Nghiên cứu tổng hợp rilpivirin hydroclorid quy mô phòng thí nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP RILPIVIRIN HYDROCLORID QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ PHƯƠNG MAI NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP RILPIVIRIN HYDROCLORID QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ CHUYÊN NGÀNH: 8720202 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Giang GS.TS Nguyễn Đình Luyện HÀ NỘI 2022 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Giang GS.TS Nguyễn Đình Luyện, người thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo cho kiến thức, kinh nghiệm quý báu tạo mọi điều kiện giúp đỡ suốt quãng thời gian thực luận văn Tôi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Văn Hải, người thầy tận tình bảo, động viên khích lệ tiếp thêm sức mạnh giúp tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến em Đinh Thị Thu Hương Nguyễn Mai Hương giúp đỡ, hỗ trợ tơi suốt q trình thực đề tài Bên cạnh đó, Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường toàn thể thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập tại trường Trong trình thực luận văn nhận giúp đỡ cán thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, cán khoa Hóa – trường Đại học Khoa học tự nhiên, xin chân thành cảm ơn Ngồi ra, tơi xin gửi lời cảm ơn đến người bạn, người em tại mơn Tổng hợp Hố Dược hỗ trợ, động viên lúc cần Lời cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình ln an ủi, động viên, khích lệ tơi sống học tập Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân hạn chế, nên khóa luận khơng tránh khỏi nhiều thiếu sót Tơi mong nhận góp ý thầy cơ, bạn bè để khóa luận hồn thiện Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 04 năm 2022 Học viên Bùi Thị Phương Mai MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rilpivirin 1.1.1 Cấu trúc hoá học 1.1.2 Tính chất vật lý, hố học 1.1.3 Dược động học, tác dụng dược lý định 1.2 Các phương pháp tổng hợp Rilpivirin 1.2.1 Định hướng tổng hợp Rilpivirin 1.2.2 Các phương pháp tổng hợp chất trung gian 1.2.3 Điều chế rilpivirin từ chất trung gian A.HCl B 14 1.3 Định lượng Rilpivirin phương pháp HPLC 15 1.4 Phân tích lựa chọn phương pháp tổng hợp điều kiện HPLC 17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên liệu thiết bị 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Tổng hợp hóa học kiểm tra độ tinh khiết 24 2.3.2 Xác định cấu trúc 25 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 26 3.1 Kết thực nghiệm 26 3.1.1 Tổng hợp (E)-3-(4-amino-3,5-dimethylphenyl) acrylonitril hydroclorid (A.HCl) 26 3.1.2 Tổng hợp 4-((4-chloropyrimidin-2-yl) amino) benzonitril (B) 35 3.1.3 Tổng hợp rilpivirin hydroclorid 41 3.1.4 Định lượng rilpivirin 44 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phương pháp phổ 45 3.2.1 Kết phân tích phổ hồng ngoại (IR) 45 3.2.2 Kết phân tích phổ khối lượng (MS) 46 3.2.3 Kết phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 47 3.3 Bàn luận 52 3.3.1 Bàn luận phản ứng hoá học 52 3.3.2 Bàn luận kết phân tích phổ 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu, viết tắt H-NMR HIV Chú thích Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton nuclear magnetic resonance) Virus gây suy giảm miễn dịch người (Human Immunodeficiency Virus) ADN Acid 2’-deoxynucleic CSA Acid clorosulfonic CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử DMF Dimethylformamid DMSO Dimethyl sulfoxid EtOAc Ethylacetat