Nghiên cứu, xây dựng và ứng dụng phương pháp xác định đồng thời các hoạt chất vitamin b1, b2 trong thuốc vitamin tổng hợp bằng phương pháp cực phổ xung vi phân

MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Năm 1890, nhà bác học Nga N.I.Luin thực nghiệm chuột bạch chứng minh sữa, casein, chất béo, đường lactose muối cịn có chất khác vô quan trọng, cần thiết cho hoạt động chuột Năm 1897, bác sỹ người Hà Lan phát rằng, cho gà ăn gạo xay xát kỹ dẫn đến chúng bị viêm nhiễm dây thần kinh Để đề phòng điều trị bệnh phải dùng cám dịch tiết nước từ cám thêm vào thức ăn Ngoài thời gian nhà khoa học quan tâm tới bệnh scorbut Biểu bệnh mao mạch dễ vỡ hay gây chảy máu lợi Trên sở nghiên cứu, bác sỹ rút kết luận, bệnh scorbut xuất thể thiếu chất hữu mà khơng tự tổng hợp được, người ta gọi ‘vitamin’ Như vitamin hợp chất hữu mà thể cần lượng nhỏ quan trọng việc trì q trình chuyển hóa đảm bảo sinh trưởng phát triển bình thường thể Trong số nhóm vitamin B: vitamin B1 (Vit.B1), vitamin B2 (Vit.B2) hợp chất quan trọng người Vitamin B1 tham gia chủ yếu vào q trình chuyển hóa gluxit, có tác dụng chống viêm dây thần kinh Vitamin B1 có nhiều ngũ cốc gạo, loại hạt, thịt nạc, mầm lúa mì…vitamin B1 cần thiết cho hệ tiêu hóa , giúp thể hấp thụ chất dinh dưỡng tốt hơn, thiếu vitamin B1 gây bệnh beri-beri Vitamin B2 vào thể bị photphosryl chuyển hóa thành coenzim, chúng tham gia xúc tác q trình oxy hóa chuyển hóa hydratcacbon, acid amin cần thiết cho hoạt hóa pyridoxin, biến trytophan thành niamin trì nguyên vẹn hồng cầu Vì vậy, vitamin B2 đóng vai trị quan trọng q trình tổng hợp tế bào hồng cầu thể, vitamin B2 có nhiều trứng, sữa, rau xanh, mát, hay gọi chung sản phẩm từ sữa Với tất tác dụng to lớn mà vitamin mang lại cho người nên sống ngày người thiếu nguồn thực phẩm giàu vitamin rau, củ, quả, nước ép trái cây, sữa,thịt, cá… Ngồi vitamin có sẵn rau, tươi, nước ép trái Để nguồn sử dụng vitamin trở nên dồi dào, đa dạng phong phú người ta sản xuất loại thuốc chứa vitamin để phục vụ cách hữu ích thuận tiện với nhu cầu thiết yếu khác người Thuốc vitamin nghiên cứu cách rộng rãi phối hợp với thành phần khác để tạo nhiều dạng bào chế khác viên nén, viên nang, bột pha hỗn hợp phù hợp thuận tiện cho đối tượng để chăm sóc bảo vệ tốt cho sức khỏe cơng dân Có thể thấy việc sử dụng vitamin cho dù với mục đích bổ dưỡng hay chữa bệnh cần phải cách, liều, khơng gây hậu nghiêm trọng Vì việc xác định hàm lượng chúng dược phẩm địi hỏi có độ xác độ cao Ở Việt Nam việc xác định hàm lượng hợp chất hữu dược phẩm dựa vào nhiều phương pháp phân tích thể tích có độ xác khơng cao, phương pháp đại sắc ký lỏng hiệu cao( HPLC); phương pháp điên di mao quản (CE); phương pháp huỳnh quang tốn Phương pháp cực phổ có nhiều ưu điểm, phương pháp Heyrovsky phát minh (năm 1922, giải Nobel 1959) Đó phương pháp sâu sắc mặt lí thuyết rộng rãi mặt ứng dụng Phương pháp cực phổ áp dụng trước hết lĩnh vực hố phân tích bật phương pháp cực phổ xung vi phân dạng cực phổ có độ nhạy cao, độ phân giải lớn dễ dàng tự động hố, thích