Xây dựng phương pháp xác định một số độc tố vi nấm nhóm alternaria trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ LAN HƯƠNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ VI NẤM NHÓM ALTERNARIA TRONG THỰC PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ LAN HƯƠNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ VI NẤM NHÓM ALTERNARIA TRONG THỰC PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Cao Sơn PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà HÀ NỘI 2022 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Cao Sơn - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà - Trường Đại học Dược Hà Nội, hai thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cơng tác Bộ mơn Hóa phân tích Độc chất dạy giúp đỡ tơi thời gian học tập trường Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tới ThS Vũ Ngọc Tú đồng nghiệp Khoa Độc học dị nguyên - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia động viên, giúp đỡ, chia sẻ với q trình thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè giúp đỡ động viên để tơi có đủ nghị lực, tâm hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 19 tháng năm 2022 Học viên Hoàng Thị Lan Hương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT……………………………………iii DANH MỤC CÁC BẢNG……………………………………… ……………… v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ…………………………………… vi ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung độc tố vi nấm nhóm Alternaria 1.1.1 Khái niệm phân loại độc tố vi nấm nhóm Alternaria 1.1.2 Sự hình thành độc tố vi nấm nhóm Alternaria 1.1.3 Tính chất lý hóa số độc tố vi nấm nhóm Alternaria phổ biến 1.1.4 Độc tính độc tố vi nấm nhóm Alternaria .6 1.2 Phương pháp xác định độc tố vi nấm nhóm Alternaria 1.2.1 Một số kỹ thuật xử lý mẫu .8 1.2.2 Một số phương pháp phát độc tố vi nấm nhóm Alternaria 12 1.2.3 Một số phương pháp định lượng độc tố vi nấm nhóm Alternaria .14 1.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao 17 1.3.1 Nguyên tắc chung 17 1.3.2 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao 18 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 2.1 Đối tượng nghiên cứu .23 2.1.1 Độc tố vi nấm nhóm Alternaria 23 2.1.2 Đối tượng mẫu .23 2.2 Phương tiện nghiên cứu 23 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 23 2.2.2 Dung mơi, hóa chất 24 i 2.2.3 Chất chuẩn 25 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích .26 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 29 2.3.3 Ứng dụng phương pháp xây dựng để phân tích mẫu thực 32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 Xây dựng phương pháp 33 3.1.1 Kết tối ưu điều kiện HRMS 33 3.1.2 Kết tối ưu điều kiện LC .35 3.1.3 Kết khảo sát quy trình xử lý mẫu 37 3.2 Kết thẩm định phương pháp phân tích 44 3.2.1 Độ đặc hiệu 44 3.2.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 46 3.2.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn .49 3.2.4 Độ lặp lại, thu hồi 51 3.3 Kết phân tích mẫu thực tế 54 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 59 4.1 Về đối tượng phương pháp nghiên cứu .59 4.2 Về thẩm định phương pháp phân tích 62 4.3 Về kết phân tích mẫu thực tế 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .64 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt AA CAN ALT AME AOAC AOH APCI APPI ATX CONTAM DAD d-SPE EFSA ELISA EtOAc ESI FA FT-ICR GC HPLC IS iso-TeA LC-HRMS LC-MS/MS LD50 Tiếng Anh tên khoa học Acetic acid Acetonitrile Altenuene Alternariol monomethyl ether Association of Official Analytical Collaboration Alternariol Atmospheric-pressure chemical