CHUẨN hóa cây CON LAN hồ điệp (PHALAENOPSIS AMABILIS) có NGUỒN gốc từ tế bào đơn PHỤC vụ CÔNG tác NHÂN GIỐNG

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 11(4): 705-716, 2013 CHUẨN HÓA CÂY CON LAN HỒ ĐIỆP (PHALAENOPSIS AMABILIS) CÓ NGUỒN GỐC TỪ TẾ BÀO ĐƠN PHỤC VỤ CÔNG TÁC NHÂN GIỐNG Trịnh Thị Lan Anh1, Hồ Thanh Tâm2, Lê Kim Cương2, Nguyễn Bá Nam2, Nguyễn Thị Thanh Hiền3, Võ Thị Bạch Mai1, Dương Tấn Nhựt2 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trường Đại học Tơn Đức Thắng TĨM TẮT Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis amabilis) loài hoa có giá trị kinh tế cao khó nhân giống Cho đến nay, có nhiều phương pháp khác nghiên cứu tái sinh lan Hồ Điệp hình thành protocorm-like-body (PLB), nhân nhanh chồi, ni cấy callus Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu tái sinh từ huyền phù tế bào đơn chuẩn hóa in vitro Trong nghiên cứu này, chồi lan Hồ Điệp có nguồn gốc từ tế bào đơn chuẩn hóa thành hoàn chỉnh, đảm bảo tiêu chuẩn phục vụ cho cơng tác nhân giống Ảnh hưởng hàm lượng chất khống, mật độ mẫu cấy, tuổi lên sinh trưởng điều kiện in vitro ảnh hưởng kích thước in vitro lên khả sinh trưởng phát triển giai đoạn vườn ươm khảo sát Sau hai tuần, có nguồn gốc từ tế bào đơn lan Hồ Điệp cảm ứng với môi trường nuôi cấy bén rễ Sang tuần thứ tư có tượng kéo dài rễ, gia tăng đường kính Kết nghiên cứu sau tháng cho thấy mơi trường ½MS bổ sung 15% nước dừa phù hợp cho sinh trưởng phát triển in vitro, mật độ mẫu cấy thích hợp mẫu/bình, độ tuổi thích hợp cho cấy chuyền tháng tuổi, kích thước phù hợp cm Các khoảng cm thích hợp để trồng vườn ươm Từ khóa: con, chuẩn hóa, lan Hồ Điệp, nhân giống, tế bào đơn, vườn ươm MỞ ĐẦU Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) lồi hoa có màu sắc phong phú, giàu sức quyến rũ, lồi hoa có giá trị kinh tế cao thị trường hoa chậu hoa cắt cành giới Tuy nhiên, lan Hồ Điệp lan Hài (Paphiopedium sp.) hai lồi lan khó nhân giống Khó khăn lớn nhân giống vơ tính Phalaenopsis nguồn mẫu hạn chế chúng loài đơn thân, sử dụng chồi đỉnh để nhân giống loài lan khác làm tổn thương mẹ Vì vậy, việc nghiên cứu nhân giống lan Hồ Điệp trọng Cho đến nay, có nhiều phương pháp khác nghiên cứu tái sinh lan Hồ Điệp hình thành protocorm-like-body (PLB), nhân nhanh chồi, nuôi cấy callus (Arditi and Ernst, 1993; Ishii et al., 1998; Park et al., 2003) Tuy nhiên, khơng phải tất phương pháp sử dụng cho vi nhân giống thương mại hình thành PLB, tái sinh tỷ lệ sống sót phương pháp khác Hầu hết phương pháp nhân giống lan Hồ Điệp trọng đến hình thành PLB, phát sinh phơi vơ tính, tái sinh từ PLB phơi vơ tính mà chưa có nhiều nghiên cứu tái sinh từ huyền phù tế bào chuẩn hóa in vitro Trong nghiên cứu này, khảo sát sinh trưởng phát triển có nguồn gốc từ tế bào đơn ni cấy huyền phù tế bào nhằm chuẩn hóa con, tạo đồng nhất, chất lượng cao, phục vụ công tác nhân giống VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP Nguồn mẫu Nguồn mẫu sử dụng thí nghiệm có nguồn gốc từ tế bào đơn lan Hồ Điệp (Paphiopedium amabilis) có phịng Sinh học Phân tử Chọn tạo giống trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Môi trường điều kiện ni cấy Tất mơi trường thí nghiệm (MS, ½MS) chứa bình thủy tinh loại 250 ml, thể tích mơi trường 40 ml/bình Mơi trường điều 705 Trịnh Thị Lan Anh et al chỉnh pH = 5,3; sau tồn mơi trường hấp khử trùng autoclave nhiệt độ 121°C, áp suất atm thời gian 20 phút Bố trí thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng khoáng lên khả sinh trưởng điều kiện in vitro Các tháng tuổi, kích thước khoảng cm cấy vào mơi trường MS mơi trường ½MS có bổ sung nước dừa với tỷ lệ khác (10%, 15%, 20%) kết hợp với 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 30,0 g/l sucrose; 9,0 g/l agar; 1,0 g/l than hoạt tính nhằm để khảo sát ảnh hưởng việc thay đổi hàm lượng nước dừa, hàm lượng khoáng đa lượng lên khả sinh trưởng in vitro Khảo sát ảnh hưởng mật độ cấy chuyền lên khả sinh trưởng điều kiện in vitro Các tháng tuổi, kích thước cm cấy vào bình tích 250 ml mơi trường ½MS