CHUYÊN ĐỀ: CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO

C CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO GV thực hiện: Võ Văn Quý Đơn vị: Trường THPT Chuyên LQĐ - Ninh Thuận PHẦN I CƠ SỞ KHOA HỌC CHO QUÁ TRÌNH CHUYỂN GEN I Đặc iểm má di tr tế bào t ực vật Các tính trạng thực vật biểu gen di truyền Có tính trạng đơn gen (do gen phụ trách) có tính trạng đa gen( tác động phối hợp nhiều gen) Về mặt hóa học, gen dãy nucleotit có số nucleotit dãy mã tự đặc trưng, số nucleotit cấu tạo nên gen, thường biểu thị theo KG (Kilobase = 1000 nucleotit) Biểu trực tiếp hoạt động gen protein E, nhờ trình trao đổi chất, sinh trưởng, phát triển … thực vật thực theo chương trình xác định thơng tin di truyền đặc trưng cho lồi Tế bào thực vật khác xa với tế bào động vật vi sinh vật: I.1.Tế bào thực vật tế bào hữu nhân điển hình: Tế bào thực vật có cellulose bao bọc bên ngồi màng ngun sinh cellulose tế bào thực vật liên kết peclin dẫn xuất cellulose khác Vai trò cellulose chỗ bảo vệ giúp cho thực vật đứng thẳng mà cịn giúp cho tồn q trình trao đổi chất Nếu xử lý mơ thực vật enzim peclinaza celluloza, phần lớn peclin celluloza bị phân hủy, tế bào thực vật trần vỏ celluloza bao bọc giải phóng mơi trường gọi protoplast Protoplast ni sống tái tạo lại thành tế bào, mô hay hồn chỉnh Trong mơi trường hoạt động sống photoplase bắt đầu việc tái tạo lại celluloza vỏ celluloza tái tạo tế bào phân chia tiếp tục phát triển Qua vỏ celluloza, muối khoáng nước trao đổi dễ dàng, đại phân tử protein, nucleic axit vỏ celluloza thể ngăn cách định DNA xâm nhập tế bào qua vỏ celluloza lẫn màng nguyên sinh Vỏ celluloza hình thành khơng nằm hồn chỉnh mà nuôi chúng riêng rẽ dạng tế bào đơn trường hợp mang hình thái đa dạng Khi hẳn vỏ bọc celluloza, protoplast ln dạng trịn Lạp thể: bào quan đặc biệt tế bào thực vật (tuy tế bào thực vật xanh) Lục lạp: lạp chứa diệp lục (diệp lục chất màu xanh lục) Bào quan: gọi quan tử Tế bào chất tất tế bào nhân thực chứa số cấu trúc có màng bao bọc, đảm nhiệm chức chuyển hóa Những cấu trúc gọi bào quan Ti thể: Bào quan tế bào nhân thật, có kích thước tương tự tế bào vi khuẩn tế bào có 1.000 ti thể -1- I.2 Tế bào thực vật có lạp thể đặc biệt lục lạp: Lục lạp có cấu trúc phân tử phức tạp, chứa toàn diệp lục làm nhiệm vụ quang hợp Lục lạp chứa máy di truyền riêng chúng mối quan hệ chặt với máy di truyền nhân bào Một số khả chống chịu thực vật có liên quan đến gen nằm lục lạp nhiều gen nằm nhân ti thể Bình quân tế bào thực vật chứa khoảng 50 lục lạp Bằng phương pháp cơng nghệ gen đại, chuyển lục lạp máy di truyền lục lạp từ tế bào sang tế bào loài khác giúp mang tính trạng di truyền Các nguyên nhân theo hướng hình thành ngành công nghệ quan tử (plastid engineezing) nhánh quan trọng CNSH thực vật ngày hôm I.3 Tế bào thực vật có tính tồn thế: Khả tồn hiểu khả tái sinh hoàn chỉnh từ mơ tế bào đơn, chí từ protoplast thực vât Các tế bào động vật hoàn toàn khơng có khả Khả phát sinh hình thái tế bào thực vật vấn đề quan trọng có tính chất định ứng dụng công nghệ gen chọn tạo giống thực vật Nếu sau chuyển gen, tế bào mơ khả tái sinh, việc chuyển gen coi có ý nghĩa thực tế Khả tái sinh kích hóa Khi cấy mơ thực vật điều kiện kích thích nhân tạo để tạo nên mô sẹo, ta thực q trình phản biệt hóa: Khi ngừng tác động kích thích mơ thực vật có khuynh hướng tự biệt hóa trở lại thành mơ có chức rễ, thân, lá… Cuối năm 60 chứng minh đầy đủ tính tồn thể thực vật bậc cao, đồng thời chứng minh tế bào thực vật chứa đầy đủ thông tin di truyền tồn thể Từ đến nay, khoa học cấy mô thực vật tiến bước dài phát sinh hình thái, khả tái sinh hoàn chỉnh từ tế bào, mảng lá, khối mã sẹo thực hàng trăm loài thực vật, tập trung vào hầu hết trồng quan trọng I.4 Tế bào thực vật có máy di truyền phức tạp: Các hiểu biết di truyền phân tử vi sinh vật không đủ để lý giải nhiều tượng di truyền thực vật bậc cao Tế bào thực vật bậc cao chứa lượng DNA lớn gấp nhiều lần vi khuẩn nhiều trường hợp gấp bội so với lượng DNA tế bào người DNA thực vật khác với DNA vi sinh vật, phát dãy mã lặp lặp lại nhiều lần Các gen di truyền phân cách đoạn DNA không mã hóa gọi introns Các nhóm gen thực vật không nằm cố định thể nhiễm sắc Một số thể nhảy qua lại trình thực vật chúng gọi tên gen nhảy (jumping gen) Tóm lại phức tạp máy di truyền làm cho việc ứng dụng CNSH để giải mục tiêu không dễ dàng I.5 Sự thể gen chép dịch mã: I.5.1 Đọc mã : Là trình tạo phân tử RNA thông tin (messengen RNA) theo khuôn mẫu DNA, enzim RNA polymerase xúc tác DNA mẫu -2- (NMP)n + NTP (NMP)n +1 + Ppi H DNA polymeraza,Mg (NMP)n đoạn RNA có sẵn gồm n nucleotide monophotphat NTP nucleotit triphotphat (nucleotide) RNA polymeraza có khả nhận biết điểm khởi đầu cho đọc mã chuỗi DNA Ở vi khuẩn điểm dãy mã TATA, gọi “hộp TATA”, hộp TATA thực vật phức tạp hơn, mã nhiều nucleotit hơn, đa dạng (vẫn gọi chung hộp TATA), ví dụ : T - - - TATA - - - - - - - A –3 : số lần nhắc lại có ademin Ngồi hộp TATA, thực vật cịn có hộp CAAT nằm phía thượng lưu hộp TATA, hộp CAAT có nhiệm vụ điều hịa mức độ đọc mã RNA polymeraza I đọc mã cho sinh tổng hợp RNA ribosome (rRNA), chúng hoạt động bên nhân bào RNA polymeraza II đọc mã cho sinh tổng hợp mRNA, hoạt động chủ yếu bên nhân bào RNA polymeraza III đọc mã cho sinh tổng hợp RNA ngắn RNA vận chuyển (tRNA) hoặc tRNA 5S Mỗi tế bào thực vật chứa đến vài triệu ribosome, mơ thực vật tăng trưởng mạnh có hoạt động sinh tổng hợp rRNA cao Ở sản phẩm hoạt động RNA polymeraza chưa tạo RNA hoàn chỉnh mà tạo tiền chất chúng Các tiền chất phải qua “cắt gọt” metyl hóa cịn lại kích thước cỡ 3000 – 3500 nucleotit kết hợp với protein tạo nên ribosome Mỗi mRNA khác nhau, tương ứng với khoảng 100.000 gen Mỗi mRNA có dãy mã để tổng hợp protein, ngồi cịn có thêm dãy mã nằm đầu để làm nhiệm vụ điều khiển trình dịch mã Đầu 5’ mRNA có dãy mã ngắn gọi mũ đầu 5’ (5’ cap) Mũ thường gốc qua nosine), chụp lên đầu 5’ phân tử mRNA sau RNA polymeraza II kết thúc trình đọc mã.Mã có nhiệm vụ bảo vệ mRNA lệnh cho trình tổng hợp protein khởi Đầu 3’ mRNA thường dãy mã độ 200 nucleotit tồn gốc ademosinem gọi tên poly A Cũng mã 5’, đuôi poly A gắn vào mRNA sau đọc mã, E poly (A) polymerase I.5.2 Dịch mã: Là trình sinh tổng hợp phân tử protein vào dãy mã phân tử mRNA Như thể thể gen chia mức, mức đọc mức dịch Để thấy rõ mức độ phức tạp thể gen 100.000 gen cây, xem xét cấu trúc gen mã hóa cho E polygalaclorunaza cà chua sản phẩm thể gen Trên gen mã hóa cho polygalaclorunaza có dãy số Kích thước từ 99 đến 953 nucleotit Hộp CAAT nằm nucleotit-31, thượng nguồn tín hiệu bắt đầu đọc ATG Quá trình đọc dịch cho hai đoạn peptit 71 356 a.amin Cuối peptit 79 a.amin bị loại hình thành phân tử E polygalaclorunaza có 356 a.amin -3- Hiện tượng dãy mã đọc xen lẫn với dãy mã mù phổ biến cấu tạo gen thực vật Chú ý phần nhỏ DNA thực vật biểu thông qua đọc dịch thành phân tử protein Các nghiên cứu cho thấy bảo thủ tính di trưyền thực vật tương đối Ngoại cảnh ảnh hưởng đến tính di truyền cách nhanh chóng, khơng cần hàng triệu năm tiến hóa ảnh hưởng di truyền qua đời sau Do ảnh hưởng bên ngoài, máy di truyền thực vật bị thay đổi : Sự xâm nhập DNA ngoại lai ( VK,virus) Sự chuyển dịch gen từ vị trí qua vị trí khác Sự chuyển dịch DNA từ lục lạp ti thể vào nhân bào Sự tồn gen nhảy (jumping gens) nét đặc trưng, thể nhiễm sắc sang thể nhiễm sắc khác vị trí khác thể nhiễm sắc Chúng nhảy vào dãy mã gen hoạt động làm cho gen bất hoạt ngược lại I.6 Tính bảo thủ gen di truyền biến dị: Hiện tượng di truyền biến dị mặt mâu thuẫn thống sống, nhờ tiến hóa thực Bản chất tượng có liên quan chặt chẽ với hình thành tồn axit deoxyribonucleic (DNA) Vì DNA phân tử sống, sợi sống, chuỗi xoắn kép sống Cơ chế sinh tổng hợp DNA, vai trị khn mẫu DNA tổng hợp protein (enzim) thông qua phân tử axit ribonucleic (RNA) khám phá để lí giải tượng di truyền biến dị, p/p CN gen, hầu hết p/p xử lý DNA RNA Di truyền biến dị nằm thể gen trình phát triển sinh vật Ngày gen đo đạc, chụp ảnh xác định xác mức phân tử , hay nhiều đoạn DNA tương ứng với tính trạng Cơ chế sinh tổng hợp DNA theo khn mẫu đảm bảo tính bảo thủ tượng di truyền qua hệ Những thay đổi dù nhỏ, đoạn DNA tương ứng với gen, nhiều dẫn đến thay đổi tính trạng, sở tượng biến dị PHẦN II CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO I Xác ị dò g óa ge : I.1 Chiết suất tinh DNA từ mơ thực vật: Có nhiều phương pháp tùy theo mục đích sử dụng DNA để làm chiết xuất loại mô Khuynh hướng chung tìm phương pháp đơn giản nhất, thời gian thao tác ngắn DNA thu có đủ độ tinh khiết độ nguyên vẹn 50 – 100 KG cần thiết cho thao tác công nghệ gen thực vật cắt E giới hạn, chạy phản ứng PCR ….Muốn thu DNA có chiều dài 100 – 5.000 KG phải dùng phương pháp điện di có điện trường khơng liên tục *Chiết suất tinh DNA tổng số Tế bào thực vật nghiền vỡ điều kiện lạnh làm cho DNA hòa vào đệm chiết SDS (sodium dedecyl sulfatc) CTAB (celytrimethyl amonium bromide) thêm vào để giúp DNA hòa dễ hơn, đầy đủ vào dịch đệm EDTA có tác dụng gắn chặt -4- ion Mg+ yếu tố cần cho hoạt động nucleotit phân huỷ DNA trình chiết Protein