinh chồi T 7T 1.2.2.1 Đặc điểm T 7T 1.2.2.2 Cấu trúc mô phân sinh chồi 10 T T 1.2.2.3 Sự phân bào mô phân sinh chồi 11 T T 1.2.3 Hoạt động mô phân sinh chồi 11 T T 1.2.3.1 Trong giai đoạn nảy mầm hạt tăng trưởng mầm 11 T T 1.2.3.2 Trong giai đoạn sinh sản trưởng thành 12 T T 1.2.4 Sự phát triển chồi 12 T 7T 1.2.4.1 Sự phát triển chồi nách 12 T 7T 1.2.4.2 Sự hình thành phát triển chồi bất định 13 T T 1.3 Vai trị auxin chất điều hồ tăng trưởng thực vật phát sinh hình 7T thái chồi 14 7T 1.3.1 Vai trò auxin 14 T 7T 1.3.2 Vai trò cytokinin 16 T 7T 1.3.3 Sự phối hợp auxin cytokinin phát sinh chồi 17 T T 1.3.3.1 Tăng sinh chồi bên 17 T 7T 1.3.3.3 Sự hình thành rễ 18 T 7T CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 7T T 2.1.Vật liệu 19 7T T 2.2.Phương pháp 19 7T 7T 2.2.1.Quan sát tăng trưởng Đậu đỏ Vigna angularis vườn 19 T T 2.2.2.Khử trùng hạt 19 T 7T 2.2.3 Ảnh hưởng AIA theo nồng độ lên tăng trưởng khúc cắt chồi T Đậu đỏ 19 T 2.2.4 Ảnh hưởng AIA mg/l theo thời gian lên tăng trưởng khúc cắt T chồi Đậu đỏ 20 7T 2.2.5 Ảnh hưởng auxin cytokinin lên phát sinh hình thái chồi 21 T T 2.2.5.1 Ảnh hưởng BA riêng rẽ lên phát triển khúc cắt chồi Đậu T đỏ in vitro ngày tuổi 21 7T 2.2.5.2 Ảnh hưởng kết hợp AIA mg/l BA theo thời gian lên tăng T sinh tăng trưởng chồi 21 7T 2.2.6 Quan sát hình thái giải phẫu 22 T T 2.2.7 Đo cường độ quang hợp cường độ hô hấp 23 T T 2.2.8 Đo hoạt tính chất điều hồ tăng trưởng thực vật 23 T T 2.2.9.Xử lý số liệu 23 T 7T CHƯƠNG : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 7T T 3.1 Kết 24 7T T 3.1.1 Quan sát tăng trưởng vườn 24 T T 3.1.2 Nuôi cấy hạt để tạo in vitro môi trường MS 26 T T 3.1.3 Sự phát triển chồi mầm 26 T 7T 3.1.3.1 Trong giai đoạn hạt nảy mầm 26 T T 3.1.3.2 Sự thay đổi trọng lượng tươi trọng lượng khô theo thời gian từ giai đoạn T hạt đến mầm ngày tuổi 27 7T 3.1.3.3 Ảnh hưởng chất điều hoà tăng trưởng thực vật lên phát triển chồi T mầm 28 T 3.1.4 Các biến đổi hình thái mơ phân sinh chồi trình phát sinh chồi T T 30 3.1.5 Sự phát triển chồi nách từ in vitro vườn 33 T T 3.1.5.1 Sự phát triển chồi nách từ nách tử diệp in vitro 33 T T 3.1.5.2 Sự phát triển chồi nách từ nách in vitro vườn 33 T T 3.1.6 Quan sát hình thái giải phẫu chồi nách 36 T T 3.1.7 Ảnh hưởng AIA theo nồng độ lên tăng trưởng khúc cắt chồi T Đậu đỏ 45 T 3.1.8 Ảnh hưởng AIA mg/l theo thời gian lên tăng trưởng khúc cắt T chồi Đậu đỏ 47 7T 3.1.8.1 Khảo sát tăng trưởng chồi mơi trường AIA mg/l sau chuyển T sang mơi trưịng MS theo thời gian 47 T 3.1.8.2 Khảo sát tăng trưởng chồi môi trường MS sau chuyển sang mơi T trưòng AIA mg/l theo thời gian 51 T 3.1.9 Sự thay đổi cường độ quang hợp hô hấp chồi sau xử lý AIA T mg/l theo thời gian 54 7T 3.1.10 Hoạt tính chất điều hồ tăng trưởng thực vật nội sinh trình tăng T trưởng chồi 55 7T 3.1.11 Ảnh hưởng auxin cytokinin lên phát sinh hình thái chồi 57 T T 3.1.11.1 Ảnh hưởng BA riêng rẽ lên phát triển khúc cắt chồi T Đậu đỏ in vitro ngày tuổi 57 7T 3.1.11.2 Ảnh hưởng kết hợp AIA mg/l với BA theo thời gian lên T tăng sinh tăng trưởng chồi 62 7T 3.2 Thảo luận 7T 7T CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 12 7T T 4.1 Kết luận 12 7T T 4.2 Đề nghị 12 7T T TÀI LIỆU THAM KHẢO 14 7T 7T PHỤ LỤC 18 7T T DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA : Abcisic acid AIA : Acetic indol acid BA : Benzyl Adenin CĐHTTTV : Chất điều