có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 20% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l than hoạt tính; 9,0 g/l agar; pH = 5,3 với mật độ khác (1, 2, 3, 4, cây/bình) Khảo sát ảnh hưởng kích thước lên sinh trưởng chúng điều kiện in vitro Các tháng tuổi với kích thước khác (1, 2, 3, cm/cây) cấy chuyền sang môi trường ½MS có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 20% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l than hoạt tính; 9,0 g/l agar; pH = 5,3 Khảo sát ảnh hưởng tuổi cấy chuyền lên sinh trưởng chúng điều kiện in vitro Các có độ tuổi khác (2, 3, tháng tuổi) cấy vào bình tích 250 ml (kích thước cm, cấy bình) mơi trường ½MS có bổ sung 2,0 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 20% nước dừa (v/v); 30,0 g/l sucrose; 1,0 g/l than hoạt tính; 9,0 g/l agar; pH = 5,3 Khảo sát ảnh hưởng kích thước lên khả sinh trưởng phát triển chúng giai đoạn vườn ươm Cây sau tháng nuôi cấy in vitro với kích thước khác chuyển trồng ex vitro điều kiện vườn ươm Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Chúng tiến hành theo dõi sáu kích thước sau in vitro điều kiện 706 vườn ươm: kích thước lớn: 7,23 ± 0,81 cm; có kích thước vừa: 5,47 ± 0,60 cm; kích thước trung bình: 4,17 ± 0,43 cm; kích thước nhỏ vừa: 2,73 ± 0,51 cm; kích thước nhỏ trung bình: 1,95 ± 0,37 cm; kích thước nhỏ nhất: 1,01 ± 0,23 cm Cây trồng vỉ xốp, thời gian đầu để nơi ánh sáng để tránh ánh nắng trực tiếp chiếu vào cây, tưới phun sương lần/ngày (trong tuần đầu) để giữ độ ẩm cho (khi tưới lưu ý không để nước đọng nhiều con, dễ bị thối ngọn, thối rễ dẫn đến chết) Số lần tưới nước ngày nhiều, lượng nước cho lần tưới cịn nhỏ Sau tưới lần/ngày vào khoảng từ – 10 ngày Sau trồng vỉ xốp khoảng tháng, chuyển nơi có ánh sáng nhiều lúc ban đầu (vẫn điều kiện vườn ươm có che chắn, che sáng 70%) Lúc quen dần với điều kiện ex vitro, lượng nước lần tưới tăng lên số lần tưới giảm Khi hai tháng tuổi, chuyển từ vỉ xốp trồng vào chậu nhựa, chậu thường có lỗ nhỏ đáy chậu để đảm bảo nước tránh cho khơng bị úng (với giá thể trồng lan Hồ Điệp chậu nhựa dớn New Zealand) Tiếp tục chăm sóc, tưới nước, nhổ cỏ, bón phân, phun thuốc diệt nấm, bệnh cho tuần lần Theo dõi sinh trưởng phát triển Chỉ tiêu theo dõi xử lý số liệu Mỗi thí nghiệm tiến hành lần, lần tiến hành 25 bình ni cấy với mẫu/bình Xử lý số liệu thu phần mềm MicroSoft Excel® 2003 Tất số liệu sau thu thập ứng với tiêu theo dõi, thống kê biểu diễn dạng trung bình mẫu ± độ lệch chuẩn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sau hai tuần cấy chuyền, có nguồn gốc từ tế bào đơn lan Hồ Điệp cảm ứng với môi trường nuôi cấy bén rễ Sang tuần thứ tư có tượng kéo dài rễ, gia tăng đường kính lá, tất nghiệm thức khỏe, có xanh tốt, rễ khỏe Tuy nhiên, gia tăng kích thước nghiệm thức có khác Sau ba tháng ni cấy tiến hành thu nhận kết Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 11(4): 705-716, 2013 Ảnh hưởng hàm lượng khoáng lên khả sinh trưởng điều kiện in vitro Khi nuôi cấy mơi trường ½MS MS, việc bổ sung 15% nước dừa vào môi trường nuôi cấy cho khả sinh trưởng tốt Cây mơi trường có bổ sung nước dừa với nồng độ 10, 15 20% cho thấy khác rõ rệt tiêu sinh trưởng Tuy nhiên, nhìn chung hình thái, màu sắc môi trường MS xanh đậm hơn, mướt Về mặt cảm quan, nuôi cấy môi trường ½MS cho khỏe hơn, rễ khỏe hơn, hơn, dày hơn, có màu sắc gần với bên tự nhiên Ở nghiệm thức ½MS bổ sung 15% nước dừa, sinh trưởng tốt nhất, tiêu sinh trưởng trọng lượng tươi (2,939 g/cây), chiều cao (6,294 cm/cây), chiều dài rễ (4,925 cm/rễ), đường kính (1,938 cm/lá) cao Các đặc điểm hình thái cho thấy khỏe với rễ khỏe, xanh bóng, dày, mép mặt non có nhiều sắc tố màu tím (Bảng 1, Hình 1) Trong ni cấy in vitro, thành phần khống có vai trò quan trọng việc sinh trưởng phát triển Một số nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng khoáng đến khả sinh trưởng phát triển in vitro cho thấy sâm Ngọc Linh sinh trưởng phát triển môi trường SH tốt MS ½MS (Nhut et al., 2009) Bên cạnh đó, nước dừa đóng vai trị