tách khỏi DNA phenol chloroform Chiết suất DNA từ mô thực vật Lá nghiền với đệm chiết CATB có chứa mercabthoethamol DNA chiết hỗn hợp cloroform izoamila, kết tủa izphopanol, sau qua số bước để rửa tinh khiết DNA Chiết xuất DNA thực vật để chạy PCR Mẫu sử dụng lượng Q trình chiết đơn giảm hóa nhiều để thao tác nhanh làm lúc nhiều mẫu, DNA chiết hoàn toàn đủ độ lớn độ để chạy PCR I.2 Cắt DNA Enzim giới hạn: * Các enzim giới hạn: Enzim giới hạn nhóm endonucleoaza cắt phân tử DNA vị trí có dãy mã nucleotit định mà chúng có khả nhận Thuộc tính quan trọng enzim giới hạn cho phép cắt phân tử DNA vị trí chọn sẵn Mỗi enzim giới hạn hoạt động tối thích điều kiện khác Ứng dụng chủ yếu melylaza để bảo vệ số vị trí DNA mà người ta không muốn bị cắt enzim giới hạn I.3 Điện di DNA sản phẩm cắt DNA gel agaroze: Các đoạn DNA cắt từ phân tử DNA có khối lượng khác diện tích khác tách di chuyển từ cực âm sang cực dương máy điện di điện trường có điện cường độ thích hợp I.4 Nối đoạn DNA ligase: DNA ligase enzim nối đoạn DNA lại với Điểm nối lại đầu 3’ đoạn DNA đầu 5’ đoạn lại Năng lượng để nối ATP Ứng dụng quan trọng ligase cấu trúc vector plasmid cấu trúc DNA khác có đủ dãy mã cần thiết cho việc chuyển gen, biểu gen, sàng lọc tế bào chuyển gen I.5 Dòng hóa gen: Dãy mã tự nucleotit gen thường biết thơng qua tìm hiểu dãy mã tự axit amin sản phẩm nó, protein Sau chiết xuất, tinh protein để giải mã, dãy mã tự axit amin chúng *Nhân dòng gen: Nhân dòng gen tiến trình gen mục tiêu định vị nhân lên từ DNA tách chiết từ cá thể Khi tách chiết DNA khỏi cá thể tất gen tách khỏi cá thể DNA chứa đến hàng ngàn gen khác nên nhà di truyền học phải tìm gen Ngân hàng gen: Bởi khơng thể định vị gen DNA mắt thường, nhà khoa học phải tạo ngân hàng gen -5- Ngân hàng gen tập hợp khuẩn lạc vi khuẩn sống có mang nhiều đoạn DNA từ cá thể Đây nguồn gen mục tiêu Hình 2.1 Quy trình xây dựng ngân hàng gen Xâ dự g gâ g ge Xây dựng ngân hàng gen cần DNA tách chiết, enzyme cắt giới hạn plasmid Bước DNA tách chiết từ cá thể có chứa gen mục tiêu cắt enzyme giới hạn thành nhiều mảnh có kích thước gen Bước plasmid vi khuẩn xử lý enzyme giới hạn Bước DNA có kích thước gen plasmid xử lý trộn chung với tube Một số đoạn DNA cắt enzyme nối với plasmid tạo thành plasmid tái tổ hợp Bước plasmid tái tổ hợp sau chuyển vào tế bào vi khuẩn điện biến nạp hoá biến nạp Bước vi khuẩn tăng trưởng đĩa môi trường cho phép hình thành khuẩn lạc Tất khuẩn lạc đĩa môi trường gọi ngân hàng gen Bước ngân hàng gen sàng lọc để tìm khuẩn lạc có chứa gen mục tiêu cách phát trình tự DNA gen mục tiêu hay protein mà gen mã hố hay sử dụng mẫu dị Vì vậy, trước sàng lọc ngân hàng gen, nhà khoa học phải biết trình tự gen mục tiêu hay gen gần giống hay protein mà gen mã hố mẫu dị thiết kế cho gen Khi vi khuẩn nhân lên tạo nhiều DNA tái tổ hợp dẫn đến số lượng gen tăng lên, nhờ việc phát gen hay protein dễ dàng Sau xác định khuẩn lạc có chứa gen mục tiêu, vi khuẩn nhân dịng để tạo hàng triệu plasmid tái tổ hợp có chứa gen II Các kỹ t ật c ể ge : -6- Thông tin di truyền acid deoxyribonucleic (DNA) tồn dạng chính: - DNA thể bậc cao có DNA nhân DNA quan tử - DNA vi sinh vật - DNA plasmid Biến nạp thông tin di truyền (chuyển gen) k thuật sử dụng DNA tinh khiết để đưa vào thể hay tế bào khác theo dõi biểu thông tin di truyền Để biến nạp hiệu nguyên liệu di truyền vào tế bào vật chủ, cấu trúc di truyền cần thiết kế thích hợp cho hợp biểu gen ngoại lai Cấu trúc di truyền phải mang gen thị chọn lọc (selectable marker gen: gen mã hóa protein khử độc hóa chất bổ sung mơi trường ni cấy, cho phép sinh trưởng ưu tiên tế bào có DNA ngoại lai hợp nhất) sàng lọc (screenable marker gen: gen mã hóa protein cho kết sản phẩm sống sót nhờ xác định tế bào biến nạp thể gen) để nhận biết hiệu biến nạp gen Một cấu trúc di truyền đặc trưng bao gồm: gen khởi đầu (promoter), gen mã hóa (coding gen) gen kết thúc (terminator) Các gen mã hóa đưa vào mô thực vật nhờ vào vector plasmid Hai promoter chủ yếu thường sử dụng cho biến nạp gen thực vật là: promoter CaMV 35S (cauliflower mosaic virus) thích hợp cho biểu DNA ngoại lai hai mầm promoter ubiquitin ngô thích hợp cho biểu mạnh DNA ngoại lai mầm Các mẫu vật (các phận mô dùng để biến nạp) thích hợp cho biến nạp gen mẫu vật địi hỏi thời gian ni cấy trước sau biến nạp ngắn Nhiều nghiên cứu cho thấy thời gian kéo dài mô nuôi cấy thường tạo đột biến di truyền làm khả tái sinh biến nạp gen Các mẫu vật sử dụng chuyển gen thường là: protoplast, phơi non callus có nguồn gốc từ hạt (lúa