hoà tăng trưởng thực vật G1 : ( G : gap, khoảng gián đoạn) - Tế bào trạng thái trưởng thành R R GA R R : Giberelic acid IBA : Indol Butyric acid MS : Murashige Skoog TLT : Trọng lượng tươi TLK : Trọng lượng khô cs : cộng MỞ ĐẦU Phát sinh hình thái sở cho việc vi nhân giống thực vật mà quan tâm Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới phát sinh liên tục mô quan thực vật nhờ hoạt động nhóm tế bào gốc khơng phân hóa (undifferentiated stem cells) gọi mơ phân sinh Hơn nữa, kiểm sốt hoạt động mơ phân sinh chồi mức phân tử tác động chất điều hòa tăng trưởng thực vật, đặc biệt auxin cytokinin, gần nghiên cứu nhiều tác giả Do đó, đề tài tập trung nghiên cứu Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi, thông dụng Việt Nam, để hiểu hoạt động mô phân sinh chồi tác động auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin Việc khảo sát ảnh hưởng auxin lên phát sinh hình thái chồi Đậu thực khía cạnh hình thái học sinh lý học, qua bổ sung thêm kiến thức phục vụ cho công tác nghiên cứu, ứng dụng vi nhân giống giảng dạy CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi 1.1.1 Phân loại học Cây Đậu dùng đề tài Đậu đỏ, phân loại sau: Ngành : Lớp : Bộ : Họ : Chi : Loài : 5T Magnoliophyta 7T Magnoliopsida 7T Fabales 7T T T Fabaceae 7T T T Vigna 5T Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi (Phạm Hồng 5T Hộ, 1999) 1.1.2 Mơ tả đặc điểm hình thái Đậu Cây Đậu đỏ (adzuki bean) loại cỏ niên, đứng hay leo Cây có chiều cao trung bình 50-80 cm, có cạnh lơng dài Cuống dài 10-12 cm, có lơng Lá thường có hình xoan, đầu trịn, có thùy, dài 6-8 cm có lơng Mỗi gồm 4-5 cặp gân phụ Hoa mọc thành chùm nách lá, dài 3-10 cm, có màu vàng nhạt Đài hoa có ngắn Trái dài 6-10 cm rộng 0,7 cm, có chót nhọn Hột dài 6-10 mm, có màu nâu Bộ nhiễm sắc thể Đậu đỏ 2n = 22 Cây Đậu đỏ trồng nhiều Nha Trang, Sài Gòn,… trồng để lấy hạt Công dụng Đậu đỏ : rễ dùng để đắp trị sưng; hột giúp lợi tiểu, trị kiết… (Phạm Hoàng Hộ, 1999) 1.2 Sự phát sinh hình thái thực vật Ảnh 1.1 Cây Đậu đỏ Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi (http://www.botanyvn.com/cnt.a sp?param=news&newsid=934) 1.2.1 Khái niệm Sự phát sinh hình thái thực vật phát triển thể thực vật theo thời gian để hồn tất chu trình phát triển Phát triển thay đổi tế bào, mô hay quan từ lúc khởi đầu lúc trưởng thành Phát sinh hình thái thực vật bao gồm phát sinh mơ (histogenesis), phát sinh quan (organogenesis) phát sinh phôi (embryogenesis) (Bùi Trang Việt, 2000) Trong phát sinh quan in vitro, tạo quan theo đường phát sinh quan trực tiếp (các quan tạo trực tiếp từ mẫu cấy) hay gián tiếp (mẫu cấy tạo mơ sẹo, sau quan tạo từ mô sẹo này) (Bùi Trang Việt, 2000) Sự phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc hai q trình sau: - Sự điều hồ hướng kéo dài tế bào - Sự kiểm soát vị trí hướng mặt phẳng phân chia tế bào Chính kiểu tăng trưởng tế bào riêng rẽ định hình thái quan thể thực vật (Bùi Trang Việt, 2000) Sự phát triển mức tế bào thể qua hai chuỗi thay đổi: tăng trưởng (phân chia kéo dài tế bào) phân hóa tế bào Ở thực vật, phân chia kéo dài tế bào tách biệt theo không gian thời gian (Bùi Trang Việt, 2000) Môn phát sinh hình thái mơn học nhằm mơ tả biến đổi hình thái cấu trúc, phân tích yếu tố nội sinh ngoại sinh, nghiên cứu điều hịa hình thái thực vật Sự phát sinh hình thái liên quan cách tồn diện đến nguồn gốc phát triển