quan trọng phát triển in vitro, nguồn cung cấp đạm dồi thành phần nước dừa có chứa nhiều acid amin, acid hữu cơ, sucrose, fructose glucose Nước dừa sử dụng rộng rãi nuôi cấy lan (Ernst, 1967; Hegarty, 1955; Luận et al., 2012) Tóm lại, thí nghiệm này, sinh trưởng mơi trường ½MS tốt môi trường MS Các sinh trưởng mơi trường MS giàu khống, đó, mướt non hơn, điều làm cho khó thích nghi ngồi vườn ươm, nhanh nước Ở mơi trường ½MS mơi trường MS bổ sung 15% nước dừa cho khả sinh trưởng tốt hơn; đó, nghiệm thức ½MS bổ sung 15% nước dừa tốt Hơn nữa, mơi trường ½MS lại cho hiệu kinh tế cao nguồn chi phí cho thành phần khống mơi trường giảm phân nửa Bảng Ảnh hưởng hàm lượng khoáng đa lượng kết hợp với thay đổi hàm lượng nước dừa, NAA, BA, sucrose cố định lên sinh trưởng sau tháng ni cấy Khống Nước dừa Trọng lượng Số lượng tươi (g) lá/cây Số lượng rễ/cây Chiều cao (cm) Chiều dài rễ (cm) MS 10% 1,552± 0,59 3,20 ± 0,54 6,93 ± 2,21 3,03 ± 0,58 3,65 ± 0,92 MS 15% 2,939 ± 0,78 3,69 ± 0,68 9,63 ± 2,12 6,30 ± 0,99 4,93 ± 1,46 MS 20% 1,776 ± 1,01 3,53 ± 1,03 8,17 ± 2,04 3,87 ± 1,10 4,02 ± 0,80 ½MS 10% 1,591 ± 0,46 4,20 ± 0,75 9,20 ±1,80 4,29 ±0,72 2,82 ± 0,66 ½MS ½MS 15% 20% 1,799 ±0,41 4,30 ± 0,66 1,475 ± 0,44 3,80 ± 0,83 9,00 ± 1,88 8,14 ± 1,89 4,49 ± 1,32 4,19 ± 0,90 Đường kính Đặc điểm (cm) Cây khỏe, sức 1,387 ± 0,27 sống tốt Cây khỏe, mập, mặt có 1,938± 0,35 nhiều sắc tố tím, phiến dày Cây khỏe, to tròn, mặt mép 1,523 ± 0,32 có nhiều sắc tố tím, phiến dày Cây khỏe, chắc, gốc to, xanh đậm, mặt 1,407 ± 0,16 mép có nhiều sắc tố màu tím, rễ khỏe 3,16 ± 0,76 Cây khỏe, rễ khỏe, xanh 1,624 ± 0,28 tốt, mặt mép có nhiều sắc tố màu tím 3,03 ± 1,12 Cây khỏe, xanh đậm, mặt 1,392 ± 0,18 mép có nhiều sắc tố tím Ghi chú: Số liệu bảng trình bày giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn 707 Trịnh Thị Lan Anh et al Hình Ảnh hưởng hàm lượng khoáng kết hợp với tỷ lệ nước dừa lên sinh trưởng lan Hồ Điệp in vitro sau tháng nuôi cấy a1, a2, a3: môi trường khống ½MS có bổ sung 10, 15 20% nước dừa; b1, b2, b3: mơi trường khống MS có bổ sung 10, 15 20% nước dừa Ảnh hưởng mật độ cấy chuyền lên khả sinh trưởng điều kiện in vitro Ở thể tích bình ni cấy (bình thủy tinh 250 ml), thể tích mơi trường (40 ml), mật độ thấp khả sinh trưởng cao, khả sinh trưởng giảm dần mật độ tăng dần, khả sinh trưởng có mối tương quan nghịch với mật độ ni cấy (Bảng 2, Hình 2) Ở nghiệm thức bình, tiêu sinh trưởng cao so sánh với nghiệm thức lại Ở mật độ này, sinh trưởng mạnh Các đặc điểm hình thái sau: mập, phiến dày, có nhiều sắc tố màu tím mép mặt lá, khỏe, rễ khỏe dài xanh, bóng mượt, phiến phẳng bóng, đặc biệt sắc tố có nhiều mặt non Sở dĩ, nghiệm thức sinh trưởng phát triển tối đa mật độ thấp (1 cây/bình), nghiệm thức cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng khoảng khơng gian Vì vậy, có điều kiện để tiếp nhận nguồn ánh sáng chiếu đến nhiều nên khả quang hợp tốt hơn, không xảy tượng cạnh tranh mặt dinh dưỡng hay 708 tượng che bóng lẫn dẫn đến thiếu nhu cầu ánh sáng cần thiết cho quang hợp, khơng có tượng cạnh tranh không gian khiến cho mọc chen chúc Điều quan trọng thân lan Hồ Điệp loại tự che bóng cao Hồ Điệp dạng lớn, dày, khơng phân thùy, phiến có kích thước lớn, chúng lại mọc song song thành hai hàng nên phía thường che phía dẫn đến ánh sáng chiếu đến Hồ Điệp không giống nhau, phía cung cấp ánh sáng nhiều hơn, đầy đủ hơn, cịn phía nhận ánh sáng thường ánh sáng tán xạ Các phần khác nhận lượng ánh sáng chiếu đến khác nhau, thường phần xa trục thân nhận nhiều ánh sáng hơn, cịn sát trục thân nhận ánh sáng Do vậy, suất quang hợp phần khác khác khác khác nhau, phần phía ngồi phía quang hợp tốt Chính vậy, mật độ cao che bóng nhiều sinh trưởng chủ yếu cạnh tranh nhu cầu ánh sáng cần thiết cho trình quang hợp Ở nghiệm thức cây/1 bình, kết thí nghiệm cho thấy, nghiệm thức sinh trưởng tốt, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 11(4): 705-716, 2013 trọng lượng tươi (2,939 g/cây), số lượng rễ (9,63 rễ/cây), đường kính (1,94 cm/lá) có thấp nghiệm thức