mì), mơ ni cấy phát sinh cụm chồi, trụ phơi (có nguồn gốc từ hạt non hạt già) dùng để biến nạp trực tiếp DNA ngoại lai vào mô phân sinh hai mầm (legumes, ) Trong số trường hợp, biến nạp thông qua nuôi cấy phát sinh phôi (embryogenic culture) thực được, chẳng hạn loài tùng bách, loài ăn số lồi khác Cơng nghệ chuyển gen (biến nạp gen) thực việc chuyển gen ngoại lai vào tế bào mơ thực vật Có nhiều phương pháp chuyển gen khác thực vật, trình bày số phương pháp chủ yếu: II.1 Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes hai loài vi khuẩn gây bệnh cho thực vật sử dụng vector tự nhiên để mang gen ngoại lai vào mơ tế bào thực vật A tumefaciens có chứa plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) tác nhân truyền bệnh cho Khi bị nhiễm A tumefaciens qua vết thương, biểu bệnh rõ khối u hình thành chỗ lây nhiễm Sự hình thành khối u sau tiếp tục mà khơng cần thiết phải có diện vi khuẩn Khả có A tumefaciens chuyển đoạn DNA Ti-plasmid (T-DNA) xâm nhập vào hệ gen bị bệnh -7- Hình 2.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens II.2 Ti-Plasmid: Trong giới động-thực vật tồn thể plasmid, vòng DNA tự sinh sản độc lập Ở vi khuẩn động-thực vật, plasmid liên quan tới yếu tố giới tính tế bào, đến khả chống chịu loại kháng sinh Đặc điểm quan trọng plasmid chúng liên kết vào nhiễm sắc thể tồn bên ngồi nhiễm sắc thể cách độc lập Hình 2.3 Ti-Plasmid Các plasmid Agrobacterium sử dụng vào công nghệ gen thực vật hai dạng vector cis trans Đây hai dạng vector thuận lợi để tái tổ hợp gen ngoại lai chuyển vào tế bào thực vật Dạng cis sử dụng Ti-plasmid tế bào vật chủ Agrobacterium tumefaciens mà khơng có tham gia plasmid vi khuẩn khác Vùng T-DNA Tiplasmid thiết kế lại để gắn gen ngoại lai mong muốn, phần lại Tiplasmid giữ nguyên Agrobacterium tumefaciens dùng làm tế bào vật chủ để nhân lên nhiều Ti-plasmid chuyển gen Dạng trans hay binary dạng sử dụng hai hay nhiều loại plasmid vi khuẩn lúc Trước tiên, plasmid E coli chứa đoạn T-DNA giới hạn bờ phải (right border-RB) bờ trái (left border-LB) mang gen ngoại lai (gen đích) thiết kế nhân lên vi khuẩn E coli Tiếp đến plasmid mang gen ngoại lai chuyển nạp vào vi khuẩn Agrobacterium nhờ helper plasmid (quá trình triparental matting) Vi khuẩn Agrobacterium mang sẵn loại plasmid khác chứa vùng vir (virulence region) có chức quan trọng trình chuyển gen ngoại lai Sự tồn song song hai plasmid tương tác lẫn việc chuyển gen vào tế bào thực vật Như vậy, gen ngoại lai vùng DNA giúp trình chuyển gen (vùng vir) không nằm plasmid nên hệ chuyển gen gọi hệ trans -8- Hình 2.4.Qui trình chuyển gen Agrobacterium tumefaciens II.3 T-DNA: T-DNA nghiên cứu k Đó đoạn DNA có kích thước 25 kb chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine gen gây khối u (oncogenes) Trong Ti-plasmid, vị trí T-DNA giới hạn RB LB Ngồi TDNA, Ti-plasmid cịn có vùng DNA mã hóa cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả lây nhiễm tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism) Trong vùng DNA Ti-plasmid, T-DNA, nghiên cứu nhiều vùng DNA phụ trách khả lây nhiễm gọi vùng vir Sản phẩm hoạt động gen nằm vùng vir tác động kích thích hợp chất phenol tiết từ vết thương loạt protein đặc hiệu virE2, virB, virD, virD2, virC1 Các protein nhận biết vết thương chủ thích hợp (hầu hết hai mầm), kích thích sản sinh đoạn T-DNA, bao bọc che chở đoạn DNA giúp chúng tiếp cận với hệ gen chủ cách an toàn Khi nhiễm A tumefaciens, T-DNA nạp vào hệ gen chủ bắt đầu hoạt động sản sinh auxin, cytokinin opine, toàn sinh trưởng bị rối loạn, tế bào phân chia vô tổ chức tạo khối u Opine vi khuẩn sử dụng loại “thức ăn” Nhờ gen chuyển hóa opine Ti-plasmid Cơ chế lây nhiễm A rhizogenes hai mầm tương tự, vùng T-DNA A rhizogenes có gen sản sinh auxin, thay đổi hình thái thực vật chúng tạo nhiều rễ tơ (hairy roots) bị nhiễm bệnh -9- Trên thực tế bệnh cây, Agrobacterium gây hại hai mầm, người ta cho chúng đưa T-DNA vào hệ gen hai mầm Gần đây, nhiều tác giả chứng minh nhiễm vi khuẩn, mầm sản xuất opine khai thác khả biến nạp gen Agrobacterium vào mầm II.4 Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào mô thực vật nh Agrobacterium tumefaciens: Cơ chế gây bệnh Agrobacterium sau xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào máy di truyền tế bào thực vật, dẫn đến rối loạn chất sinh trưởng nội sinh, tạo khối u (trường hợp A tumefaciens) rễ tơ (trường hợp A rhizogenes) Khả chuyển gen khai thác để chuyển gen ngoại lai vào máy di truyền tế bào thực vật theo ý muốn Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, vi