hình thái thực vật Do đó, khơng có kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ chứng minh tất khía cạnh Những kỹ thuật nhiều lĩnh vực khác mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học di truyền học giúp tìm hiểu tượng phát sinh hình thái Trong số phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp dùng nhiều là: - Cắt bỏ vùng lân cận mô phân sinh theo dõi biến đổi phát triển sau - Ni cấy in vitro điều kiện vơ trùng có kiểm soát phần tách rời thể thực vật Trong thí nghiệm in vitro, nghiên cứu sinh lý học thường khó tiến hành kích thước nhỏ bé loại mô cấy, nên áp dụng chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoại sinh cách hữu hiệu để tìm hiểu phát sinh hình thái thực vật (Bùi Trang Việt, 2000) Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới phát sinh liên tục mô quan thực vật nhờ hoạt động nhóm tế bào gốc khơng phân hóa (undifferentiated stem cells) gọi mô phân sinh (Vernoux cs, 2010) 1.2.2 Mô phân sinh chồi 1.2.2.1 Đặc điểm Các mô phân sinh vùng riêng biệt diện đời sống thực vật Các tế bào vùng mơ phân sinh có khả phân chia khơng ngừng, tế bào nhỏ, xếp sát khơng có khoảng gian bào Tế bào chất tế bào mô phân sinh có độ nhớt cao, có nhiều khơng bào nhỏ li ti, số lượng bào quan (ribosome, ty thể, lạp thể) nhiều Nhân lớn chiếm vị trí trung tâm Như vậy, cấu tạo tế bào mô phân sinh nói lên hoạt tính sinh lý cao chúng (Bùi Trang Việt, 2000) Mô phân sinh sở hình thành mơ vĩnh viễn Nhờ hoạt động mô phân sinh mà sinh trưởng phát triển Trong q trình sinh phơi, mơ phân sinh chồi phát triển vùng hai sơ khởi mầm (đối với hai mầm) hay gốc thuẫn (đối với mầm) Mô phân sinh chồi có đường kính 100 – 200 µ m (Bùi Trang Việt, 2000) Khi trưởng thành, mô phân sinh nằm chồi chính, chồi bên thân rễ Các mô phân sinh hoạt động phân chia suốt đời sống cây, giúp dài (Nguyễn Như Khanh, 2009) 1.2.2.2 Cấu trúc mơ phân sinh chồi Có nhiều quan điểm tổ chức mô phân sinh chồi, quan điểm thường gặp tổ chức mô phân sinh chồi thành vùng hay lớp phân biệt (Esau, 1967) Mô phân sinh chồi Arabidopsis có ba lớp: L1, L2, L3 L1 lớp (lớp ngoại vi), L2 lớp bên lớp ngoại vi L1 L2 tạo nên vỏ L3 lớp thể vùng đỉnh Vỏ cho lớp biểu bì biểu bì thân Một số tế bào từ phân chia vỏ thể cho sơ khởi lá, thân, nụ nách phận hoa (nếu nụ hoa) (Bùi Trang Việt, 2000) Nếu chia mơ phân sinh chồi theo vùng mô phân sinh chồi chia thành ba vùng chính: - Vùng đỉnh (vùng mơ phân sinh chờ) chứa tế bào có khơng bào lớn, tế bào chất chứa rRNA, chu kì tế bào dài, hoạt tính phân chia thấp, tế bào chủ yếu pha G Vùng R R gọi mơ phân sinh chờ chúng hoạt động mô phân sinh chuyển sang trạng thái sinh sản - Vùng bên (vùng khởi sinh, hay vùng phát sinh quan) chứa tế bào nhỏ với khơng bào nhỏ, giàu rRNA, có hoạt tính phân chia cao Chu kì tế bào (pha G ) ngắn Đây vùng R R phát sinh mô thân (bao gồm mô dẫn) - Vùng lõi (vùng phát sinh mô) nằm vùng đỉnh, chứa tế bào có khơng bào lớn, hàm lượng rRNA so với vùng đỉnh, hoạt tính phân chia chu kì phân chia tế bào vùng mức trung gian so với vùng đỉnh vùng bên (Bùi Trang Việt, 2000; Taiz Zeiger, 2002) Vùng lõi vùng phát sinh mô lõi thân quan khác xuất phát từ vùng bên (Esau, 1967) Theo cách phân chia khác, tổ chức mô phân sinh chồi gồm tunica (vỏ) corpus (thể) Ở Arabidopsis hầu hết hai mầm, tunica gồm lớp L1 bao phủ phía ngồi mơ phân sinh chồi lớp L2 nằm lớp L1 Corpus (được gọi