cây/bình cây/bình, chênh lệch không nhiều Các tiêu khác số lượng (3,69 lá/cây), chiều cao (6,30 cm/cây), chiều dài rễ (4,93 cm/rễ) ngược lại, cao mật độ cây/bình, chênh lệch khơng nhiều (Bảng 2) Các đặc điểm hình thái cho thấy khỏe, mập, rễ khỏe, xanh bóng, dày Sự chênh lệch không nhiều tiêu sinh trưởng nghiệm thức cây/bình cây/bình cho thấy mật độ ni cấy ảnh hưởng đến khả sinh trưởng giới hạn định đó, thay đổi mật độ nuôi cấy chưa ảnh hưởng nhiều đến khả sinh trưởng con, kích thước nghiệm thức cây/bình, cây/bình cây/bình khơng khác nhiều Xét hiệu kinh tế, mật độ cấy cây/bình cho hiệu cao hơn, tiết kiệm chi phí Khi tăng số lượng lên 4, bình, tiêu theo dõi sinh trưởng giảm rõ rệt thấp ba nghiệm thức nhiều Chiều cao chiều dài rễ gần nhau, nuôi cấy với mật độ có rễ dài Về đặc điểm hình thái: khỏe, rễ khỏe, khỏe, xanh, bóng mượt, phiến lá, dày, phẳng bóng, có nhiều sắc tố màu tím mép mặt lá, đặc biệt sắc tố có nhiều mặt non Kết Mustafa đồng tác giả (2011) ghi nhận tăng mật độ mẫu cấy trụ mầm Linum usitatissimum L số chồi chiều cao chồi gia tăng, nhiên khả sinh trưởng giảm Trong thí nghiệm Hạnh đồng tác giả (2013) cho thấy lan Kim Hài sinh trưởng tốt mật độ cây/bình, tăng mật độ sinh trưởng dần Thí nghiệm cho thấy mật độ cấy chuyền quan trọng chúng ảnh hưởng đến phát triển Trong nhân giống thương mại, cần tạo có chất lượng tốt, đồng mặt di truyền mặt hình thái nhằm tạo hàng loạt giống chất lượng cao sinh trưởng phát triển tốt điều kiện vườn ươm Vì vậy, nghiên cứu tối ưu hóa mơi trường cấy chuyền đáp ứng yêu cầu Hơn nữa, việc nghiên cứu nhằm mục đích tiết kiệm chi phí sản xuất mà đạt chất lượng khỏe mạnh mong muốn Vì cấy chuyền mật độ thấp hay cao không mang lại hiệu kinh tế Mặc dù mật độ thấp sinh trưởng tốt lại tốn chi phí nhân cơng cấy chuyền, chi phí bình, mơi trường ni cấy diện tích phịng, dàn ni Trong đó, mật độ cấy chuyền cao, sinh trưởng Vì vậy, việc tìm hiểu mật độ phù hợp cho loại bình ni cấy cần thiết Đối với lan Hồ Điệp, với bình ni cấy 250 ml, 40 ml môi trường, cấy bình tốt Bảng Ảnh hưởng mật độ cấy chuyền lên khả sinh trưởng điều kiện in vitro Trọng lượng Số lá/cây tươi (g) Số rễ/cây Chiều cao (cm) Chiều dài rễ Đường kính (cm) (cm) 5,933 ± 0,96 4,600 ± 0,80 12,200 ± 2,79 8,760 ± 0,94 6,900 ± 2,94 2,200 ± 0,26 Đặc điểm Cây mập, xanh đậm, phiến dày, nhiều sắc tố tím mặt dưới, cây, rễ khỏe 3,545 ± 0,74 3,500 ± 0,67 9,700 ± 2,19 6,190 ± 0,85 4,370 ± 1,05 2,170 ± 0,22 Cây mập khỏe, xanh đậm, nhiều sắc tố tím mặt 2,939 ± 0,78 3,688 ± 0,68 9,625 ± 2,12 6,294 ± 0,99 4,925 ± 1,46 1,938 ± 0,35 Cây khỏe, mập, mặt có nhiều sắc tố tím 1,832 ± 0,42 3,467 ± 0,50 7,733 ± 2,24 4,500 ± 0,64 4,360 ± 1,59 1,707 ± 0,28 Cây mập khỏe, nhiều sắc tố tím 1,766 ±0,44 3,33 ± 0,60 8,667 ± 1,58 4,073 ± 0,90 3,613 ± 1,14 1,053 ± 0,33 Cây chắc, cong queo, rễ héo, nhiều sắc tố tím Ghi chú: NT: nghiệm thức; số liệu bảng trình bày giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn 709 Trịnh Thị Lan Anh et al Hình Ảnh hưởng mật độ cấy chuyền lên khả sinh trưởng điều kiện in vitro a: cây/bình; b: cây/bình; c: cây/bình; d: cây/bình; e: cây/bình 710 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 11(4): 705-716, 2013 Ảnh hưởng kích thước lên sinh trưởng chúng điều kiện in vitro Các tiêu theo dõi cho thấy kích thước cấy chuyền đóng vai trị định q trình sinh trưởng, kích thước q nhỏ hay q lớn khơng cho khả sinh trưởng tối ưu Nhìn chung, khả sinh trưởng tăng dần kích thước tăng, nhiên đến giới hạn định giảm xuống, có kích thước lớn cấy chuyền thường gia tăng kích thước rễ nhiều Ở nghiệm thức chiều cao cm, mẫu cấy sinh trưởng tốt nhất, tiêu theo dõi sinh trưởng trọng lượng tươi (2,939 g/cây), số lượng (3,688 lá/cây), số lượng rễ (9,625 rễ/cây), chiều cao (6,294 cm/cây), chiều dài rễ (4,925 cm/rễ), đường kính (1,938 cm/lá) cao Các đặc điểm hình thái cho thấy khỏe, rễ khỏe, xanh bóng, dày, mép mặt non có nhiều sắc tố màu tím Như vậy, có kích thước cm cấy chuyền cho khả sinh trưởng tối ưu (Bảng 3, Hình 3) Kết nghiên cứu Luận đồng tác giả (2012, 