EtOH Ethanol G GI50 Gam Nồng độ ức chế 50% phát triển (Growth inhibition of 50%) H IC50 Giờ Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử (Half maximal inhibitory concentration) KLPT Khối lượng phân tử MeOH Methanol MIC MS m/z Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration) Phổ khối (Mass spectrometry) Tỷ số khối lượng diện tích ion Rf Hệ số lưu giữ (Retention factor) SKLM STT To Tonc VK VSV Sắc ký lớp mỏng Số thứ tự Nhiệt độ Nhiệt độ nóng chảy Vi khuẩn Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Bảng kết HPLC rilpivirin chuẩn theo nghiên cứu Somsubhra Ghosh cộng 16 Bảng Bảng kết HPLC rilpivirin chuẩn theo K Srinivas Reddy cộng 17 Bảng Danh mục dung mơi, hóa chất 20 Bảng 2 Danh mục dụng cụ, thiết bị 21 Bảng Ảnh hưởng tỷ lệ Fe: 5m đến hiệu suất phản ứng tạo 5k 31 Bảng Ảnh hưởng tỷ lệ diethyl (cyanomethyl) phosphonat: 5k 33 Bảng 3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng tạo A.HCl 34 Bảng Ảnh hưởng dung môi tới hiệu suất phản ứng tạo chất 6n 36 Bảng Ảnh hưởng tỉ lệ mol CH3I: 2-thiouracil tới hiệu suất phản ứng tạo 6n 36 Bảng Ảnh hưởng tỷ lệ mol p-aminobenzonitril: 6n 38 Bảng Ảnh hưởng tỉ lệ mol POCl3: B’ 40 Bảng Bảng kết định lượng HPLC 44 Bảng Bảng phổ hồng ngoại (IR) 45 Bảng 10 Bảng kết phổ MS 46 Bảng 11 Bảng kết phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR 47 Bảng 12 Bảng kết phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR 50 Bảng 13 So sánh phổ MS rilpivirin hydroclorid đo phổ tham khảo 67 Bảng 14 So sánh phổ 1H-NMR phổ rilpivirin hydroclorid đo phổ tham khảo 67 Bảng 15 So sánh phổ 13C-NMR phổ rilpivirin hydroclorid đo phổ tham khảo 68 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Công thức cấu tạo rilpivirin monohydroclorid Hình Quy trình tổng hợp rilpivirin theo Guillemont cộng Hình Quy trình tổng hợp rilpivirin theo Li Jinliang Hình Các hợp phần tạo nên rilpivirin Hình Tổng hợp chất trung gian A phản ứng Heck .10 Hình Sơ đồ tổng hợp chất trung gian A theo Lewi cộng 11 Hình Sơ đồ tổng hợp chất trung gian A từ nguyên liệu ban đầu mesitylen 12 Hình Sơ đồ tổng hợp chất trung gian B 13 Hình Sơ đồ tổng hợp rilpivirin 14 Hình 10 Sơ đồ tạo muối rilpivirin hydroclorid 15 Hình 11 Sơ đồ tổng hợp rilpivirin hydroclorid dự kiến 18 Hình Tổng hợp (E)- 3-(4-amino-3,5-dimethylphenyl) acrylnitril hydroclorid (A HCl) 23 Hình 2 Tổng hợp 4-((4-chloropyrimidin-2-yl) amino) benzonitril (B) 23 Hình Sơ đồ tổng hợp rilpivirin hydroclorid 23 Hình Cơ chế phản ứng Horner-Wasworth-Emmons .53 Hình Sự tạo thành hemiacetal, acetal 54 Hình 3 dạng tautomer 2-thiouracil 55 Hình Đề xuất chế phản ứng metyl hóa 2-thiouracil 55 Hình Đề xuất chế hình thành chất B’ từ p-aminobenzonitril chất 5n 56 Hình Cơ chế đề xuất cho phản ứng cloro hoá B’ tác nhân POCl3 57 Hình Cơ chế phản ứng SN tổng hợp rilpivirin từ A.HCl B 58 ĐẶT VẤN ĐỀ HIV virus gây suy giảm miễn dịch người Virus HIV lần xác định nước phương Tây vào năm 1981 Cũng kể từ đó, HIV/AIDS phát triển thành đại dịch thảm khốc tồn giới Tính đến năm 2020, có khoảng 37,6 triệu người nhiễm HIV khoảng 690.000 người chết bệnh liên quan đến AIDS toàn giới [31] Tại Việt Nam, kể từ ca nhiễm phát năm 1990 thành phố Hồ Chí Minh, tính đến 30/9/2021, nước có 212.769 người nhiễm HIV cịn sống 108.849 người nhiễm HIV tử vong Trung bình năm nước phát thêm 11.000 ca nhiễm HIV [32] Đến chưa tìm vaccin thuốc chữa khỏi HIV hoàn toàn Tuy nhiên, với phát triển y học, bệnh nhân HIV trì tuổi thọ người bình thường