hợp với nhiều đối tượng phân tích Nhờ có tiến to lớn điện tử học tin học ngày có nhiều máy móc cực phổ xung, hồn thiện, rẻ tiền, có độ xác cao trang bị cho nhiều phịng thí nghiệm nước ta Trên sở tiến hành: “Nghiên cứu, xây dựng ứng dụng phương pháp xác định đồng thời hoạt chất vitamin B1, B2 thuốc vitamin tổng hợp phương pháp cực phổ xung vi phân.” Để thực đề tài khóa luận thực nghiệm chúng tơi tiến hành bước sau: + Nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu máy dung dịch đo + Nghiên cứu tìm khoảng nồng độ thích hợp hoạt chất vitamin B1, vitamin + B2 hỗn hợp vitamin phụ thuộc vào diện tích pic, từ xây dựng đường chuẩn + Kiểm tra đường chuẩn mẫu tự tạo để biết ứng dụng đường chuẩn vào xác định hàm lượng chất hay khơng + Nghiên cứu, khảo sát tính thích hợp, độ lặp lại, độ hệ thống Mục đích đề tài Xây dựng phương pháp định tính định lượng hoạt chất vitamin B1, B2 có thuốc bổ chứa vitamin phương pháp cực phổ xung vi phân Ứng dụng phân tích định tính định lượng hoạt chất vitamin có thuốc bổ chứa vitamin bán rộng rãi thị trường Đánh giá hàm lượng hoạt chất vitamin có thuốc bổ vitamin bán thị trường Từ thơng báo tới quan kiểm nghiệm y tế Nhiệm vụ đề tài: Khảo sát tính thích hợp thiết bị cực phổ xung vi phân q trình phân tích đồng thời hoạt chất vitamin có thuốc bổ vitamin Khảo sát tìm nồng độ tuyến tính vitamin thuốc bổ chứa vitamin Từ xây dựng phương trình đường chuẩn vitamin với độ xác tin cậy cao Ứng dụng mua thuốc bổ chứa vitamin bán rộng rãi thị trường để phân tích đánh giá phương pháp xác định hàm lượng hoạt chất vitamin B1, vitamin B2 có thuốc bổ chứa vitamin, so sánh hàm lượng tìm với hàm lượng hoạt chất ghi nhãn mác nhà sản xuất Phương pháp nghiên cứu Chúng áp dụng phương pháp thực nghiệm vào nghiên cứu gồm hai nội dung nghiên cứu ứng dụng lấy mẫu thật để phân tích đánh giá Xây dựng chương trình cực phổ định tính định lượng vitamin B1, B2 thuốc bổ chứa vitamin Để xây dựng chương trình cực phổ thích hợp, chúng tơi tiến hành khảo sát lựa chọn điều kiện sau: - Chọn - Ảnh hưởng oxi hòa tan - Ảnh hưởng pH đệm - Ảnh hưởng nồng độ đệm - Ảnh hưởng tốc độ quét Để đánh giá chương trình cực phổ xây dựng được, chúng tơi tiến hành: Khảo sát tính thích hợp hệ thống cực phổ xung vi phân Khảo sát độ tuyến tính nồng độ diện tích pic hoạt chất Khảo sát độ xác phương pháp Khảo sát độ phương pháp thêm chuẩn Thông qua việc xử lý thống kê kết thực nghiệm để đánh giá chương trình cực phổ xây dựng Ứng dụng chương trình cực phổ xây dựng, định tính định lượng phương pháp đường chuẩn Kết đạt Xây dựng thành công điều kiện cực phổ để phân tích xác định hàm lượng vitamin B1, B2 có thuốc bổ chứa vitamin Khảo sát tìm khoảng nồng độ tối ưu từ xây dựng phương trình đường chuẩn với độ xác tin cậy Áp dụng phương pháp cực phổ xung vi phân định lượng vitamin thuốc bổ chứa vitamin Kết thu nằm khoảng độ tin cậy cho phép hàm lượng hoạt chất vitamin phân tích phù hợp với số liệu ghi bao bì thuốc Những điểm đề tài: Đã ứng dụng phương pháp cực phổ xung vi phân phương pháp đại phân tích kiểm