2013) cho thấy chồi lan Vân Hài cm thích hợp cho sinh trưởng phát triển in vitro Qua thí nghiệm này, nhìn chung lan Hồ Điệp tất kích thước sinh trưởng tương đối tốt, tốt, khỏe, hình dạng, màu sắc bình thường Mặc dù nghiệm thức chiều cao cm có sinh trưởng mạnh hơn, chiều cao từ lúc cấy chuyền đến thời điểm thu số liệu tăng gấp 2,19 lần so với ban đầu, kích thước sau ba tháng nhỏ, nên thời gian để đạt tiêu chuẩn có chất lượng tốt chuyển vườn ươm phải để sinh trưởng lâu (tuy nhiên, chất dinh dưỡng yếu tố cần thiết bổ sung môi trường nuôi cấy cạn kiệt) phải cấy chuyền Ở kích thước (cây cao 4,38 cm) việc cấy chuyền lại không cho khả sinh trưởng tối ưu (xem nghiệm thức cm) Vì vậy, nghiệm thức cho khả sinh trưởng tốt kích thước cấy chuyền cm, nghiệm thức này, sau cấy chuyền tháng chiều cao tăng gấp 2,1 lần so với ban đầu Bảng Ảnh hưởng kích thước lên sinh trưởng điều kiện in vitro Chiều cao chồi Trọng lượng tươi Số lá/cây (g/cây) Số rễ/cây Chiều cao (cm) Đường Chiều dài rễ kính (cm) (cm) cm 1,245 ±0,32 3,87 ± 0,81 6,40± 1,96 2,99 ± 0,60 2,96 ± 1,00 1,46 ± 0,26 cm 1,654 ± 0,36 3,47 ± 0,72 6,33 ± 2,09 4,38 ±0,74 3,45 ±1,32 cm 2,939 ± 0,78 3,69 ± 0,68 9,63 ± 2,12 6,30 ± 0,99 4,93 ± 1,46 1,94 ± 0,35 cm 2,204 ± 0,98 3,67 ± 0,70 8,60 ± 2,12 4,95 ±0,77 5,61 ± 1,73 1,62 ± 0,32 1,73 ± 0,22 Đặc điểm Lá trịn, mặt có nhiều sắc tố tím, rễ dài, khỏe Cây khỏe, mặt mép nhiều sắc tố tím Cây khỏe, mập, mặt nhiều sắc tố tím Cây bình thường, rễ dài, nhiều lơng hút, sắc tố tím mặt Ghi chú: Số liệu bảng trình bày giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Hình Ảnh hưởng kích thước lên khả sinh trưởng lan Hồ Điệp in vitro a1: cm, a2: cm, a3: cm, a4: cm 711 Trịnh Thị Lan Anh et al Ảnh hưởng tuổi cấy chuyền lên sinh trưởng chúng điều kiện in vitro Tuổi có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng chúng Từ bảng cho thấy độ tuổi khác phận chúng có tốc độ sinh trưởng khác Thơng thường có độ tuổi nhỏ khả sinh trưởng chiều cao cây, gia tăng đường kính lá, trọng lượng tươi nhiều hơn, ngược lại độ tuổi lớn, lại gia tăng chiều dài rễ Cụ thể sau: Ở nghiệm thức tháng tuổi, tiêu chiều dài rễ (4,925 cm/rễ) thấp nhất, tiêu khác trọng lượng tươi (2,939 g/cây), số lượng (3,688 lá/cây), số lượng rễ (9,625 rễ/cây), chiều cao (6,924 cm/cây), đường kính (1,938 cm/lá) cao Các nghiệm thức sinh trưởng tốt nhất, đặc điểm hình thái sau tháng sau: khỏe, rễ khỏe, xanh bóng, dày, mép mặt non có nhiều sắc tố màu tím Như vậy, độ tuổi tháng cấy chuyền có cho khả sinh trưởng tối ưu (Bảng 4, Hình 4) Kết phù hợp với nghiên cứu Nhựt đồng tác giả (2010) nhân giống Địa lan, lan Hài, nghiên cứu Luận đồng tác giả (2012) đối tượng lan Vân Hài, nghiên cứu tháng tuổi cho khả sinh trưởng tốt Hình Ảnh hưởng tuổi mẫu cấy lên khả sinh trưởng lan Hồ Điệp in vitro a: tháng tuổi, b: tháng tuổi, c: tháng tuổi 712 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 11(4): 705-716, 2013 Bảng Ảnh hưởng tuổi cấy chuyền lên sinh trưởng chúng điều kiện in vitro Tuổi Trọng lượng Số lá/cây tươi (g/cây) Số rễ/cây Chiều cao Chiều dài rễ (cm) (cm) Đường kính Đặc điểm (cm) tháng 2,939 ± 0,78 3,688 ± 0,68 9,625 ± 2,12 6,294 ± 0,99 4,925 ± 1,46 Cây khỏe, mập, 1,938 ± 0,35 mặt có nhiều sắc tố tím tháng 2,209 ± 0,63 3,333 ± 0,70 9,067 ± 2,14 4,500 ± 0,92 5,273 ± 1,49 Cây bình thường, 1,613 ± 0,22 có nhiều cưa, rễ dài héo 5,527 ± 1,81 Cây bình thường, cong, già cỗi, có 1,407 ± 0,38 nhiều cưa, rễ dài, bị héo, nhiều lông hút rễ tháng 2,138 ± 0,68 3,33 ± 0,79 7,600 ± 2,19 4,007 ± 0,70 Ghi chú: Số liệu bảng trình bày giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn; NT: nghiệm thức Thí nghiệm cho thấy việc xác định độ tuổi cấy chuyền quan trọng, cấy chuyền khoảng tháng tuổi cho khả sinh trưởng tốt Điều độ tuổi có sức sống tốt, khả sinh trưởng nhanh Trong đó, tháng tuổi tháng tuổi cấy chuyền khả sinh trưởng chúng thấp hơn, việc để lâu mơi trường ni cấy cạn kiệt dinh dưỡng, yếu tố đảm bảo cho sinh trưởng khơng cịn đáp ứng được, thay tiếp tục gia tăng trọng lượng tươi số lại gia tăng kích