L3) lớp tế bào đơn lẻ mà nhóm tế bào tunica (Evert, 2006) 1.2.2.3 Sự phân bào mô phân sinh chồi Các tế bào lớp áo bọc hay tunica (hai hay ba lớp) xếp dặn, bao quanh tế bào trung tâm, phân chia theo mặt phẳng vng góc với bề mặt phôi (anticlinial division) Các lớp tế bào trung tâm (thể corpus) phân bố không đặn phân chia theo mặt phẳng khác (Nguyễn Như Khanh, 2009) 1.2.3 Hoạt động mô phân sinh chồi 1.2.3.1 Trong giai đoạn nảy mầm hạt tăng trưởng mầm Từ hợp tử, phát triển phơi hạt kiểm sốt theo thời gian khơng gian qua hai giai đoạn chính: sinh phôi trưởng thành phôi Kết phát triển phơi nỗn hạt chín, vỏ nỗn hầu tạo nên vỏ hạt bền bao quanh phôi nội nhũ Vào lúc đó, phơi ngừng phát triển hạt vào trạng thái ngủ Hạt không phát triển tiếp nảy mầm Như vậy, nảy mầm hạt thường xảy sau giai đoạn khô (giai đoạn ngủ) cuối giai đoạn trưởng thành phôi Phôi ngủ bao gồm thân mầm rễ mầm chứa mô phân sinh đỉnh Các mô phân sinh tạo tế bào làm cho phôi dài hạt nảy mầm (Bùi Trang Việt, 2000) Sự nảy mầm hạt xem tái lập tăng trưởng phơi Q trình tái thu nước hạt lú rễ mầm khỏi hạt Các đặc tính quan trọng nảy mầm là: hấp thu nước mạnh, hoạt tính biến dưỡng mạnh, phát sinh nhiệt mạnh (Bùi Trang Việt, 2000) Sự nảy mầm cuả hạt gồm ba giai đoạn chính: - Giai đoạn thu nước (6 – 12 tùy loại hạt) Hạt (nhất phôi) thu nước mạnh, phồng lên tăng trọng lượng tươi Sự thu nước kèm với gia tăng cường độ hô hấp, biểu tái lập hoạt tính biến dưỡng - Giai đoạn nảy mầm theo nghĩa hẹp (12 – 48 giờ) Giai đoạn bắt đầu bão hịa nước cường độ hơ hấp mức cao hạt, phản ứng biến dưỡng bắt đầu, chất dự trữ bị thủy giải phơi đồng hóa Kế đó, phơi tái lập phân chia tế bào, vỏ hạt bị rách, rễ mầm lú khỏi vỏ hạt (1 – mm), thân mầm kéo dài - Giai đoạn tăng trưởng mầm Trong giai đoạn này, hạt thu thêm nước tăng thêm cường độ hô hấp, tương ứng với tăng trưởng đáng kể rễ mầm thân mầm Hoạt tính biến dưỡng mầm (từ phơi) tăng mạnh, hoạt tính biến dưỡng mơ dự trữ (phôi nhũ, tử diệp) giảm mạnh, chất dự trữ cạn dần Ở trạng thái này, khử nước làm hạt chết (Bùi Trang Việt, 2000) 1.2.3.2 Trong giai đoạn sinh sản trưởng thành Hoa thành lập từ chồi hay chồi nách Để chồi dinh dưỡng trở thành sinh sản, thực vật cần phải đạt tới trạng thái phát triển tối thiểu hay trưởng thành hoa Sự chuyển tiếp hoa gây nên biến đổi sâu sắc mô phân sinh ngọn, từ mô phân sinh dinh dưỡng thành mô phân sinh tiền hoa Quá trình hoa biểu thị qua thay đổi hình thái sinh lý mô phân sinh chồi (Bùi Trang Việt, 2000) Như vậy, mô phân sinh chồi đạt đến trạng thái định diễn hoạt động biến đổi từ trạng thái tăng trưởng sinh dưỡng không hạn định sang trạng thái phát triển sinh sản hạn định Các biến đổi giai đoạn thường khơng quan sát mắt thường kính hiển vi, biết phân tích tế bào học hay sinh hoá học, với tăng mạnh hoạt tính biến dưỡng: rút ngắn chu kỳ tế bào, gia tăng hoạt tính phân chia, đặc biệt vùng đỉnh (Bùi Trang Việt, 2000) Mô phân sinh chồi tăng cường tổng hợp RNA, tăng tốc độ tổng hợp protein, enzym chuyển hóa (invertase) tăng cường hoạt động, số lượng ti thể gia tăng, hàm lượng sucrose ATP tăng Bên cạnh đó, chu trình tế bào mô phân sinh rút ngắn lại, tăng tỷ lệ phân chia tế bào Ở mô phân sinh dinh dưỡng, tế bào vùng đỉnh phân chia chậm Chính phân chia nhanh vùng đỉnh khiến cho mô phân sinh hoa lớn mô phân sinh dinh dưỡng (Taiz Zeiger, 2002) Sự biến đổi thể rõ máy dinh dưỡng, đặc biệt