nghiệm dược Xây dựng phương pháp định lượng ổn định, xác cho hỗn hợp vitamin B1 vitamin B2 thuốc bổ chứa vitamin phương pháp cực phổ xung vi phân, ứng dụng phương pháp định lượng xây dựng vào việc kiểm tra chất lượng thuốc bổ bán trôi thị trường NỘI DUNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Vitamin B1 (Thiamin thiamine) [1, 3, 4, 5, 6, 27] 1.1.1 Cấu trúc hóa học Hình 1.1: Cấu tạo vitamin B1 Cơng thức phân tử: C12H17N4OS.NO3 ( C12H17N5O4S ) Khối lượng phân tử: 327,4 Tên khoa học:3-[(4-Amino-2-methylpyrimidin-5-yl)methyl]-5-(2hydroxyethyl)-4-methylthiazolium nitrate Nhiệt độ nóng chảy: 246 ÷ 2500C 1.1.2 Lý tính Vitamin B1 tinh thể không màu bột kết tinh trắng nhỏ; thường có mùi đặc trưng giống men bia, vị đắng Khi tiếp xúc với khơng khí, chế phẩm khan nhanh chóng hút ẩm (tới khoảng 4% nước) Dung dịch nước với acid với giấy qùy (dung dịch 1% có pH từ 2,7 đến 3,4) Nóng chảy 248oC với phân hủy Vitamin B1 dễ tan nước, khó tan ethanol, khơng tan ether, benzen clorofom Dạng hydrobromid bột trắng ánh vàng 1.1.3 Nguồn gốc Thức ăn ngày cung cấp đủ vitamin B1 hay cịn gọi thiamin Thiamin có thức ăn nguồn gốc thực vật động vật, có nhiều men bia, hạt ngũ cốc, chủ yếu cám mầm hạt họ đậu, khoai tây, cà chua, hoa quả, thịt, gan, trứng, sữa… 1.1.4 Hóa tính Cấu trúc hóa học vitamin B1 gồm dẫn xuất pyrimidin gắn với dẫn chất thiazol qua nhóm methylen Dẫn xuất pyrimidin: có nitơ nên mang lại cho vitamin B1 tính base Tuy nhiên, nitơ nhân pyrimidin có tính base yếu, nhóm amin thơm có tính base yếu Dẫn xuất thiazol: vòng thiazol dị vòng thơm vững bền, song vịng thiazoli có nitơ bậc bốn nên vững bền, đặc biệt môi trường kiềm trung tính Trong mơi trường vịng dễ bị thủy phân, mở vịng lúc dễ bị oxy hóa thành sản phẩm khơng có hoạt tính vitamin Vì chế phẩm thường dạng thiamin hydroclorua hay thiaminhidrobromua, dung dịch chúng có tính axit nên vững bền Trong mơi trường kiềm, Vit.B1 tác dụng với K3[Fe(CN)6] tạo thiocrom màu vàng phát huỳnh quang màu xanh da trời phản ứng dùng để tính định lượng thiamin Nhóm 2-hydroxylethyl: nhóm dễ bị ether hóa ester hóa tạo thành số hợp chất khác có tác dụng vơ quan trọng việc chuyển hóa hydratcacbon 1.1.5 Tác dụng dược lý Dùng để đề phòng điều trị bệnh thiếu vitanin B1 Thiếu vitamin B1 thức ăn thiếu, nhu cầu cao, vitamin B1 khỏi thể thẩm tích máu người suy thận, ăn thực phẩm chứa nhiều chất kháng vitamin B1 yếu tố kết hợp.Khi thiếu vitamin B1 nặng gây bệnh beri-beri, bệnh ảnh hưởng tới hệ tim mạch, thần kinh, hệ thống tiêu hóa Tùy quan bị ảnh hưởng, người ta phân bệnh beri-beri khô, ướt, não Dạng bào chế: Cồn thuốc (0,25mg/ml), viên nén (5,10,25,50,100,250,500mg), dạng dung dịch tiêm (100mg/ml)… 1.2 Vitamin B2 (Riboflavin Lactoflavin) [1,2,3,6, 24,27,28] 1.2.1 Cấu trúc hóa học Hình 1.2: Cấu tạo vitamin B2 Cơng thức phân tử: C17H20N4O6 Khối lượng phân tử: 376,4 Tên khoa học: 7,8-dimethyl-10[(2S,3S,4R)2,3,4,5-tetrahydroxypentyl]8 3H,10H-benzopteridine-2,4-dione Nhiệt độ nóng chảy: 274 ÷ 2820C 1.2.2 Lý tính Vitamin B2 chất bột kết tinh màu vàng vàng