thước rễ, số lượng rễ, quan bị tiêu giảm dần để giải phóng lượng nhằm trì sống cho Một số lại xuất đặc điểm bất thường hình thái xuất cưa mép Nếu để đến giai đoạn cấy chuyền khả phục hồi sinh trưởng thấp chúng bị stress dinh dưỡng trước cấy chuyền, quan dinh dưỡng bị già nên khả sinh trưởng thấp Ảnh hưởng kích thước lên khả sinh trưởng phát triển chúng giai đoạn vườn ươm Sau tháng ni cấy in vitro, có nhiều kích thước khác chuyển trồng ex vitro điều kiện vườn ươm Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Ngun, từ xác định kích thước in vitro chuyển vườn ươm cho tỷ lệ sống sót cao nhất, khả sinh trưởng, phát triển tốt Chúng tiến hành theo dõi sáu kích thước sau in vitro điều kiện vườn ươm (Bảng 5, 6, Hình 5) Từ tiêu theo dõi trình bày Bảng 5, 6, Hình cho thấy khả sống sót sinh trưởng in vitro đưa vườn ươm có mối liên quan mật thiết với kích thước chúng chuyển từ ống nghiệm ngồi Nhìn chung, có kích thước lớn, tỷ lệ sống sót khả sinh trưởng tốt, gia tăng chiều cao cây, đường kính nhiều Nhưng ngược lại, có kích thước nhỏ sau 2,5 tháng trồng chăm sóc tỷ lệ chết chúng cao, còi cọc, yếu gần khơng sinh trưởng, chí cịn có biểu lụi dần, cụ thể bị rụng bớt lại không tạo thêm non Trong thí nghiệm này, chúng tơi chia kích thước để theo dõi nhận thấy ban đầu có chiều cao từ cm trở lên cho khả sống sót cao; có chiều cao cm ngược lại, chúng sinh trưởng chậm, tỷ lệ chết cao Điều do, kích thước lớn có xanhh tốt, khỏe, rễ khỏe, già; chuyển trồng ngồi vườn ươm chúng dễ dàng thích nghi Điều kiện ngồi vườn ươm khác biệt nhiều so với điều kiện in vitro môi trường nghèo dinh dưỡng (dớn dùng để trồng lan chủ yếu đóng vai trị giá thể trơ), nhiều nguồn bệnh, thống khí… Ở điều kiện vườn ươm thường dễ bị nước giai đoạn in vitro nuôi cấy hệ thống bình thủy tinh kín, khí khổng ln mở để tăng cường nước qua khí khổng Khi chuyển ngồi vườn ươm, khí khổng trì tình trạng mở nên bị thoát nước liên tục làm cho bị héo dẫn đến tình trạng yếu dần khơng cung cấp đủ nước cho Tuy nhiên, điều quan trọng có khả chống chịu tốt, rễ khỏe đáp ứng nhu cầu thiếu nước trầm trọng này; vậy, in vitro có kích thước lớn, có rễ khỏe, khả chống chịu tốt nên nhanh 713 Trịnh Thị Lan Anh et al chóng phục hồi nhanh bén rễ chuyển vườn ươm Hơn điều kiện bên ngồi thống khí, có lớn nên khả quang hợp tốt, sinh trưởng nhanh gia tăng kích thước nhiều Giai đoạn đầu giai đoạn thích nghi với điều kiện mơi trường ex vitro, sinh trưởng chậm Đây giai đoạn chủ yếu để phục hồi mát việc chuyển từ môi trường lý tưởng mơi trường thực Giai đoạn sau, thích nghi với mơi trường mới, chế độ chăm sóc hợp lý, sinh trưởng mạnh, lớn khả sinh trưởng tăng, tốc độ quang hợp ngày cao (tốc độ quang hợp tỷ lệ thuận với diện tích số lượng cây) Đối với có kích thước q bé, chúng nhạy cảm với thay đổi môi trường xung quanh, nước liên tục làm bị héo nhanh chóng, rễ yếu, khả chống chịu kém; dễ bị chết nước, sâu bệnh cơng, cằn cỗi q trình quang hợp có kích thước nhỏ, môi trường nghèo dinh dưỡng không cung cấp nguồn carbon trực tiếp nên số lại có biểu lụi dần Kết rằng, có kích thước 7,23 ± 0,81 cm; 5,47 ± 0,60 cm; 4,17 ± 0,43 cm cho tỷ lệ sống sót cao, tiêu chiều cao cây, đường kính cao Các đặc điểm hình thái cho thấy khỏe, to, dày, có nhiều sắc tố màu tím hồng mặt lá, có màu xanh tự nhiên, khơng cịn xanh đậm ni cấy in vitro Điều mơi trường bên ngồi có ánh sáng tự nhiên với cường độ cao hơn, có chứa tia sáng thích hợp cho q trình quang hợp so với ánh sáng bóng đèn huỳnh quang trắng phịng ni Dưới ánh sáng trắng đèn huỳnh quang, không tổng hợp nhiều diệp lục (các ưa bóng có màu xanh đậm so với ưa sáng) Đối với có kích thước cịn lại, sau trồng chăm sóc 2,5 tháng đa số bị chết, tỷ lệ sống sót thấp, kích thước nhỏ tỷ lệ chết cao, cụ thể có kích thước 2,73 ± 0,51 cm có tỷ lệ sống sót thấp (14,74%), sinh trưởng chậm, yếu, xấu, cằn cỗi, bị úa, bị chết Cây kích thước 1,95 ± 0,37 cm, tỷ lệ sống sót 20,28%, sinh trưởng chậm, xấu cằn cỗi, yếu, bị úa, bị chết Tương tự có kích thước 1,01 ± 0,23 cm, tỷ lệ sống sót 32,57% sinh