kéo dài lóng thân phân chia tế bào mạnh vùng mô phân sinh tiền hoa Các biến đổi mức tế bào quan trọng, định biến đổi mức quan sau (Bùi Trang Việt, 2000) 1.2.4 Sự phát triển chồi 1.2.4.1 Sự phát triển chồi nách Chồi nách diện nách lá, tạo mô phân sinh phát thể xếp chồng lên Sự phát triển chồi nách (sự phát sinh chồi) bao gồm tổ chức mơ phân sinh chồi (có cấu trúc giống với mơ phân sinh thân chính), kéo dài phân hố mơ Chồi nách có nguồn gốc ngoại sinh, ngược với nguồn gốc nội sinh rễ nhánh (Bùi Trang Việt, 2000) Các chồi nách thường bị cản phát triển bị chồi ức chế (hiện tượng ưu ngọn) Hiện tượng auxin tổng hợp di chuyển đến chồi nách cản phát triển chồi nách (do hiệu ứng cản tăng trưởng auxin) có cạnh tranh dinh dưỡng (chồi thu hút chất dinh dưỡng mạnh phía nó) auxin kích thích tiết chất cản (etylen ABA) cản phát triển chồi (Bùi Trang Việt, 2000) Các chồi bên cảm ứng phát triển cách phá bỏ ưu Cho nên người ta cắt bỏ chồi để chồi nách phát triển Trong nuôi cấy in vitro, chồi nách kích thích phát triển mạnh việc bổ sung cytokinin vào mơi trường Vai trị cytokinin lúc hạn chế ưu để chồi bên phát triển (Bùi Trang Việt, 2000) Sự phát triển thân nhánh: Thân phát triển từ chồi ngọn, nhánh từ chồi nách Sự tăng trưởng chồi nhờ mô phân sinh bổ sung tăng trưởng lóng nhờ mơ phân sinh lóng (Bùi Trang Việt, 2000) Sự phát triển lá: Lá bắt nguồn từ bề mặt mơ phân sinh đỉnh dạng nón sinh trưởng sơ cấp tạo nên Lá có tăng trưởng bề mặt đời sống giới hạn Các tế bào sơ khởi tiếp tục phân chia gia tăng kích thước tạo nên cuống phiến (Bùi Trang Việt, 2000) 1.2.4.2 Sự hình thành phát triển chồi bất định Chồi bất định xuất khơng liên hệ với mơ phân sinh chóp mà xuất gần vết thương, gần chỗ vết cắt, gần vùng phát sinh libe-mộc ngồi biểu bì Vì chồi có nguồn gốc nội sinh ngoại sinh khử phân hóa tế bào trưởng thành Chúng khởi phân chia tế bào xếp tế bào giống sinh mơ chóp có mạch gắn liền với mạch thân (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001) Mô phân sinh chồi từ tế bào biểu bì, mô hàng rào, mô khuyết hay mô bao quanh mạch mơ cấy Trước phân hóa để hình thành tầng phát sinh chồi tạo mới, tế bào phân hóa phải trải qua q trình tái hoạt động Sự tái hoạt động cảm ứng nguyên cách đàn áp hiệu ứng cản tương quan (gỡ ưu tính cách cắt bỏ chồi ngọn) hay mô cấy nhờ môi trường ni cấy có bổ sung chất điều hồ thích hợp Có hai giai đoạn xảy q trình tái hoạt động: giai đoạn khử phân hóa giai đoạn tái phân hoá (Gautheret, 1966; Bùi Trang Việt, 2009) Trong giai đoạn khử phân hóa, tế bào phân hóa bắt đầu phân chia, quan bên tế bào biến đổi để trở trạng thái tế bào mô phân sinh thứ cấp (hạch nhân, không bào lớn dần ty thể, lạp thể phân chia thành bóng nhỏ) Sau bước chuyển tiếp từ tế bào trạng thái mô phân sinh thứ cấp sang trạng thái mô phân sinh sơ cấp có khả sinh quan Lúc khơng bào phân chia thành không bào nhỏ Tế bào tích nhỏ dần, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, nhân hạch nhân to (Bùi Trang Việt, 2009) Tiếp theo giai đoạn tái phân hóa mô phân sinh sơ cấp Tế bào trở lại trạng thái mô phân sinh thứ cấp Sự tái phân hóa qua hai bước: bước một, tế bào trở trạng thái mô phân sinh hoạt động, không bào trương nước hợp thành không bào trung tâm, kích thước tế bào gia tăng, ty thể dần trở hình dạng đặc trưng; bước hai, lạp phân hóa, chất sống (hạch nhân, tế bào chất…), chất dự trữ, chất tiết (tanin, tinh