ionization Atmospheric pressure photoionization ionization Altertoxin Tiếng Việt Acid acetic Acetonitril Altenuen Alternariol monomethyl ete Hiệp hội cộng đồng phân tích thức Alternariol Ion hóa học áp suất khí Ion hóa photon áp suất khí Altertoxin Hội đồng chất gây ô nhiễm Contaminants in the Food Chain chuỗi thực phẩm Diode-Array Detector Detector mảng diod Dispersive solid phase extraction Chiết phân tán pha rắn Cơ quan an toàn thực phẩm European Food Safety Authority châu Âu Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch Enzyme-linked immunoassay liên kết với enzym Ethyl acetate Ethyl acetat Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử Formic acid Acid formic Fourier transform ion cyclotron Cộng hưởng cyclotron ion biến resonance đổi Fourier Gas chromatograph Sắc ký khí High-performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography Internal standard Chuẩn nội Iso-tenuazonic acid Acid iso-tenuazonic Liquid chromatography-high Phương pháp sắc ký lỏng khối resolution mass spectrometry phổ phân giải cao Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng khối phổ hai lần mass spectrometry Liều gây chết 50% số động Lethal dose 50% vật thí nghiệm iii Từ viết tắt LLE LOD LOQ MRM PSA QuEChERS RSD SD SPE SRM TeA TEN TLC TOF USP v/v Tiếng Anh tên khoa học Liquid-liquid extraction Limit of detection Limit of quantification Multiple reaction monitoring Primary Secondary Amine Tiếng Việt Chiết lỏng - lỏng Giới hạn phát Giới hạn định lượng Giám sát đa phản ứng Amin bậc 1, bậc Nhanh chóng - Dễ dàng - Rẻ Quick - Easy - Cheap - Effective - Hiệu - Ổn định - An - Rugged - Safe toàn Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối Standard Deviation Độ lệch chuẩn Solid-phase extraction Chiết pha rắn Selected reaction monitoring Giám sát phản ứng chọn lọc Tenuazonic Acid Acid tenuazonic Tentoxin Tentoxin Thin-Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng Time-of-Flight Thời gian bay United States Pharmacopeia Dược điển Mỹ volume/volume thể tích/thể tích iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo acid tenuazonic Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo alternariol Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo alternariol monomethyl ete Hình 3.1: Sắc ký đồ AOH, AME, TeA nồng độ 300 ng/mL sử dụng pha động khác .36 Hình 3.2: Kết khảo sát 04 quy trình xử lý mẫu cà chua 38 Hình 3.3: Kết khảo sát 04 quy trình xử lý mẫu ngũ cốc 38 Hình 3.4: Kết khảo sát dung mơi chiết cà chua 39 Hình 3.5: Kết khảo sát dung mơi chiết ngũ cốc 39 Hình 3.6: Kết khảo sát dung môi rửa giải .40 Hình 3.7: Kết khảo sát thể tích rửa giải 41 Hình 3.8: Kết khảo sát dung mơi hịa cắn .41 Hình 3.9: Quy trình xử lý mẫu tối ưu 43 Hình 3.10: Sắc ký đồ mẫu trắng, dung dịch chuẩn mẫu thêm chuẩn nồng độ 30 µg/kg TeA cà chua .44 Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu trắng, dung dịch chuẩn mẫu thêm chuẩn nồng độ 30 µg/kg AOH cà chua .45 Hình 3.12: Sắc ký đồ mẫu trắng, dung dịch chuẩn mẫu thêm chuẩn nồng độ 30 µg/kg AME cà chua .45 Hình 3.13: Sắc ký đồ TeA, AOH, AME cà chua ngũ cốc giá trị LOD .47 Hình 3.14: Sắc ký đồ TeA, AOH, AME cà chua ngũ cốc giá trị LOQ .48 Hình 3.15: Đường chuẩn AOH, AME, TeA ngũ cốc .50 Hình 3.16: Sắc ký đồ mẫu H13 dương tính với TeA 56 Hình 3.17: Sắc ký đồ mẫu R17 dương tính với TeA .56 Hình 3.18: Sắc ký đồ mẫu N15 dương tính với AOH 57 Hình 3.19: Sắc ký đồ mẫu H13 dương tính với AOH 57 Hình 3.20: Sắc ký đồ mẫu H13 dương tính với AME 58 Hình 3.21: Sắc ký đồ mẫu H16 dương tính với AME 58 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng độc tố vi nấm nhóm Alternaria 15 Bảng 1.2: So sánh đặc tính số máy phân tích khối phổ phân giải cao [20] .21 Bảng 2.1 Danh mục chất chuẩn 25 Bảng 2.2 Độ độ thu hồi độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) 31 Bảng 3.1 Mảnh phổ thực nghiệm mảnh phổ lý thuyết AOH, AME, TeA 33 Bảng 3.2 Chương trình gradient pha động .37 Bảng 3.3 Thời gian lưu chất phân tích thu dung dịch chuẩn mẫu thêm chuẩn .46 Bảng 3.