khuẩn A tumefaciens phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương Quá trình thực nhờ gen chvA chvB Gen chvB mã hố protein liên quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vịng, gen chvA xác định protein vận chuyển, định vị màng tế bào vi khuẩn Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng thành tế bào màng sinh chất β-1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật Nếu khơng có tiếp xúc này, khơng có dẫn truyền T-DNA Các sản phẩm protein vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật Các loại protein cần thiết cho q trình cắt T-DNA khỏi Tiplasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân cuối xâm nhập vào genome chủ Thực chất riêng T-DNA Ti-plasmid chuyển vào genome tế bào thực vật, mà khơng cịn phần khác Q trình dẫn truyền sản phẩm gen vir (vùng vir) gen chv định mà không liên quan đến gen khác T-DNA Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB LB T-DNA) có vai trị vị trí cảm ứng cho sản phẩm tổ hợp gen vùng vir, đặc biệt protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật Chúng hoạt động tín hiệu nhận biết khởi động trình dẫn truyền Trước hết gen virA tổ hợp gen vùng vir phosphoryl hoá nhờ tác động hợp chất phenol acetosyringone giải phóng từ tế bào thực vật tổn thương Sản phẩm trình lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG Sản phẩm gen virG liên tiếp làm hoạt hóa tồn gen vir lại, mà hai gen cuối hoạt hóa gen virB virE Trước đó, gen virD hoạt hố, sản phẩm cảm ứng nhận biết RB LB T-DNA làm đứt phần T-DNA khỏi DNA Ti-plasmid thành sợi đơn Đồng thời q trình phosphoryl hóa làm thay đổi thẩm xuất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm bị thủng Các sợi đơn T-DNA gắn vào protein gen virE tổng hợp dịch chuyển phía màng tế bào vi khuẩn Ngay sau đó, sợi T-DNA trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật Cầu nối tiếp hợp (conjugation) hai tế bào cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành Khi T-DNA chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng xâm nhập vào genome tế bào thực vật (integration) ổn định di truyền gen bình thường khác - 10 - II.5 Các gen thị chọn lọc gen thị sàng lọc: Các gen thị chọn lọc chung mã hóa protein khử độc nhân tố ức chế trao đổi chất kháng sinh chất diệt cỏ (herbicide) Các gen thị sàng lọc thường sử dụng gen β-glucuronidase (gusA), luciferase gần gen mã hóa protein phát hu nh quang màu xanh lục (green fluorescent) sứa Bằng phương pháp sinh học phân tử tạo cấu trúc DNA plasmid, ngồi gen khởi động (promoter gene), gen vi khuẩn Agrobacterium giúp cho DNA plasmid gắn vào gen thực vật, gen ngoại lai cần chuyển vào cịn có gen giúp phân lập tế bào mơ thí nghiệm Các gen lắp ghép vào DNA plasmid với mục đích gọi gen thị chọn lọc hay gen thị sàng lọc Gen thị chọn lọc thường dùng gen mã hóa cho số enzyme có vi khuẩn điều kiện tự nhiên mà khơng có giới thực vật Sau chuyển gen, thấy enzyme vi khuẩn hoạt động suy tồn DNA plasmid gắn vào gen thực vật gen ngoại lai mà ta cần chuyển trở thành phận máy di truyền thực vật Các gen thị thường dùng gen gus A (β-glucuronidase), gen npt II (neomycin phosphotransferase), gen lux (luciferase), gen cat (chloramphenicol acetyltransferase), gen nos (nopaline synthase) Gen npt II Enzyme neomycin phosphotransferase (npt II) enzyme vi sinh vật có trọng lượng phân tử khoảng 25 kD, xúc tác cho phản ứng phosphoryl hóa số kháng sinh gốc aminoglycoside neomycin, kanamycin G148 Trong phản ứng này, nhóm phosphate ATP gắn vào phân tử chất kháng sinh làm trở nên bất hoạt ngăn trở liên kết kháng sinh với ribosome Gen bar Gen bar tên gọi gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT), có tác dụng làm độc tính phosphinothricin (PPT), hoạt chất thuốc trừ cỏ Bialaphos Basta Gen bar tạo dòng từ dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus Phương pháp đơn giản để kiểm tra có mặt gen bar phương pháp trực tiếp Mô, tế bào chuyển gen đặt mơi trường có nồng độ phosphinothricin khác (hoặc thuốc trừ cỏ tương ứng) so sánh sinh trưởng mô, tế bào đối chứng đặt môi trường Gen gus A gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase β-glucuronidase hydrolase xúc tác cho phân giải β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết β-glucuronide thường dùng phản ứng để nhận biết tồn gen gus A X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) Dung dịch X-Gluc không màu tác động enzyme β-glucuronidase chuyển sang màu xanh chàm đặc trưng Gen lacZ Enzyme β-galactosidase (lac ) trọng lượng phân