dầu…) tổng hợp Sau đó, tế bào trở lại giai đoạn phân chia tế bào hay trực tiếp phân hóa mà khơng qua phân chia tế bào (Bùi Trang Việt, 2000) Trong tự nhiên, tạo chồi trực tiếp xảy chỗ khuyết số loại sống đời, từ mô phân sinh gân dương xỉ (Bùi Trang Việt, 2000) Tóm lại, phát sinh chồi bất định gồm giai đoạn: - Đầu tiên hình thành khối sinh mơ (có liên hệ với trung tâm mô phân sinh chồi hay mô phân sinh) - Tiếp theo hình thành sơ khởi chồi - Cuối chồi bất định hình thành từ sơ khởi dạng kim đỉnh vịm (Soh Bhojwani, 1999) 1.3 Vai trò auxin chất điều hoà tăng trưởng thực vật phát sinh hình thái chồi 1.3.1 Vai trị auxin Auxin đóng vai trị trung tâm hoạt động mô phân sinh chồi (cần thiết cho phân chia tăng trưởng tế bào) Tuy nhiên auxin lại phân bố không đồng mô phân sinh Một yếu tố điều hòa lượng auxin chất vận chuyển auxin thuộc họ PIN AUX (Vernoux cs, 2010) Auxin cần thiết cho phân chia tăng trưởng tế bào nên có vai trị quan trọng phát sinh hình thái thực vật Auxin tổng hợp thân, mơ phân sinh (ngọn lóng) non (tức nơi có phân chia tế bào nhanh) Sau đó, auxin di chuyển tới rễ tích tụ rễ (Taiz Zeiger, 2002; Bùi Trang Việt, 2000) Ở mức tế bào, auxin kiểm soát phân chia, kéo dài phân hoá tế bào Các tế bào biểu bì hay biểu bì phản ứng mạnh với auxin Auxin kích thích mạnh phân chia tế bào tượng tầng (tầng phát sinh libe- mộc), không tác động mơ phân sinh sơ cấp Do auxin tác động tăng trưởng theo đường kính Đồng thời auxin giúp phân hóa mơ dẫn, có khả cảm ứng trực tiếp phân hoá tế bào nhu mô thành tổ chức mô dẫn (Bùi Trang Việt, 2000) Nồng độ auxin có ảnh hưởng kéo dài tế bào Auxin kích thích mạnh kéo dài tế bào diệp tiêu tế bào vùng kéo dài thân Sự kéo dài tế bào rễ cần nồng độ thấp nhiều so với tế bào thân Trong hai trường hợp, hiệu ứng auxin giảm sau nồng độ tối hảo, trở nên độc nồng độ cao Hoạt tính kéo dài tế bào auxin auxin tác động lên bơm proton màng nguyên sinh chất Sự kéo dài tế bào trình phức tạp: hấp thu nước, dãn dài vách sức trương, đặt hợp chất vách mạng vi sợi celluloz, sinh tổng hợp protein chất khác (Bùi Trang Việt, 2000) Trong trình tạo chồi Auxin nồng độ thấp cần cho tạo chồi Auxin kết hợp với cytokinin giúp tăng trưởng chồi non khởi phát tạo mô phân sinh chồi từ nhu mô Ở nồng độ cao, auxin cản phát triển phát thể chồi vừa thành lập hay chồi nách (Bùi Trang Việt, 2000) Sự vận chuyển hữu cực auxin có vai trị thiết lập, trì tính hữu cực thực vật quan chúng Việc cản vận chuyển hữu cực auxin dẫn tới nhiều tính bất thường, phơi dẫn đến chết Tác dụng auxin tùy thuộc vào kiểu tăng trưởng phát triển cần nghiên cứu; loại hàm lượng auxin nội sinh có mẫu cấy; tính nhạy mô thực vật với auxin; tương tác qua lại auxin nội sinh auxin ngoại sinh; kìm hãm hoạt tính auxin (bị oxy hố hay liên kết) môi trường mô cấy (Machakova cs, 2008) Trong trình tạo rễ Auxin nồng độ cao kích thích tạo sơ khởi rễ nồng độ thấp cần cho tạo chồi Trong hầu hết lồi thực vật, hình thành rễ bất định khởi phát auxin, vài lồi auxin ngoại sinh dường ảnh hưởng Sự tăng lượng AIA cần thiết giai đoạn cảm ứng tạo sơ khởi rễ, giảm hàm lượng AIA sau cho phép kéo dài sơ khởi rễ Như auxin nồng độ cao kích thích tạo sơ khởi rễ, cản tăng trưởng sơ khởi (Bùi Trang Việt, 2000) Số lượng rễ chồi thường tăng theo nồng độ auxin xử lý Nhưng nồng độ auxin q cao có hình thành callus, rễ có hình dạng khơng bình thường khơng kéo