da cam, có mùi, nóng chảy khoảng 2800C Dung dịch bão hòa nước vitamin B2 trung tính với giấy quỳ Vitamin B2 khó tan nước, ethanol, khơng tan erther, cloroform, benzen Để làm tăng độ tan vitamin B2 nước người ta thêm số chất ure, methyl acetamid, muối kim loại kiềm acid hydroxybenzoic 1.2.3 Nguồn gốc Vitamin B2 có nhiều trứng, sữa, phó mát, rau xanh, đặc biệt gan thận, ngũ cốc, bánh mì, men bia Rất nhiều vi sinh vật có khả tổng hợp vitamin B2, có vi khuẩn sống đường ruột người 1.2.4 Hóa tính Hóa tính vitamin B2 hóa tính đường riboso nhân benzopteridin-2,4 dion - Đường ribose: Có thể ether hóa ester hóa Tác dụng với acid sulfuric tạo màu đỏ, ứng dụng để định tính Tác dụng với acid đa chức (acid photphoric…) tạo erter dạng muối kim loại kiềm ester dễ tan nước Do có nguyên tử cacbon bất đối nên vitamin B2 có đồng phân quang học - Nhân benzopteridin-2,4-dion: - Hệ dây nối đơi ln phiên: Do có hệ dây nối ln phiên tương đối dài nên vitamin B2 hấp thụ mạnh xạ vùng tử ngoại xạ vùng trông thấy nên vitamin B2 có màu vàng có bước sóng cực đại hấp thị 445, 372, 269, 225nm Dễ bị khử hóa thành loại chất có tên leucoflavin khơng màu Đây phản ứng thuận nghịch xảy có mặt chất khử như: H hoạt tính, NaHSO3, TiCl2 Phản ứng dùng để giải thích vai trị vitamin B2 thể tham gia xúc tác phản ứng oxy hóa khử Nhóm chức amid: Nhóm chức dễ bị phân hủy môi trường kiềm acid đun nóng Vì vậy, dung dịch vitamin B2 phải đựng thủy tinh trung tính, pH dung dịch trung tính Vitamin B2 dễ hoạt tính tiếp xúc với ánh sáng, mơi trường kiềm chuyển sang dạng lumiflavin, mơi trường axit trung tính bị chuyển sang dạng lumicrom, phải đựng vitamin B2 bình thủy tinh tránh ánh sáng 10 xm εx Cm εm Ct εt 0,072 0,011 18,084 0,011 3,617 0,002 Trong đó: Xm: nồng độ vitamin B2 mẫu chuyển vào bình đo (mg/l) Cm: nồng độ vitamin B2 mẫu (mg/l) Ct : hàm lượng vitamin B2 viên thuốc 3,617(mg/l) εx, εm, εt: khoảng tin cậy xm, cm, ct (mg/l) Hàm lượng vitamin B2 viên thuốc: (3,617 ± 0,002) mg Độ lệch chuẩn tương đối là: 8,308% So sánh với giá trị nhà sản xuất 4mg/viên sai lệch 9,575% Từ kết thu ta thấy hàm lượng vit.B1, B2 thuốc vitamin tổng hợp có độ sai lệch 11,04%, 9,575%, độ lệch chuẩn tương đối 13,41%, 8,308% > 2% (theo tiêu chuẩn kiểm nghiện y tế) chứng tỏ thuốc vitamin tổng hợp (minaport) Cơng ty Dược phẩm Đơng Nam sản xuất có hàm lượng hoạt chất vitamin B1 vitamin B2 ghi nhãn không phù hợp với thực tế [1] 86 KẾT LUẬN Sau thời gian tìm hiểu tài liệu, nghiên cứu, tiến hành thí nghiệm, phân tích số liệu thu số kết sau: Đã tìm điều kiện tối ưu để xác đồng thời VitB1, B2 - Thời gian cân trước quét thế: 10s - Thời gian khuấy: 3s - Biên độ xung 50mV - Tốc độ quét 5mV/s - Khoảng quét từ -0,1V đến -1,5V - Dung dịch để đo sóng cực phổ xung vi phân hỗn hợp Vit.B1 Vit.B2 hỗn hợp đệm đệm axetat phot phat có pH = 6,5 với tỉ lệ thể tích Vaxetat : Vphotphat = 1:1 - Thời gian đuổi khí trước quét 60s - Tỷ lệ Vit.B1:Vit.B2 = 5:2 Đã nghiên cứu, xây dựng quy trình, phương pháp xác định riêng rẽ Vit.B1, B2 điều kiện đo tối ưu Từ làm sở cho việc