tử 116 kD, pH tối thích 77,5 mã hóa gen lacZ Gen lac E coli dùng phổ biến công nghệ gen vi sinh có sẵn hệ thống phương pháp kiểm tra nhạy với thuốc thử X-Gal Sự tồn hoạt động lac tế bào thực vật khẳng định Vì trước kiểm tra có mặt gen lac ngoại lai, cần phải bất hoạt gen lac nội sinh glutaraldehyde - 11 - Gen cat Được phân lập tạo dòng từ dòng vi khuẩn Tn9, gen gây khả kháng chloramphenicol vi khuẩn nói chung Gen cat dùng rộng rãi công nghệ gen động vật thực vật gen cat mã hóa cho enzyme chloramphenicol acetyltransferase (CAT) Enzyme xúc tác phản ứng acetyl hóa hai vị trí phân tử chloramphenicol làm bất hoạt Đây phương pháp sử dụng phổ biến phịng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật nước giới Nguyên tắc phương pháp sử dụng viên đạn có kích thước hiển vi, có tỷ trọng cao để đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ màng tế bào, đưa lớp DNA bọc tiếp cận với máy di truyền tế bào Hạt tungsten vàng có đường kính 1-1,5 m dùng làm vi đạn (microprojectile) Vi đạn trộn với DNA theo tỷ lệ thích hợp với chất phụ gia sau kết tủa DNA bao quanh vi đạn, hỗn hợp làm khô trên đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5-0,8 cm Đĩa kim loại gắn vào đầu viên đạn lớn (macroprojectile) vừa khít với nịng súng Thường đạn lớn làm nhựa nén hay vật liệu nhẹ Khi bắn, áp suất đẩy viên đạn lớn với tốc độ cao Ra khỏi đầu nòng, lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại, vi đạn tiếp tục qu đạo với gia tốc lớn đến đích xuyên vào tế bào Một tỷ lệ định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào biểu hiện, thực trình biến nạp gen Hình 2.5 Sơ đồ súng bắn gen *Làm viên đạn Viên đạn trộn với DNA tỷ lệ tích hợp với chất phụ gia sau kết tủa DNA bao quanh viên đạn, hỗn hợp làm khô dĩa kim loại mỏng, kích thước 0,5 – 0,8 cm Đĩa kim loại gắn vào đầu viên đạn lớn vừa khít với nòng súng Thường đạn lớn làm nhựa hay vật liệu nhẹ Khi bắn áp suất đẩy viên đạn lớn với tốc độ cao khỏi đầu nòng súng lưới thép mịn cản viên đạn lớn đạn lại, hạt vi đạn tiếp tục quĩ đạo với gia tốc lớn đến đích nguồn vào tế bào Một tỉ lệ định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào biểu hiện, thực trình chuyển gen * Các mẫu súng bắn gen: 1) Súng bắn gen PDS-1000: - 12 - Áp lực đẩy viên đạ lớn tạo thuốc súng, vận tốc đầu nòng đạt 800m/giây Tốc độ viên đạn đạt 1300m/giây cách lưới chắn 2cm 1 3 5 Hình 2.6 Cấu tạo súng bắn gen PDS-1000 1.kim hoả 2.thuốc súng 3.viên đạn lớn 4.nòng súng 5.lưới chặn 6.mơ thực vật Hình 2.7 Phóng đại phần đầu nòng lưới chắn 1.đầu nòng 2.bệ chắn 3.lưới chắn 4.viên đạn lớn 5.viên đạn 2) Súng bắn gen PDS-1000He: Trong helum nén dùng để gia tốc viên đạn lớn thay cho thuốc súng, lưới chắn kim loại cài đặt bệ chặn Viên đạn trộn với DNA làm khô đĩa kim loại nhỏ, sau gắn lên đầu viên đạn lớn Loại dùng phổ biến A Phần đầu pipton nhựa, thể tích khoảng 1ml Đoạn đầu nhọn pipton chứa agarose (tơ đen) có hoà DNA ngoại lai, áp vào đỉnh sinh trưởng chồi phụ bị chậu chứa đất trồng, đất ẩm nối với cực dương hệ điện di Hình 2.8 Cấu tạo PDS-1000He A B - 13 - Hình 2.9 Cấu tạo PDS-1000HC 1.Bình chứa HC áp suất cao, 2.Màng giữ áp suất HC bình 1,màng tách áp suất HC tăng vọt cho khí HC với tốc độ cao, 3.Viên đạn lớn, đĩa kim loại mỏng, hỗn hợp DNA vi đạn kết tủa làm khô, vi đạn nằm mặt nước đĩa, Bệ bắn, 5.Lưới chắn, 6.Buồng bắn gen áp chân không, 7.Mô thực vật Súng bắn gen Sautter 1991 Để tránh yếu tố gây không đồng vận tốc vi đạn không dùng viên đạn lớn mà tạo điều kiện để hạt vi đạn lơ lửng khơng khí trước chúng gia tốc Ống pipton ống thép, có ống nhỏ thẳng góc với trục đầu ống nhỏ nằm trục ống Trong ống nhỏ chứa 20l hỗn hợp vi đạn vàng DNA Ở áp suất 60bar tốc độ khí 2m/giây, hỗn hợp lán thành sương mù có kích thước XMIRON, hạt thổi qua ống vi quản thuỷ tinh có =300m-400m dài 10mm Các hạt sương mù chứa vi đạn DNA gia tốc chuyển qua ống vi quản dướI ảnh hưởng chân không buồng Lượng hỗn hợp vi đạn DNA đo xác bơm vi tiêm Hình 2.10 Súng bắn gen Biorad Thiết bị điện xung (electroporator) thiết bị có khả tạo xung điện thời gian ngắn (5-6 phần nghìn giây) điện (pulse strenght) xác (500 V/cm) với thời gian tắt dần (decay time) 20 ms Protoplast đặt hai kim loại cách từ 1-4 mm cuvette nhựa Ở điện cao, xung điện tạo lỗ tạm thời (cỡ 30 nm) màng protoplast DNA bên ngồi xâm nhập vào chất nguyên sinh Xung điện tạo giải phóng dịng điện chứa điện dung (capacitor) từ điện cực qua điện cực khác Các vật nằm không gian hai điện cực chịu tác động tắt dần xung điện Xung điện xác định hai giá trị chênh lệch điện