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng độc tố vi nấm nhóm Alternaria .46 Bảng 3.5 Đường chuẩn độc tố vi nấm nhóm Alternaria 49 Bảng 3.6 Độ lặp lại độ thu hồi AOH 51 Bảng 3.7 Độ lặp lại độ thu hồi AME 52 Bảng 3.8 Độ lặp lại độ thu hồi TeA 53 Bảng 3.9 Kết phân tích sàng lọc mẫu thực tế 54 Bảng 3.10 Kết xác định hàm lượng AOH, AME, TeA mẫu thực tế….…… 55 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Trong chế độ ăn hàng ngày, rau củ, trái cây, ngũ cốc, hạt có dầu sản phẩm chế biến chúng thành phần thiếu Tuy nhiên, giai đoạn phát triển nhiều loại trồng trình thu hoạch, loại thực phẩm dễ bị lây nhiễm loài nấm, đặc biệt nấm Alternaria Hơn nữa, có khả phát triển điều kiện nhiệt độ thấp nên Alternaria gây hỏng sản phẩm trình vận chuyển bảo quản lạnh [10] Sau xâm nhập vào thực phẩm, nấm Alternaria tạo sản phẩm chuyển hóa thứ cấp độc tố vi nấm nhóm Alternaria gồm khoảng 70 hợp chất [12] Trong thử nghiệm in vitro động vật, số hợp chất nhóm alternariol (AOH), alternariol monomethyl ete (AME), acid tenuazonic (TeA) báo cáo gây tác động có hại gen thai nhi Theo Hội đồng chất gây ô nhiễm chuỗi thực phẩm Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu, ngưỡng độc tố cần quan tâm (TTC) cần thiết để đánh giá tương đối mức độ lo ngại phơi nhiễm độc tố vi nấm nhóm Alternaria hàng ngày với giá trị TTC AOH AME 2,5 ng/kg cân nặng/ngày; TeA 1500 ng/kg cân nặng/ngày [10] Ngồi ra, có báo cáo Trung Quốc cho độc tố nhóm Alternaria ngũ cốc nguyên nhân gây bệnh ung thư thực quản [18] Do lo ngại gây ảnh hưởng có hại người sử dụng sản phẩm có chứa độc tố vi nấm nhóm Alternaria hàng ngày thời gian dài nên việc tiến hành nghiên cứu phân tích nhóm độc tố thực phẩm xem mối quan tâm sức khỏe cộng đồng Tính đến nay, chưa có nghiên cứu phương pháp phát định lượng độc tố vi nấm nhóm Alternaria thực phẩm cơng bố Việt Nam Vì vậy, tiến hành thực đề tài: "Xây dựng phương pháp xác định số độc tố vi nấm nhóm Alternaria thực phẩm sắc ký lỏng khối phổ" với mục đích xây dựng phương pháp phân tích đáp ứng quy định hành phù hợp với điều kiện thực tế phịng thí nghiệm, góp phần kiểm sốt độc tố vi nấm nhóm Alternaria thực phẩm, tránh gây ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe người sử dụng đồng thời phục vụ cho hoạt động xuất Phụ lục 2: Đường chuẩn cà chua Đường chuẩn AOH, AME, TeA cà chua Phụ lục 3: Sắc ký đồ số mẫu khảo sát * Khảo sát quy trình chiết * Khảo sát dung mơi chiết * Khảo sát dung môi rửa giải * Khảo sát dung mơi hịa cắn Phụ lục 4: Sắc ký đồ số mẫu thẩm định ... là: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định số độc tố vi nấm nhóm Alternaria (AOH, AME, TeA) thực phẩm sắc ký lỏng khối phổ Ứng dụng phương pháp xây dựng để xác định số độc tố vi nấm nhóm Alternaria. .. độc tố vi nấm nhóm Alternaria 1.1.3 Tính chất lý hóa số độc tố vi nấm nhóm Alternaria phổ biến 1.1.4 Độc tính độc tố vi nấm nhóm Alternaria .6 1.2 Phương pháp xác định độc tố vi. .. nghiên cứu xác định số độc tố vi nấm nhóm Alternaria 1.2.3 Một số phương pháp định lượng độc tố vi nấm nhóm Alternaria Theo EFSA (2016) có số kỹ thuật sắc ký phù hợp để định lượng độc tố nhóm Alternaria