trưởng chậm Qua việc theo dõi sinh trưởng phát triển vườn ươm cho thấy để tăng tỷ lệ sống sót chuyển vườn ươm cần ý đến kích thước cây, kích thước lớn, tỷ lệ sống sót cao, khả sinh trưởng tốt Như giống tốt đạt chất lượng cao tiêu chí phải quan tâm có kích thước từ cm trở lên, bóng đẹp, dày, màu sắc tự nhiên, khơng có biểu bất thường hình thái, sinh lý… Ngồi việc giống đạt tiêu chuẩn, chế độ chăm sóc ngồi vườn ươm đóng vai trị quan trọng định đến hình thái cây, khả hoa chất lượng hoa sau Bảng Các tiêu ban đầu trước chuyển vườn ươm để theo dõi khả sinh trưởng Loại (cm) Trọng lượng tươi (g) Số lá/cây Chiều cao (cm) Đường kính Số rễ/cây (cm) Chiều dài rễ (cm) Đặc điểm 7,23 ± 0,81 4,302 ± 1,97 3,50 ± 1,01 7,23 ± 0,81 2,089 ± 0,34 8,56 ± 2,99 3,06 ± 1,44 Cây, rễ, to; phiến dày; nhiều sắc tố tím 5,47 ± 0,60 3,076 ± 1,17 2,78 ± 0,92 5,47 ± 0,60 1,717 ± 0,15 7,67 ± 2,19 4,370 ± 1,05 Cây khỏe, xanh đậm, rễ dài, nhiều sắc tố tím 4,17 ± 0,43 2,105 ± 0,55 2,99 ± 0,81 4,17 ± 0,43 1,628 ± 0,21 6,28 ± 2,08 4,307 ± 0,70 Cây khỏe, xanh đậm, rễ dài, nhiều sắc tố tím 2,73 ± 0,51 0,836 ± 0,30 2,72 ± 0,99 2,73 ± 0,51 1,167 ± 0,28 5,00 ± 1,76 3,82 ± 1,03 Cây nhỏ, yếu, nhỏ, mỏng, xanh nhạt, rễ dài 1,95 ± 0,37 0,462 ± 0,25 2,28 ± 0,56 1,95 ± 0,37 0,822 ± 0,24 3,83 ± 1,21 2,02 ± 0,62 Cây nhỏ, yếu, nhỏ, mỏng, xanh nhạt, rễ nhỏ 1,01 ± 0,23 0,134 ± 0,07 1,89 ± 0,66 1,01 ± 0,23 0,517 ± 0,08 2,67 ± 0,82 1,89 ± 0,75 Cây, rễ nhỏ, yếu, nhỏ, mỏng, xanh nhạt Ghi chú: Số liệu bảng trình bày giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Bảng Các tiêu theo dõi sinh trưởng lan Hồ Điệp điều kiện vườn uơm sau 2,5 tháng trồng chăm sóc 714 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 11(4): 705-716, 2013 Chiều cao (cm) Đường kính Tỷ lệ sống Đặc điểm (cm) sót (%) Loại Số lá/cây 7,23 ± 0,81 3,26 ± 0,52 7,35 ± 2,07 2,435 ± 0,41 98,00 Cây sinh trưởng tốt, khỏe, to, dày, có nhiều sắc tố màu tím hồng mặt 5,47 ± 0,60 2,89 ± 0,63 5,53 ± 0,79 2,023 ± 0,39 97,50 Cây sinh trưởng tốt, khỏe, to, dày, có nhiều sắc tố màu tím hồng mặt 4,17 ± 0,43 2,92 ± 0,47 4,26 ± 0,55 1,812 ± 0,62 97,96 Cây sinh trưởng tốt, khỏe, to, dày, có nhiều sắc tố màu tím hồng mặt 2,73 ± 0,51 2,16 ± 0,59 2,90 ± 0,23 0,980 ± 0,71 32,57 Cây yếu, xấu, cằn cỗi, sinh trưởng chậm 1,95 ± 0,37 2,09 ± 1,02 2,07 ± 0,52 0,892 ± 0,57 20,28 Cây sinh trưởng chậm, xấu cằn cỗi, yếu, bị úa, bị chết 1,01 ± 0,23 1,64 ± 0,34 1,40 ± 0,65 0,751 ± ,43 14,74 Cây sinh trưởng chậm, yếu, xấu cằn cỗi, úa, bị chết Ghi chú: Số liệu bảng trình bày giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Hình Theo dõi sinh trưởng lan Hồ Điệp vườn ươm (a, b) ứng dụng quy trình nhân giống vào thương mại (c, d, e, f) KẾT LUẬN Chuẩn hóa in vitro trồng vườn ươm lan Hồ Điệp có nguồn gốc từ tế bào đơn giai đoạn quan trọng công tác chọn tạo giống lồi hoa Kết thí nghiệm cho thấy, mơi trường ½MS bổ sung 15% nước dừa phù hợp cho sinh trưởng phát triển Cây tháng tuổi, kích thước cm, mật độ mẫu/bình thích hợp để ni cấy in vitro Cây tháng tuổi, kích thước khoảng cm phù hợp để trồng vườn ươm Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Lâm Đồng hỗ trợ kinh phí cho chúng tơi thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Arditti J, Ernst R (1993) Micropropagation of Orchids Jonhn Wiley, Son, New York, p 467 Duong Tan Nhut, Vu Quoc Luan, Nguyen Van Binh, Pham Thanh Phong, Bui Ngoc Huy, Dang Thi Ngoc Ha, Phan Quoc Tam, Nguyen Ba Nam, Vu Thi Hien, Bui The 715 Trịnh Thị Lan Anh et al Vinh, Lam Thi My Hang, Duong Thi Mong Ngoc, Lam Bich Thao, Tran Cong Luan (2009) The effects of some factors on in vitro biomass production of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) and preliminary analysis of saponin contents Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(3): 365-378 effect of in vitro competition on shoot regeneration from hypocotyl explants of Linum usitatissimum Turk J Bot 35: 211-218 Dương Tấn Nhựt (2010) Một số phương pháp, hệ thống nghiên cứu Công nghệ sinh học thực vật NXB Nông nghiệp, 51-83, tr 124-127 