Đang tải... (xem toàn văn)
KỸ THUẬT DI TRUYỀN LAI PHÂN TỬ ThS Nguyễn Thị Mỹ Nương Email ntmnuonghcmus edu Mục tiêu, nguyên lý 2. Đánh dấu mẫu dò 3. Các kiểu lai: 1. Lai trong pha lỏng 2. Lai trong pha rắn 3. Lai tại chổ 4. Ứng dụngMục tiêu, nguyên lý 2. Đánh dấu mẫu dò 3. Các kiểu lai: 1. Lai trong pha lỏng 2. Lai trong pha rắn 3. Lai tại chổ 4. Ứng dụngvn 1 Nội dung 1 Mục tiêu, nguyên lý 2 Đánh dấu mẫu dò 3 Các kiểu lai 1 Lai trong pha lỏng 2 Lai trong pha rắn 3 Lai tại.
LAI PHÂN TỬ ThS Nguyễn Thị Mỹ Nương Email: ntmnuong@hcmus.edu.vn Nội dung Mục tiêu, nguyên lý Đánh dấu mẫu dò Các kiểu lai: Lai pha lỏng Lai pha rắn Lai chổ Ứng dụng Tài liệu tham khảo [1] Buckingham, L (2007) Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications (1st ed.) Philadelphia: F.A Davis Co Chương Mục tiêu – nguyên lý Mục tiêu: phát trình tự nucleic acid hỗn hợp dựa theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung Eastern blot Mục tiêu – nguyên lý Thành phần: - Trình tự mục tiêu - Mẫu dò (probe): + Đặc điểm: (1) bắt cặp bổ sung trình tự mục tiêu; (2) đánh dấu + Phân loại: DNA; RNA; oligo Làm biết trình tự mẫu dị? CÁC PHÂN TỬ DÙNG ĐÁNH DẤU HOÁ HỌC Có lực với antiDigoxigenin Dùng phối hợp với dATP, dCTP, dGTP, dTTP Có lực với streptavidin Dùng phối hợp với dATP, dCTP, dGTP, dTTP ĐÁNH DẤU BẰNG BIOTIN Đánh dấu mẫu dò (probe) → Lai với trình tự mục tiêu → Phát phân tử lai thông qua phức hợp avidin/chất phát huỳnh quang PHƯƠNG PHÁP NICK TRANSLATION “Đục lỗ” mạch DNA Dnase I DNA polymerase I sử dụng hoạt tính 5’-3’ exonuclease “gặm” mạch DNA theo chiều 5’-3’ DNA polymerase I vừa thủy phân vừa tổng hợp mạch bù vào lỗ trống với dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP đánh dấu) Kết probe đánh dấu PHƯƠNG PHÁP RANDOM PRIMING Biến tính mạch đôi DNA Bắt cặp tổ hợp “ mồi“ ngẫu nhiên mạch 64 = 1296 primers DNA polymerase tổng hợp bù vào chỗ trống dNTP có nucleotide đánh dấu Kết probe đánh dấu PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU OLIGONUCLEOTIDE PHẢN ỨNG PHOSPHATASE PHẢN ỨNG KINASE 10 SOUTHERN NORTHERN BLOT 20 KẾT QUẢ NORTHERN BLOT Ghi : UN : Mẫu chứng không cảm ứng, 48h : mẫu cảm ứng tạo -globin sau 48 giờ, 96h : mẫu cảm ứng tạo -globin sau 96 Mẫu dò đồng vị phóng xạ 21 DOT BLOT Tách chiết DNA, RNA → Biến tính (nếu có) → Đặt lên màng lai → Tiền lai → Lai với mẫu dò (trình tự biết) → Phát phân tử lai Dùng để phát hiện, định lượng tương đối so với thang hàm lượng biết Phương pháp cải biên reverse dot blot Trình tự biết cố định giá thể trình tự cần biết (mục tiêu) đánh dấu 22 WESTERN BLOT Điện di gel polyacrylamide Chuyển lên màng lai Liên kết với kháng thể & Rửa để loại kháng thể thừa Phát màu thông qua phản ứng enzyme 23 KẾT QUẢ LAI TRÊN NHIỄM SẮC THỂ 24 CẮT MẪU CHO LAI “TẠI CHỖ” (IN SITU HYBRIDIZATION) 25 LAI “TẠI CHỖ” TRÊN PHÔI Cố định mẫu (formol, đông lạnh) → Cắt lát mỏng (microtome) → Cố định lam kính → Xử lý mẫu trước lai → Tiền lai → Lai với mẫu dò đánh dấu hóa học hay đồng vị phóng xạ → Rửa → Phát phân tử lai → Quan sát kính hiển vi 26 bDNA (branched DNA) 27 NGUYÊN TẮC CỦA MICROARRAY - Tách mRNA từ tế bào nuôi cấy - Phiên mã ngược thành cDNA có đánh dấu huỳnh quang khác - Trộn chung loại cDNA đánh dấu - Rửa, loại thành phần thừa - Đo cường độ phát huỳnh quang điểm : Điểm phát màu vàng : gene biểu lọai tế bào Điểm phát màu xanh : gene tế bào nuôi glucose biểu mạnh Điểm phát màu đỏ : gene tế bào nuôi ethanol biểu mạnh 28 MICROARRAY 29 MICROARRAY 30 VÍ DỤ : PHÁT HIỆN BỆNH HỒNG CẦU HÌNH LIỀM BẰNG SOUTHERN BLOT - Tách DNA - Cắt enzyme MstII - Chạy điện di - Lai với mẫu dò -globin đánh dấu phóng xạ - Phát phóng xạ tự ghi mẫu DNA bệnh dựa vào kích thước trình tự cho tín hiệu lai 31 KỸ THUẬT “ĐI BỘ TRÊN NHIỄM SẮC THỂ (CHROMOSOME WALKING) 32 KẾT QUẢ RFLP TRONG NGHIÊN CỨU PHẢ HỆ 33 CÂU HỎI PHẦN Cách đánh dấu mẫu dò đồng vị phóng xạ ? Bằng hóa học ? Ưu nhược điểm loại tác nhân ? Cách đánh dấu mẫu dò có chất DNA, RNA, oligonucleotide Southern blot Northern blot dot blot đïc thực ? Cho ví dụ việc sử dụng reverse dot blot Cách tiến hành Southern blot, Northern blot, dot blot Ứng dụng Southern blot, Northern blot, dot blot Cách tiến hành ứng dụng phương pháp lai chỗ Cách phát phân tử lai với mẫu dò đồng vị phóng xạ ? Hóa học ? Cách tiến hành phương pháp sử dụng microarray ứng dụng microarray 10 Kỹ thuật nhiễm sắc thể : cách làm ứng dụng 34 ... tự mẫu dị? CÁC PHÂN TỬ DÙNG ĐÁNH DẤU HOÁ HỌC Có lực với antiDigoxigenin Dùng phối hợp với dATP, dCTP, dGTP, dTTP Có lực với streptavidin Dùng phối hợp với dATP, dCTP, dGTP, dTTP ĐÁNH DẤU BẰNG... Lai pha lỏng Lai pha rắn Lai chổ Ứng dụng Tài liệu tham khảo [1] Buckingham, L (2007) Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications (1st ed.) Philadelphia: F.A Davis... BIOTIN Đánh dấu mẫu dò (probe) → Lai với trình tự mục tiêu → Phát phân tử lai thông qua phức hợp avidin/chất phát huỳnh quang PHƯƠNG PHÁP NICK TRANSLATION “Đục lỗ” mạch DNA Dnase I DNA polymerase