tuân thủ nghiêm ngặt phương pháp điều trị Hiện nay, với bối cảnh nguồn tài trợ thuốc kháng HIV từ nước bị cắt giảm kết thúc vào năm 2020, việc tự nghiên cứu tổng hợp thuốc kháng HIV Việt Nam giúp tự cung tự cấp thuốc, giảm thiểu chi phí cho quốc gia, đồng thời giúp bệnh nhân sử dụng loại thuốc đa dạng Thuốc ức chế men chép ngược khơng nucleoside (NNRTI) nhóm thuốc quan trọng liệu pháp điều trị retrovirus khả dung nạp cao độc tính thấp Trong đó, rilpivirin NNRTI hệ thứ hai FDA Hoa Kỳ phê duyệt vào năm 2011 để điều trị cho người bị nhiễm HIV-1 Rilpivirin mạnh gấp ba lần etravirin - NNRTI hệ dùng với liều lượng thấp (25 mg/viên/ngày lần) [23] Tuy nhiên, rilpivirin thời gian bảo hộ độc quyền, đồng thời chưa có nhiều nghiên cứu tổng hợp bào chế thuốc Việt Nam Chính vậy, với mong muốn tìm quy trình tổng hợp rilpivirin hydroclorid để phục vụ cho tự chủ nguyên liệu bào chế thuốc sau rilpivirin hết hạn quyền, thực đề tài “Nghiên cứu tổng hợp rilpivirin hydroclorid quy mơ phịng thí nghiệm” với mục tiêu: Xây dựng quy trình tổng hợp rilpivirin hydroclorid quy mơ phịng thí nghiệm CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rilpivirin 1.1.1 Cấu trúc hố học Hình 1 Công thức cấu tạo rilpivirin monohydroclorid  Công thức phân tử dạng base: C22H18N6  Công thức phân tử dạng muối monohydroclorid: C22H19ClN6  Phân tử lượng dạng base: 366.42 đvC  Danh pháp IUPAC: + Dạng base: 4-((4-(4-((E)-2-cyanoethenyl)-2,6-dimethylanilino) pyrimidin-2-yl) amino) benzonitril + Dạng muối: 4-[(4-[(4-[(E)-2-cyanoethenyl]-2,6-dimethylphenyl) amino] pyrimidinyl]-2-yl) amino] benzonitril monohydroclorid 1.1.2 Tính chất vật lý, hố học 1.1.2.1 Dạng base  Cảm quan: Rilpivirin chất bột màu trắng đến gần trắng  Nhiệt độ nóng chảy: 241,0-243,0oC [18]  Độ tan: Tan tốt dầu, tan N, N-dimethylformamid N, Ndimethylacetamid, tan sulfinylbismethan, tan methanol, propylen, tan nước, độ tan nước < 0,1 mg/mL  Tính acid, base: pKa = 5,6 [13]  Hệ số phân bố octanol nước: 72444 (logP = 4,86) 1.1.2.2 Dạng muối monohydroclorid  Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng [30]  Độ tan: khó tan nước (0,01 g/L)  Nhiệt độ nóng chảy: 315oC  Hệ số phân bố octanol nước: 33884 (logP = 4,53) 1.1.3 Dược động học, tác dụng dược lý định 1.1.3.1 Dược động học Hấp thu Sau uống, nồng độ tối đa huyết tương rilpivirin thường đạt 4-5 Các liệu rilpivirin chất P-gp Khơng có dấu hiệu tăng sinh khả dụng tăng liều 25 mg hấp thụ rilpivirin dường không liên quan mức liều chọn Sinh khả dụng tuyệt đối rilpivirin không nghiên cứu khả hịa tan thấp AUC giảm 40% ăn bữa ăn nhiều chất béo so với uống lúc đói, giảm 50% sử dụng bia rượu [30] Phân bố Các liệu nghiên cứu động vật rilpivirin phân bố toàn thể, nồng độ cao quan sát thấy gan, tuyến thượng thận, mỡ thận Ngoài ra, rilpivirin qua hàng rào máu não, mức độ nhỏ qua thai Tỷ lệ huyết tương 0,65-0,75 cho thấy phân bố hạn chế vào tế bào máu Tỷ lệ liên kết với protein huyết tương 99,7% Rilpivirin liên kết mạnh với albumin yếu với alpha- acid glycoprotein [30] Chuyển hố Rilpivirin chuyển hóa phản ứng hydroxyl hóa, oxy hóa, glucuronid hóa liên hợp với glutathion Dữ liệu in vitro cho thấy CYP3A4 enzym liên quan đến chuyển hóa rilpivirin [30] Thải trừ Thời gian bán thải cuối rilpivirin khoảng 45 Sau uống đơn liều 14C- Rilpivirin, trung bình 85% 6,1% hoạt tính phóng xạ thu hồi từ phân nước tiểu Trong phân, rilpivirin dạng khơng đổi chiếm trung bình 25% liều dùng Chỉ có vết rilpivirin dạng khơng đổi (