TT PHẢN ỨNG KN KT (RPR ELISA)

Bài Thực tập - Kiến tập PHẢN ỨNG Kháng nguyên – Kháng thể PGS TS Cao Minh Nga BM Vi sinh - Khoa Y - ÑH Y Dược TP HCM MỞ ĐẦU • ĐN: Là phương pháp miễn dịch học (MDH) • Mục đích: Xác định / - chuẩn độ KN - định lượng hiệu giá KT - đo lường phức hợp KN-KT - đo lường nhân tố  tham gia / hệ thống MD VD: kiểm tra hoạt tính bổ thể PHÂN LOẠI A PƯ dựa tạo thành “hạt”: Kết tủa (precipitation reaction): KN hòa tan Ngưng kết (agglutination reaction): KN hữu hình B PƯ dựa hoạt động sinh học KT: Kết hợp bổ thể (complement binding reaction) Trung hòa (neutralization reaction) C PƯ MD đánh dấu: Huỳnh quang (immunofluorescence reaction) Men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA) Phóng xạ (radio immmuno assay - RIA) Thử nghiệm xác định Westein Blot (dấu thấm MD) Các phản ứng MD có độ nhạy khác Loại phản ứng MD Ngưỡng phát (g/ml) Kết tủa / môi trường lỏng Kết tủa / thạch: - khuếch tán đơn (Mancini) - khuếch tán kép (Ouchterlony) - MD điện di (Immuno electrophoresis ) 20 Ngưng kết: - trực tiếp - gián tiếp - NK vi khuẩn 10 50 0,5 0,001 0,001 Cố định bổ thể (CF) 0,1 Miễn dịch huỳnh quang (IF) 0,1 Định lượng MD phóng xạ (RIA) 0,0001 Định lượng MD enzym (EIA / ELISA) 0,0001 * Các phản ứng MD thường dùng Vi sinh lâm sàng A PƯ ngưng kết (agglutination reaction) - Ngưng kết: nhóm máu, nhóm VKĐR, TPHA, … - Ngưng kết thụ động: Latex, RPR, … - Ngăn ngưng kết (HI) B PƯ MD đánh dấu: - MDHQ (IF), - ELISA * THỰC HÀNH – KIẾN TẬP Phản ứng RPR (Rapid Plasma Reaction) Phản ứng ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) PHẢN ỨNG RPR * Mục đích: phát (định tính) KT  / huyết thanh, huyết tương BN * Nguyên lý : phản ứng ngưng kết (agglutination) thụ động KN / hạt than nhỏ (giá khoác) + KT / mẫu  Ngưng kết * Nhắc lại Kỹ thuật  bệnh  : •  trực tiếp: phát VK T pallidum /   I +  bẩm sinh • - Soi tươi = KHV đen - nhuộm bạc (Fontana – Tribondeau) •  gián tiếp: phát KT  /   II, III + KN = cardiolipin (lipoid): ( quan sát (qs) = mắt thường) - VDRL: KN + KT/BN - RPR: KN/hạt than nhỏ + KT/BN + KN = VK T pallidum: - TPI: KN + KT/BN + BT  qs = KHV đen - FTA ABS: KN + KT/BN + KT*  qs = KHV HQ - TPHA: KN/HC + KT/BN  qs = mắt thường Thực RPR: Vật liệu Sinh phẩm: - KN (đã biết) = Cardiolipin / hạt than nhỏ   khác biệt phản ứng (+) (-)  quan sát = mắt thường - KT: huyết tương, huyết BN - Chứng (+), chứng (-) RPR test Card Micropipette Máy lắc vòng Thực RPR (kiến tập) Chứng (+): - hút 50 l mẫu chứng (+) nhỏ vào ô tròn /card test - nhỏ tiếp giọt KN vào ô tròn có chứng (+) - trộn hỗn dịch đầu côn - thay đầu côn Chứng (-): - hút 50 l mẫu chứng (-), nhỏ vào ô tròn lại/card test - nhỏ thêm giọt KN vào ô tròn có chứng (-) - đặt card test lên máy lắc vòng, lắc 10‘ Thực RPR: Đọc kết Mẫu chứng (+): Có hạt ngưng kết nhỏ, màu đen Mẫu chứng (-): Huyền dịch đồng nhất, màu đen (không ngưng kết) Thực RPR: Biện luận kết - RPR & tests MD không dùng KN VK:  đặc hiệu, (+) giả do: + sốt rét, lao, sởi, thận hư nhiễm mỡ, lupus, + phụ nữ có thai  tháng, người già  Cần: - Kết hợp lâm sàng, tiền sử - (+): test đặc hiệu  (TPI, FTA ABS, TPHA) 2 PHẢN ỨNG ELISA * Mục đích: định lượng KN KT hòa tan / dịch sinh học * Nguyên lý bản: KT/pha rắn + KN/mẫu + KTE + Subtrate (cơ chất) KN/pha rắn + KT/mẫu +  KTE + Subtrate  màu: So màu (mắt / máy đo OD) * Kỹ thuật thực hiện: • - ELISA "Cạnh tranh” - ELISA "Không cạnh tranh“: + ELISA“sandwich” + MAC- ELISA a MD cạnh tranh ELISA: Nguyên lý kỹ thuật định lượng KT Phủ KN biết bề mặt giếng KT / mẫu + KN biết / bề mặt giếng KT biết có enzyme + KN lại/giếng Rửa, cho TMB  giếng phản ứng: chuyển màu xanh TMB Cho H2SO4 giếng phản öùng: maøu vaøng.H SO max = 450 - 610nm E E E E E E E E E E E E E E E b ELISA theo phương pháp “sandwich” c ELISA “Tóm bắt”: MAC-ELISA (IgM antibody capture-ELISA) Đo Mật độ quang (OD) Cơ chất Cộng hợp KN biết IgM /mẫu Kháng IgM * Vật liệu I BỘ PIPETTE II BỘ KÍT ELISA: Gía nhựa 96 giếng phủ KT đơn dòng (anti-HBs) KT gắn men: anti-HBs gắn với peroxidase Cơ chất: TMB Huyết chứng (-): khơng có HBsAg Huyết chứng (+): có HBsAg Dung dịch ngưng phản ứng: HCl, H2SO4 Dung dịch rửa III.DÀN MÁY ELISA: máy ủ, máy rửa, máy đo mật độ quang (OD) * Vật liệu: Giá rắn - phiến nhựa polystyren - Đã gắn HBsAb có nồng độ biết * Vật liệu: DÀN MÁY ELISA Máy ủ Máy đo mật độ quang (OD) Máy rửa * Thực hiện: VI LƯỢNG  CẨN THẬN * Đọc Kết phản ứng ELISA Mắt thường Đọc máy ELISA * Đọc Kết phản ứng ELISA Bằng mắt thường: - Chứng (+): màu vàng - Chứng (-): không màu / màu vàng nhạt -Mẫu thử (+) tính: màu vàng đậm -Mẫu thử (-) tính: khơng màu / màu vàng nhạt Bằng máy đọc ELISA: * Gọi: OD (optic density): độ hấp thu mẫu thử COV (cut - off value): giá trị ngưỡng phát * Kết ghi nhận sau: - HBsAg (+) : OD  COV - HBsAg () : OD < COV - Nghi ngờ (): OD = COV  10%  làm lại phản ứng NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ - Mục đích thử nghiệm: phát & bán định lượng HBsAg / dịch sinh học -  (+): + không dựa vào test + nên phối hợp với TC LS, XN ≠   xác - Kết sai: g/đ rửa không kỹ thuật  phải hút thật trước nhỏ dd rửa / thuốc thử - Xác định tình trạng nhiễm HBV: phải phối hợp dấu ấn HBV≠ (HBc, HBe, KT đặc hiệu) KẾT LUẬN RPR, ELISA: - ứng dụng rộng rãi / vi sinh lâm sàng - công cụ hỗ trợ chẩn đoán nhiều bệnh nhiễm virus, vi khuẩn ... FTA ABS, TPHA) 2 PHẢN ỨNG ELISA * Mục đích: định lượng KN KT hòa tan / dịch sinh học * Nguyên lý bản: KT/ pha rắn + KN/ mẫu + KTE + Subtrate (cơ chất) KN/ pha rắn + KT/ mẫu +  KTE + Subtrate  màu:... gián tiếp: phát KT  /   II, III + KN = cardiolipin (lipoid): ( quan sát (qs) = mắt thường) - VDRL: KN + KT/ BN - RPR: KN/ hạt than nhỏ + KT/ BN + KN = VK T pallidum: - TPI: KN + KT/ BN + BT  qs... TẬP Phản ứng RPR (Rapid Plasma Reaction) Phản ứng ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) PHẢN ỨNG RPR * Mục đích: phát (định tính) KT  / huyết thanh, huyết tương BN * Nguyên lý : phản ứng