nghiêm cứu xây dựng quy trình xác định đồng thời Vit.B1, B2 lần pha mẫu Đã nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định đồng thời Vit.B1, B2 lầm đo mẫu tiết kiệm thời gian, hóa chất nâng cao suất phân tích Sử dụng quy trình vào việc kiểm định chất lượng thuốc vitamin tổng hợp bán thị trường công ty dược phẩm traphaco, CTCP dược phẩm Hà Nội, CTCP dược phẩm Hà Tây, Công ty Dược phẩm Đơng Nam, CTCP dược VTYT Bình Thuận Kết thu nằm khoảng tin cậy cho phép hàm lượng hoạt chất có vitamin tổng hợp công ty dược phẩm traphaco, CTCP dược phẩm Hà Nội, 87 CTCP dược phẩm Hà Tây, CTCP dược VTYT Bình Thuận phù hợp với số liệu ghi nhãn nhà sản xuất Hàm lượng vitamin B1, B2 thuốc vitamin tổng hợp Công ty Dược phẩm Đơng Nam khơng phù hợp theo tiêu chuẩn y tế [1] Các kết thu mở khả áp dụng phương pháp cực phổ xung vi phân phòng kiểm nghiệm trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm Trung ương tỉnh, việc xác định đồng thời hàm lượng vitamin bán rộng rãi thị trường 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Kiểm nghiệm Dược phẩm, 2007 Bộ Y Tế, Nhà xuất Y học Hà Nội Phạm Gia Huệ, Trần Tử An, Hóa Phân tích, 2004 Trường Đại Học Dược Hà Nội, Tập Hóa dược, 2006 Bộ mơn Hóa dược-Trường Đại học Dược Hà Nội,Tập 1,2 Dược lý học, 2004 Bộ môn Dược lý- Trường Đại học Dược Hà Nội, tập Dược thư Quốc gia Việt Nam, 2002 Bộ Y Tế, lần xuất thứ Dược điển Việt Nam, 2002 Bộ Y Tế, lần xuất thứ ba, Nhà xuất Y học Nguyễn Tiến Khanh, Thống kê ứng dụng công tác Dược, 1995 Tủ sách sau Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Việt Huyến, Cơ sở phương pháp phân tích điện hóa, 1999 ĐHQGHN, Trường Đại học KHTN Thái Phan Quỳnh Như, Ứng dụng phương pháp chia tách kiểm nghiệm thuốc, 2001 Viện kiểm nghiệm, Bộ Y Tế 10 Phạm Gia Huệ, Nguyễn Tiến Khanh, Một số phương pháp hóa lý phân tích Dược, 1990 Trường Đại học Dược Hà Nội 11 Lê Đức Ngọc, Xử lý số liệu kế hoạch hóa thực nghiệm, 2009 ĐHQGHN, Trường Đại học KHTN 12 Nguyễn Thị Việt Hương, “ Xác định số vitamin phương pháp cực phổ”, 2006 Luận văn thạc sĩ, ĐHQGHN, trường Đại học khoa học tự nhiên 13 Nguyễn Văn Tú, “ Nghiên cứu, xây dựng ứng dụng phương pháp định lượng hoạt chất thuốc kháng sinh amocilin, clorocid vitamin B1, C, D3 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao”, 2009 Luận văn thạc sĩ, trường Đại học sư phạm Hà Nội 89 Tiếng Anh 14.Altria.K.D, “Quantitative aspects of the application of capillary 15 Paul Monk, Fundamental of Electroanalytical Chemistry, Engliand 2000 16 Ana Elisa F Presoto, magda D G Rios, Ligi B de Almeida-Muradian, J Braz, Chem, Soc, Vol 15, 2004, 136-139 17 E Jacobsen, T M Tommelstad, Analytica Chimica Acta, 1984, Volume 162, pages 379-383 18.Electrophoresis to the analysis of pharmaceuticals and drug related impurities”, Journal of Chromatography, 646, 245-257, 1993 19.British Pharmacopoeia , tập 1-trang 498-499, tập 2-trang 1653-1654, 1889-1890, 2008 20.USP (United State Pharmacopoeia), trang 1268-1271, 1741-1744, 31783179, 2008 21.Martindale-35th, trang 92-95, 516-517, 1814-1815, 