thời gian tắt dần Ở thiết bị điện xung đại, thời gian tắt dần thu lại ngắn biểu đồ xung điện biểu diễn gần cột vng Nói chung, thiết bị điện xung hoàn chỉnh nhiều hãng cung cấp để thực chuyển gen vào vi sinh vật, protoplast thực vật tế bào động vật - 14 - Vi tiêm (microinjection) k thuật sử dụng phổ biến công nghệ tế bào động vật Trên hiển vi thường, DNA plasmid tiêm vào protoplast thực biến nạp gen thành công nhiều đối tượng thực vật Tuy nhiên, K thuật phịng thí nghiệm sử dụng, thao tác vi tiêm kính hiển vi địi hỏi thiết bị vi thao tác cực nhạy, thiết bị kéo mài kim tiêm từ ống thủy tinh Ngồi ra, cịn địi hỏi k thao tác kiên nhẫn cao k thuật viên Hình 2.11 Chuyển gen vi tiêm PEG (polyethylene glycol) với có mặt Ca2+ tác nhân dung hợp sử dụng phổ biến lai soma Krens cs (1982) người chứng minh dùng PEG để chuyển trực tiếp DNA vào protoplast thực vật K thuật đòi hỏi phải ni protoplast với DNA trần có mặt PEG CaCl2 Sau hòa tan hỗn hợp, protoplast phân lập, rửa cuối dàn trải môi trường chọn lọc Tần số chuyển nạp trung bình protoplast thuốc khoảng từ 10-2 10-5 Cách tiến hành: - Bổ sung PEG sau DNA - Xử lý shock nhiệt protoplast 46oC làm làm lạnh băng PHẦN III CHUYỂN GEN TRONG THỰC TẾ TRỒNG TRỌT I Tì ì câ trồ g c ể ge tr t ế giới: Năm 2006, diện tích tồn cầu trồng chuyển gen tiếp tục tăng cao vượt ngưỡng 100 triệu , lần 10 triệu nông dân (10,3 triệu) 22 nước canh tác chuyển gen, cao so với 90 triệu 8,5 triệu nông dân 21 nước năm 2005 Diện tích chuyển gen tịan cầu tăng 60 lần 11 năm thương mại hóa, làm cho trồng chuyển gen coi k thuật trồng chấp nhận nhanh lịch sử đại Diện tích chuyển gen tồn thề giới năm 2006 102 triệu ha, tương đương 250 triệu mẫu Anh, cao so với 90 triệu hay 220 triệu mẫu Anh năm 2005 Sự gia tăng 12 triệu hay 30 triệu mẫu Anh năm 2005 2006, gia tăng cao thứ hai năm trở lại đây, tương đương với tỷ lệ tăng trưởng hàng năm 13% năm 2006 Đáng ghi nhận nửa (55% hay 3,5 tỷ người) dân số 6,5 tỷ người sống 22 nước có canh tác chuyển gen năm 2006 tạo lợi nhuận - 15 - cách đáng kể Cũng nửa (52% hay 776 triệu 1,5 tỷ ha) diện tích đất trồng giới 22 nước năm 2006 canh tác chuyển gen Năm 2006, 22 nước trồng chuyển gen, có 11 nước phát triển 15 nước cơng nghiệp, tính theo thứ tự diện tích, Hoa k dẫn đầu, tiếp đến Achentina, Brazil, Canada, Ấn độ, Trung Quốc, Paraguay, Nam phi, Uruguay, Philippin, Úc, Rumani, Mê hi cô, Tây Ban nha, Cơlơmbia, Pháp, Iran, Honduras, Cộng hịa Czech, Bồ đào nha, Đức Sloavakia Năm 2006, đứng sau Hoa k Achentina, Brazil, Canada, Ấn độ Trung quốc nước chấp nhận trồng chuyển gen rộng rãi, với Ấn độ lần thay Trung quốc vị trí số giới bơng BT Hoa k giữ vị trí dẫn đầu với 54,6 triệu (chiếm 53% diện tích chuyển gen tịan cầu), Achentina với 18,0 triệu ha, Brazil – 11,5 triệu ha, Ấn độ - 3,8 triệu Trung quốc 3,5 triệu Cây đậu nành chuyển gen giữ chuyền gen chủ yếu năm 2005, đạt 58,6 triệu (chiếm 57% diện tích chuyển gen toàn cầu), bắp (25,2 triệu – 25%), (13,4 triệu – 13%) cải dầu (4,8 triệu – 5%) Giống cỏ alfafa kháng thuốc trừ cỏ, lọai chuyển gen lâu năm đưa vào trồng với diện tích 80.000 Hoa k giống kháng thuốc trừ cỏ RR@ Flex đưa với diện tích 800.000 Hoa k Úc Giống đu đủ kháng virus, lọai ăn Ủy ban An tòan Sinh học quốc gia Trung quốc khuyến cáo thương mại hóa vào quý IV/2006 Năm 2006, giống đậu nành, bắp, cải dầu cỏ alfalfa kháng thuốc trừ cỏ tiếp tục chiếm ưu với 68% hay 69,9 triệu ha, giống kháng sâu BT với 19,0 triệu (19%) giống chuyển gen xếp chồng (chịu thuốc trừ cỏ kháng sâu chiếm 13,1 triệu (13%) Các giống chuyển gen xếp chồng nhóm giống tăng trưởng nhanh tới 30% năm 2005 2006, so với 17% nhóm kháng sâu 10% nhóm kháng thuốc trừ cỏ Cây chuyển gen trồng 10,3 triệu nông dân 22 nước năm 2006, so với 8,5 triệu nông dân 21 nước năm 2005 Đặc biệt 90% hay 9,3 triệu nông dân nghèo từ nước phát triển, tăng thu nhập từ chuyển gen Trong chủ yếu từ Trung Quốc – 6,8 triệu nông dân Ấn Độ - 2,3 triệu Trong giai đọan 1996 đến 2006, tỷ lệ diện tích trồng chuyển gen nước phát triển tăng hàng năm Hơn 1/3 diện tích (40%) chuyển gen năm 2006, tương đương với 40,9 triệu nước phát triển Sư tăng trưởng năm 2005 2006 7,0 triệu hay 20% tăng trưởng nước cao so với nước công nghiệp – 5,0 triệu hay 9% tăng trưởng Sự tác động tích lũy tồn cầu chuyển gen từ năm 1996 đến 2005 đem lại lợi nhuận cho nông dân trồng chuyển gen 27 tỷ USD ( 13 tỷ USD nước phát triển 14 tỷ USD nước công nghiệp Đã làm giảm tổng lượng thuốc trừ sâu từ năm 1996 đến 2005 224.000 họat chất, tương đương với việc giảm 15% tác động môi trường