Trần Thị Bích Hạnh, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Bá Nam, Lê Kim Cương, Nguyễn Phúc Huy, Dương Tấn Nhựt (2013) Ảnh hưởng BA, Kin, TDZ, GA3 mật độ mẫu cấy lên sinh trưởng, phát triển chồi lan Kim hài (Paphiopedilum villosum) nuôi cấy in vitro Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2013 Tr 797-801 Ernst R (1967) Effect of organic nutrient additives on growth in vitro of Phalaenopsis seedings Amr Orch Soc Bull 36: 694-704 Hegarty CP (1955) Observation on the germination of orchid seed Am Orchid Soc Bull 24: 457-464 Ishii Y, Takamura T, Goi M, Tanaka M (1998) Callus induction and somatic embryogenesis of Phalaenopsis Plant Cell Rep 17: 446 Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Plant Physiol 15: 473-497 Mustafa Y, Çağlayan S, Cansu T, Emine GE (2011) The Park SY, Murthy HN, Paek KY (2003) Rapid propagation of Phalaenopsis from floal stalk-derived leaves In vitro Cell Dev Biol Plant 38: 168 Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Hoàng Xuân Chiến, Trịnh Thị Hương, Vũ thị Hiền, Nguyễn Bá Nam, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt (2012) Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Vân Hài (Paphiopedilum callosum) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 10 (3): 487-494 Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt (2013) Tái sinh lan Vân Hài (Paphiopedilum callosum) thông qua mô sẹo từ lát cắt ngang lóng thân ex vitro Báo cáo khoa học Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc 2013: 902-906 STANDARDIZATION OF PHALAENOPSIS AMABILIS PLANT DERIVED FROM SINGLE CELL FOR PLANT PROPAGATION PURPOSE Trinh Thi Lan Anh1, Ho Thanh Tam2, Le Kim Cuong2, Nguyen Ba Nam2, Nguyen Thi Thanh Hien3, Vo Thi Bach Mai1, Duong Tan Nhut2,* University of Science, Vietnam National University, Ho Chi Minh City Tay Nguyen Institute for Scientific Research, Vietnam Academy of Science and Technology Ton Duc Thang University, SUMMARY Phalaenopsis amabilis is one of flowers has high economic value, however propagation this species is difficult So far, there have been different methods of regeneration Phalaenopsis amabilis such as forming Protocorm-like-body (PLB), shoot and callus culture, etc Nevertheless, regeneration Phalaenopsis sp from single cells suspension as well as standardization plant have not been researched yet In this study, shoots of Phalaenopsis amabilis derived from single cell were standardized to plants for plant breeding Effects of mineral concentrations, density of plantlets, and age of shoots on in vitro growth and development as well as effect of the in vitro shoot size on the growth of Phalaenopsis sp in nursery stage were investigated After two weeks, seedlings derived from single cells of Phalaenopsis sp were induced and formed roots To the fourth week, there was an increase in leaves and roots length as well as leaf diameter The results after three months shown that the half strange of MS medium supplement with 15% coconut water (v/v), shoots density was shoots/flask, month-old of shoots, cm height of shoots were the most suitable for plant growth and development The seedlings about cm were the best for growing nursery Keywords: breeding, propagation, Phalaenopsis amabilis, single cell, standardization * Author for correspondence:Tel:+84-63-3831056; Fax:+84-63-3831028;E-mail: duongtannhut@gmail.com 716 ... dụng quy trình nhân giống vào thương mại (c, d, e, f) KẾT LUẬN Chuẩn hóa in vitro trồng vườn ươm lan Hồ Điệp có nguồn gốc từ tế bào đơn giai đoạn quan trọng cơng tác chọn tạo giống lồi hoa Kết... trung bình mẫu ± độ lệch chuẩn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sau hai tuần cấy chuyền, có nguồn gốc từ tế bào đơn lan Hồ Điệp cảm ứng với môi trường nuôi cấy bén rễ Sang tuần thứ tư có tượng kéo dài rễ, gia... cho quang hợp, khơng có tượng cạnh tranh không gian khiến cho mọc chen chúc Điều quan trọng thân lan Hồ Điệp loại tự che bóng cao Hồ Điệp dạng lớn, dày, không phân thùy, phiến có kích thước lớn,