2007 22 Merck & Co., Inc , The Merck Index- 13th edition, trang 10, 376, 1470, 2001 23.Susumu Honda, “Determination of cefixime and its metabolites by highperformance capillary electrophoresis”, Journal of Chromatography, 590, 364-368, 1992 24 Tian, Lin-qin, Zhang, Ai-mei, “Determination of Vitamin B2 by kinetic spectrophotometry”, Fenxi Kexua Xuabao, 2004, 20(4), 481-420 CA section: 80 25.Leveque Dragica et al, “Capillary electrophoresis for pharmacokinetic studies”, Journal of Chromatography B, 697, 67-75, 1997 26 JA, “Liquid-chromatographic determination of five orally active cephalosporins-cefixime, cefaclor, cefadroxil, cephalexin, and cephradine in human serum”, Clinical Chemistry, 33, 1788-1790, 1987 27.Fang Meng et al, “Sensitive liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for the determination of cefixime in human plasma: 90 Application to a pharmacokinetic study”, Journal of Chromatography B, 819, 277-282, 2005 28 Gu, Hai-Ying, Yu, Ai-min, Chen, Hong-Yuan, “Electrochemical behavior and simultaneous determination of vitamin B2, B6, C at electrochemically pretreated glassy carbon electrode.”Analytical Letter, 2001, 34(13), 23612374 CA section: 64 29 Pehourcq.F, Jarry.C, “Determination of third Generation cephalosporins by highperformance liquid chromatography in connection with pharmacokinetic studies”, Journal of Chromatography A, 812, 159-178, 1998 30 Zendelovska Dragica et al, “High-performance liquid chromatographic method for determination of Cefixime and Cefotaxime in human plasma”, Bulletin of the Chemists and Technologists of Macedonia, 22, 39-45, 2003.s 91 PHỤ LỤC Thuốc B1 viên nén Thành phần viên thuốc nén B1 (công ty dược phẩm Traphaco) Vitamin B1 10mg + tá dược Hịa tan hồn tồn viên thuốc B1 vào nước, định mức thành 500ml dung dịch ta mẫu B1 Để xác định Vit.B1 ta dùng phương pháp thêm chuẩn Lấy 1ml dung dịch mẫu rối thêm tiếp 10ml đệm photphat có pH = 6,5 vào bình đo chuẩn độ đến 25ml sau chọn điều kiện đo tối ưu với Vit.B1 khảo sát Ghi sóng cực phổ xung vi phân giá trị I0k Sau thêm 1; 2; ml dung dịch Vit.B1 chuẩn 20mg/l ghi sóng cực phổ trường hợp ( thí nghiệm làm lặp lại lần) Kết thu bảng (1) thể hình (1), (2) Bảng 1: Sự phụ thuộc Ip vào nồng độ Vit.B1 chuẩn TT Ci mg/l 29,01 0,8 52,72 1,6 2,4 Ipi 28,07 28,9 Ii(tb) 28,66 52,32 56,56 53,86 79,41 80,2 82,1 80,57 112,23 110,01 112,05 111,43 92 Đường thêm chuẩn xác định Vit B1 y = 34.377x + 27.38 Y(nA) 150 R2 = 0.9978 100 50 X(mg/l) -1 Hình 1: Sự phụ thuộc Ip vào nồng độ Vit.B1 chuẩn Xử lý đường thêm chuẩn theo phương pháp hồi quy tuyến tính excel: Ip = (34,377 ± 1,808).CM + (27,38 ± 5,413) Đường thêm chuẩn cắt trục hoành giá trị xm, giá trị xm εm tính theo cơng thức: b  b a  a xmin  b  b a  a xmax  xmin m  xmax  xmin xmax  xm  f = (n+1)(k-1) (1) n: số lần thêm chuẩn k: số lần đo lặp Nồng độ Vit.B mẫu: cm  xm (v0  vm ) v0 m   x (v0  vm ) (2) vm Nồng độ Vit.B thuốc εt = Vt.