dài, sau tăng trưởng chồi bị giảm (George, 1996) Điều cho thấy, q trình sinh lý, auxin có hiệu ứng khác nhau, chí đối nghịch tùy theo nồng độ quan nuôi cấy Ở nồng độ đó, auxin có hiệu ứng khác trình sinh lý khác quan (như kéo dài phát triển rễ), hay trình sinh lý quan khác (như kéo dài thân rễ, phát triển chồi rễ) Đối với phân hóa quan, auxin có hiệu ứng thay đổi theo thời gian, hàm lượng auxin thay đổi theo phát triển (Bùi Trang Việt, 2000) Tóm lại, auxin có vai trị quan trọng đáp ứng thực vật tín hiệu từ mơi trường ánh sáng trọng lực; kiểm soát mối tương quan ưu ngọn; acid hóa vách tế bào, tăng trưởng kéo dài tế bào; phân chia tế bào; hình thành mơ sẹo; phân hóa mơ dẫn phát triển rễ… (Bùi Trang Việt, 2000) 1.3.2 Vai trò cytokinin Cytokinin tổng hợp chủ yếu mô phân sinh rễ vận chuyển xylem đến chồi Hoạt động cytokinin tăng trưởng tế bào: + Cytokinin kích thích phân chia tế bào với điều kiện có auxin Cytokinin tác động hai bước phân chia tế bào: phân nhân phân bào + Cytokinin giúp gia tăng kích thước tế bào sinh tổng hợp protein Trong thân rễ, cytokinin cản kéo dài kích thích tăng rộng tế bào (sự tăng trưởng củ) Cytokinin ngăn cản lão hóa, thúc đẩy trưởng thành diệp lạp nhân tố điều khiển q trình tái sinh mạch giúp cho tạo chồi (Taiz Zeiger, 2002; Bùi Trang Việt, 2000) Hoạt động cytokinin tạo quan: + Ở nồng độ cao, cytokinin giúp tạo cụm chồi Số lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng độ cytokinin Tuy nhiên có bất lợi định việc điều chỉnh nồng độ để cảm ứng tạo nhiều chồi: Chồi tạo trở nên nhỏ, kéo dài đến kích thước định để tách cho hình thành rễ, tạo bất thường (Edwin, 1996) + Ở nồng độ thấp, cytokinin kích thích phát triển chồi nách Nồng độ cao cảm ứng hình thành chồi bất định chồi khó rễ + Ở số lồi thực vật, hình thành chồi cảm ứng cytokinin chồi không xuất khúc cắt chuyển sang môi trường giảm khơng có cytokinin Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi kìm hãm kéo dài chồi Những vấn đề khắc phục cách giảm nồng độ CĐHTTTV sau vài lần cấy chuyền để chồi phát triển tốt (Edwin, 1996) Cytokinin kích thích tăng trưởng chồi nách giảm ưu Do ni cấy, người ta thường bổ sung hay vài loại cytokinin vào môi trường để cảm ứng tăng trưởng vài chồi nhỏ từ mẫu cấy (Bùi Trang Việt, 2000) Ảnh hưởng cytokinin nuôi cấy mô quan tùy thuộc vào loại cytokinin sử dụng, kiểu mơ cấy, loại thực vật ni cấy, tình trạng mơ cịn non hay già Trong ni cấy chồi, hầu hết mẫu cấy từ loài thực vật khác cần có cytokinin BA kích thích tăng sinh chồi nách Castanea thí nghiệm Vieitez cs (1985) kinetin khơng có ảnh hưởng Ở Corylus avellana, BA mg/l cho tỷ lệ tăng sinh chồi cao từ mẫu cấy non, mẫu cấy trưởng thành cần zeatin 10 mg/l (Staden cs, 2008) 1.3.3 Sự phối hợp auxin cytokinin phát sinh chồi 1.3.3.1 Tăng sinh chồi bên Tỷ lệ tăng sinh chồi nuôi cấy chồi thường tùy thuộc vào nồng độ cytokinin áp dụng Ở số thực vật, kết hợp cytokinin auxin giúp hiệu tăng sinh chồi cao Khi cytokinin cao, nhiều chồi nhỏ hình thành khơng thể kéo dài có bị biến dạng (Staden cs, 2008) Dưới ảnh hưởng tỉ lệ cytokinin cao, chồi hình thành dễ bị tượng thủy tinh thể Mặt khác, chồi hình thành mơi trường có nồng độ cytokinin cao thường khó tạo rễ (George, 1996) 1.3.3.2 Sự hình thành chồi bất định Auxin phối hợp với cytokinin giúp tăng trưởng chồi non khởi phát tạo mô phân sinh chồi từ nhu mô Tuy nhiên, nồng độ cao, auxin