εm Ct = Vt.Cm (3) xm εx Cm εm Ct εt 0,81 0,20 20,17 0,129 10,006 0,064 93 Trong đó: Xm: nồng độ vitamin B1 mẫu chuyển vào bình đo (mg/l) Cm: nồng độ vitamin B1 mẫu (mg/l) Ct : hàm lượng vitamin B1 1viên thuốc (mg/l) εx, εm, εt: khoảng tin cậy xm, cm, ct (mg/l) Hàm lượng vitamin B1 viên thuốc: (10,006 ± 0,064) mg Độ lệch chuẩn tương đối là: 0,86% So sánh với giá trị nhà sản xuất 10mg/viên sai lệch 0,06% Như ta thấy độ lệch chuẩn tương đối 0,86% < 2% ( theo tiêu chuẩn kiểm nghiện y tế) chứng tỏ thuốc vitamin B1 cơng ty dược phẩm Traphaco sản xuất có hàm lượng hoạt chất vitamin B1 ghi nhãn phù hợp với thực tế xác định theo quy trình nghiên cứu -100n I (A) -200n -300n -400n -500n -1.20 -1.30 -1.40 -1.50 -1.60 U (V) Hình 2: Sóng cực phổ Vit.B1 mẫu thuốc Thuốc B2 viên nén Thành phần viên thuốc B2 dạng nén bao phim (CTCP dược phẩm Hà Nội) B2 2mg + tá dược 94 Hịa tan hồn tồn viên thuốc B2 vào nước (đun cách thủy mơi trường axit axetic sau để nguội cho thêm NaOH) định mức thành 400ml dung dịch ta mẫu Btb2 Để xác định Vit.B2 ta dùng phương pháp thêm chuẩn Lấy 0,1ml dung dịch mẫu rối thêm tiếp 10ml đệm axetat có pH = 4,5 vào bình đo chuẩn độ đến 25ml sau chọn điều kiện đo tối ưu với Vit.B2 khảo sát Ghi sóng cực phổ xung vi phân giá trị I0k Sau thêm 0,1; 0,2; 0,3 ml dung dịch Vit.B2 chuẩn 25mg/l ghi sóng cực phổ trường hợp ( thí nghiệm làm lặp lại lần) Kết thu bảng (2) thể hình (3), (4) Bảng : Sự phụ thuộc Ip vào nồng độ Vit.B2 chuẩn TT Ci mg/l 61,71 Ipi 61,58 61,73 Ii(tb) 61,673 0,1 134,5 134,9 134,8 134,733 0,2 187,53 186,91 188,01 187,483 0,3 250,4 250,19 250,337 250,42 Đường thêm chuẩn Vit.B2 Y(nA) y = 628.96x + 63.698 300.000 R2 = 0.9979 200.000 100.000 X(mg/l) 0.000 -0.2 -0.1 0.1 0.2 0.3 Hình 3: Sự phụ thuộc Ip vào nồng độ Vit.B2 chuẩn 95 0.4 Xử lý đường thêm chuẩn theo phương pháp hồi quy tuyến tính excel: Ip = (628,96 ± 1,12).CM + (63,698 ± 0,41) Đường thêm chuẩn cắt trục hoành giá trị xm, giá trị xm εm tính theo cơng thức (1), (2), (3) I (A) -50.0n -100n -150n -100m -200m -300m -400m -500m U (V) Hình 4: Sóng cực phổ VitB2 mẫu thuốc εx xm 0,101 εm Cm 0,001 25,319 Ε Ct 0,001 10,128 0,0001 Trong đó: Xm: nồng độ vitamin B2 mẫu chuyển vào bình đo (mg/l) Cm: nồng độ vitamin B2 mẫu (mg/l) Ct : hàm lượng vitamin B2 viên thuốc (mg/l) εx, εm, εt: khoảng tin cậy xm, cm, ct (mg/l) Hàm lượng vitamin B2 viên thuốc: (2,0256 ± 0,0001) mg Độ lệch chuẩn tương đối là: 1,1% So sánh với giá trị nhà sản xuất 2mg/viên sai lệch 1,28% 96 Như ta thấy độ lệch chuẩn tương đối 1,1% < 2% ( theo tiêu chuẩn kiểm nghiện y tế) chứng tỏ thuốc vitamin B2 CTCP dược phẩm Hà Nội sản xuất có hàm lượng hoạt chất vitamin B2 ghi nhãn phù hợp với thực tế xác định theo quy trình nghiên cứu 31 PPhụPpp 97 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.Lý chọn đề tài Mục đích đề tài 3 Nhiệm vụ đề tài: Phương pháp nghiên cứu Kết đạt Những điểm đề tài: NỘI DUNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Vitamin B1 1.1.1 Cấu trúc hóa học 1.1.2 Lý tính 1.1.3 Nguồn gốc 1.1.4 Hóa tính 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.2 Vitamin B2 1.2.1 Cấu trúc hóa học 1.2.2 Lý tính 1.2.3 Nguồn gốc 1.2.4 Hóa tính 1.2.5 Tác dụng dược lý 11 1.3 Các phương pháp hóa lý kiểm nghiệm thuốc 11 1.3.1 Phương pháp quang phổ phân tử [8,9,10,15,14,23] 11 1.3.1.1 Quang phổ hấp phụ UV.VIS 11 1.3.1.2 Quang phổ hồng ngoại 13 1.3.2 Sơ lược phương pháp phổ vonampe 13 1.4 Yêu cầu định lượng thuốc kiểm nghiệm dược phẩm 19 1.4.1.Tính đặc hiệu phương pháp 19 1.4.2.Đường chuẩn khoảng tuyến tính 19 1.4.3 Độ 20 1.4.4 Độ xác 20 98 1.4.5 Giới hạn phát hiện(LOD), giới hạn định lượng dưới(LOQ) 20 1.5 Tình hình nghiên cứu, xây dựng quy trình xác định hàm lượng hoạt chất vitamin B1, B2 Và ứng dụng 21 CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 24 2.1 Hóa chất dụng cụ 24 2.1.1: Hóa chất 24 2.1.2: Dụng cụ 24 2.1.3 Pha hóa chất 25 2.1.3.1 Pha dung dịch B2 25 2.1.3.2 Pha dung dịch B1 25 2.1.3.3 Pha dung dịch 25 2.4 Các phương pháp xử lý kết qủa [7, 11] 26 2.4.1 Xây dựng đường chuẩn xử lý thống kê theo phương pháp bình phương tối thiểu 26 2.4.2 Kiểm tra đường chuẩn 27 2.4.3 Ứng dụng phương pháp cực phổ xung vi phân vào định lượng vitamin B1 vitamin B2 số mẫu thuốc 28 2.4 3.1 Xử lý mẫu thuốc 28 2.4.3.2 Phương pháp xử lý kết [11] 28 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Điều kiện tối ưu xác định vitamin B phương pháp cực phổ xung vi phân 29 3.1.1 VitaminB2 30 3.1.1.1 Khảo sát chọn dung dịch đệm làm 30 3.1.1.2 Khảo sát tìm pH đệm axetat tối ưu 32 3.1.1.3 Khảo sát tìm nồng độ đệm axetat tối ưu 33 3.1.1.4 Ảnh hưởng oxi hòa tan 34 3.1.1.5 Khảo sát tìm khoảng nồng độ Vit.B2 tối ưu 36 3.1.2 VitaminB1 41 3.1.2.1 Khảo sát chọn dung dịch tối ưu 41 3.1.2.2 Ảnh hưởng pH đệm 43 3.1.2.3 Khảo sát tìm nồng nồng độ đệm photphat tối ưu 44 99 3.1.2.4 Khảo sát tìm thời gian đuổi oxi hòa tan tối ưu 45 3.1.2.5 Khảo sát tìm khoảng nồng độ Vit.B1 tối ưu 46 3.2 Nghiên cứu xác định đồng thời VitaminB1, Vitamin B2 hỗn hợp 51 3.2.1 Khảo sát tìm tối ưu 51 3.2.2 Khảo sát chọn pH hỗn hợp dung dịch đệm sử dụng làm 53 3.2.3 Khảo sát chọn nồng hỗn hợp đệm tối ưu 55 3.2.4 Khảo sát chọn thời gian đuổi oxi hịa tan thích hợp 56 3.2.5 Khảo sát tìm nồng độ Vit.B1,B2 hỗn hợp 58 3.2.5.1 Khảo sát tìm khoảng nồng độ Vit.B1 Vit.B2 hỗn hợp (tỷ lệ 5:1) tỷ lệ với chiều cao dòng cực phổ xung vi phân (Ip) 58 3.2.5.2 Khảo sát tìm khoảng nồng độ Vit.B1 Vit.B2 hỗn hợp (tỷ lệ 5:2) tỷ lệ với chiều cao dòng cực phổ xung vi phân (Ip) 63 3.2.5.3 Khảo sát tìm khoảng nồng độ Vit.B1 Vit.B2 hỗn hợp (tỷ lệ 5:3) tỷ lệ với chiều cao dòng cực phổ xung vi phân (Ip) 68 3.3 Ứng dụng qui trình phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng hoạt chất có loại thuốc số công ty dược phẩm bán thị trường Thanh Hóa 75 3.3.1 Xác định riêng rẽ Vit,B1, B2.(Xem phụ lục) 75 3.3.2 Xác định đồng thời Vit.B1, B2 thuốc vitamin tổng hợp 75 3.3.2.1 Thuốc vitamin tổng hợp (B complex) CTCP dược vật tư y tế Bình Thuận sản xuất 75 3.3.2.2 Thuốc vitamin tổng hợp (oravita) CTCP dược phẩm Hà Tây sản xuất 79 3.3.2.3 Thuốc vitamin tổng hợp (minaport) Công ty Dược phẩm Đông Nam sản xuất 83 KẾT LUẬN 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO 89 PHỤ LỤC 100