cản phát triển phát thể chồi vừa thành lập hay chồi nách, chồi vào trạng thái tiềm sinh Như cỏ ba lá, cytokinin riêng rẽ cảm ứng tạo chồi số lượng chồi tăng nhanh, thêm auxin vào môi trường nuôi cấy làm cho chồi khó hình thành tạo mơ sẹo khơng mong muốn (Bhojwani, 1981 Edwin, 1996) Ở Brassica alboglabra, số lượng chồi hình thành mơi trường có kinetin giảm mạnh bổ sung AIA, IBA NAA (Pua cs, 1989 Edwin, 1996) Cytokinin có hiệu việc tạo chồi trực tiếp hay gián tiếp Tác dụng cytokinin có hiệu phối hợp với auxin tỉ lệ thích hợp Tỷ lệ cytokinin với auxin định kiểu tái sinh quan từ mơ sẹo chưa phân hóa in vitro: tỷ lệ auxin/cytokinin cao giúp tạo rễ; tỷ lệ auxin/cytokinin thấp giúp tạo chồi Một tỷ lệ cân hai chất ĐHTTTV tạo nên khối mơ sẹo khơng phân hóa (Mok cs, 1994) Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin tăng trưởng, đồng thời có đối kháng auxin (giúp tạo rễ) cytokinin (giúp tạo chồi); cân hai hormon yếu tố kiểm soát phát triển (Bùi Trang Việt, 2000) 1.3.3.3 Sự hình thành rễ Nồng độ cytokinin cao (0,5–10 mg/l) thường cản hay làm trì hỗn hình thành rễ, đồng thời cản tăng trưởng rễ, làm giảm hiệu kích thích tạo rễ auxin Vì vậy, cytokinin thường khơng sử dụng kích thích tạo rễ chồi Đơi người ta thấy cytokinin cảm ứng tạo rễ kích thích tăng trưởng rễ kích thích hình thành rễ bất định mơi trường khơng có auxin Trong hầu hết trường hợp lượng cytokinin cần thấp Ví dụ chồi củ cải đường tạo rễ mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l kinetin Hay Rosa hybrida cần thiết phải thêm BA mg/l với IBA để cảm ứng hình thành phát triển rễ (Staden cs, 2008) Không auxin cytokinin mà vách tế bào, xương vi ống (microtubule cytoskeleton) liên quan tới phát sinh hình thái thực vật nói chung hoạt động mô phân sinh chồi (Ferguson Beveridge, 2009; Fleming, 2005; Hamant cs, 2008) CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1.Vật liệu - Hạt Đậu đỏ Vigna angularis (được đóng gói cơng ty TNHH Xn Hồng 44/12 Phan Xích Long Phường 16 Quận 11 Thành phố Hồ Chí Minh) - Cây in vitro ngày tuổi cấy từ hạt Đậu đỏ 2.2.Phương pháp 2.2.1.Quan sát tăng trưởng Đậu đỏ Vigna angularis vườn Gieo hạt nảy mầm (rễ mầm dài 1-2 mm) vào chậu (đường kính: 20 cm, chiều cao: 30 cm), chậu gieo hạt Lặp lại lần Theo dõi tăng trưởng Đậu chiều dài cây, chiều dài lá, dạng lá, số lượng nhánh, thời gian tăng trưởng cây, thời gian hoa kết quả, thời gian thu hoạch hạt 2.2.2.Khử trùng hạt Hạt Đậu đỏ rửa vòi nước 30 phút, rửa lại xà phòng phút, rửa xà phòng rửa lại với nước cất lần Sau hạt chuyển vào Erlen Lắc hạt với cồn 700 P vòng phút rửa cồn nước cất Tiếp tục khử trùng dung dịch HgCl 0,1 % R R 5phút Rửa dung dịch khử trùng nước cất vơ trùng (5 lần) Sau cấy hạt vào ống nghiệm có đường kính 22 mm, dài 20 cm, chứa 10 ml môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) 2.2.3 Ảnh hưởng AIA theo nồng độ lên tăng trưởng khúc cắt chồi Đậu đỏ Khúc cắt chồi với chiều dài mm (đã cắt bỏ thứ nhất) từ in vitro ngày tuổi môi trường MS bổ sung AIA riêng rẽ nồng độ 0,01; 0,1; 1; 2; 5; 10 mg/l để khảo sát tăng trưởng chồi Mỗi môi trường nuôi cấy gồm mẫu cấy với lần lặp lại Kết ghi nhận giá trị trung bình lần lặp lại (15 mẫu cấy) Sau 10 ngày nuôi cấy, tiêu sau ghi nhận: - Chiều dài khúc cắt (từ vị trí gốc cắt đến chồi ngọn) - Chiều dài (từ vị trí cuống đến lá) - Số lượng rễ / khúc cắt - Chiều dài trung bình rễ / khúc cắt P