xung quanh sử dụng thuốc trừ sâu lọai trồng II C ể ge câ trồ g c í II.1 Cây ngơ: : - 16 - Cây ngô biến nạp gen tái sinh từ protoplast biến nạp xung điện bất thụ (Rhodes cs 1988) Có thể dùng phôi ngô nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh hữu thụ mang gen biến nạp, sử dụng phương pháp bắn gen chọn lọc chất diệt cỏ “bialaphos” cho kết mô callus phát sinh phôi biến nạp gen Các biến nạp gen hữu thụ tái sinh, ổn định di truyền biểu gen bar (kháng chất diệt cỏ glufosinate không chọn lọc) với hoạt tính chức enzyme phosphinothricin acetyltransferase quan sát hệ sau Hiện nay, biến nạp gen ngô phương pháp bắn gen sử dụng rộng rãi Gần đây, kết biến nạp gen gián tiếp ngô nhờ Agrobacterium thông báo Các thể biến nạp gen dịng ngơ lai gần (inbredline) A188 tái sinh sau nuôi cấy chung (cocultivation) vector “super-binary” với phơi non Tần số thơng báo dịng A188 khoảng 5-30% Các thể lai hệ thứ dòng A188 dòng lai gần khác biến nạp với tần số khoảng 0,4-5,3% (tính theo số biến nạp gen độc lập/phôi) Bảng 3.1 Các trồng biến nạp gen S Lồi Phương pháp Thử nghiệm đồng tt biến nạp gen ruộng Chuối Bắn gen/Agrobacterium Luá mạch Bắn gen Kháng vi rus Đậu tây Bắn gen Canola Bắn gen/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ, điều khiển thụ phấn Sắn Bắn gen/Agrobacterium Ngô Bắn gen/Agrobacterium Kháng côn trùng, chống chịu chất diệt cỏ Bông Bắn gen/Agrobacterium Kháng côn trùng, chống chịu chất diệt cỏ Đu đủ Bắn gen/Agrobacterium Kháng virus Đậu phụng Bắn gen/Agrobacterium Kháng virus Bạch dương Bắn gen/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ Khoai tây Agrobacterium Kháng côn trùng, kháng virus, chống chịu chất diệt cỏ Lúa Bắn gen/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ Đậu tương Bắn gen/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ Bí Bắn gen/Agrobacterium Kháng virus Củ cải đường Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ Mía Bắn gen - 17 - Hướng dương Bắn gen Cà chua Agrobacterium Lúa mì Bắn gen - Quả chín muộn, kháng virus - II.2 Cây l a: Phương pháp bắn biến nạp gen hiệu kiểu gen độc lập, biến nạp gen vật sử dụng phôi non nguồn gốc từ hạt trưởng Hygromycin B marker dùng cho lúa Tần số cao tới 50% (tính theo số có nguồn gốc độc lập/số gen) Hình 3.1 Chọn lọc hạn cách chuyển gen Gần đây, k thuật thơng qua Agrobacterium cải tiến quan trọng có hiệu với k thuật bắn gen gen cho phép thực lúa 40 giống thành công Mẫu callus có thành chọn lọc thường biến nạp biến nạp gen mẫu bắn giống lúa chịu chịu hạn cho lúa biến nạp gen lúa có tương đương II.3 Cây l a mì: Phương pháp bắn gen sử dụng để biến nạp gen lúa mì DNA ngoại lai bắn vào vảy nhỏ (scutellum) phôi non hai giống mùa xuân giống mùa đông Các callus chống chịu chọn lọc phosphinothricin nhân tố ức chế trao đổi chất tương tự basta, bialaphos glufosinate amonium Chọn lọc hợp chất không hiệu kết số lớn thất thoát Phân tích di truyền phân tử xác nhận hợp ổn định gen biến nạp Nói chung, cơng nghệ di truyền lúa mì cịn tập trung hai giống đặc trưng có khả tái sinh nhanh, thích hợp với phương pháp bắn gen II.4 Cây l a mạch: Wan Lemaux (1994), tái sinh số lượng lớn lúa mạch biến nạp gen độc lập, tự thụ phấn Các phơi hợp tử non, callus hình thành phơi có nguồn gốc từ tiểu bào tử hạt phấn dùng để bắn gen với plasmid mang gen bar gusA đơn độc phối hợp với plasmid khác mang gen protein vỏ virus gây bệnh lùn vàng lúa - 18 - mạch Kiểm tra khả nảy mầm phôi non để phân lập biểu hoạt tính bar mơi trường chứa bialaphos, chưa phải chất thị tốt cho có mặt khơng gen II.5 Cây đậu t ng: Kết đậu tương phục hồi thành công biến nạp gen nhờ Agrobacterium Phương thức dựa vào phát sinh chồi từ mầm giống Peking chọn lọc cho tính mẫn cảm với Agrobacterium Các mẫu mầm xâm nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kháng kanamycin có hoạt tính gusA, kháng kanamycin chống chịu glyphosate Có thể biến nạp gen hiệu vào protoplast đậu tương phương thức thông dụng khó tái sinh Để biến nạp gen vào giống đậu tương khác người ta phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản - phương thức tái sinh độc lập (dựa sở tăng sinh cụm chồi từ vùng chung quanh mô phân sinh trụ phôi) với tăng gia tốc vi đạn (particle) có phóng điện để phân phối DNA ngoại lai Hàng trăm đậu tương có nguồn gốc độc lập thu kết biến nạp cho nhiều phenotype khác Nói chung, dịng đậu tương biến nạp gen có nhiều gen biến nạp (số khoảng từ 1-50 thường thay đổi từ 2-10) Phân tích DNA (southern blot) hệ sau gen phức cho thấy tất tách rời, thể biến nạp sơ cấp diện kết biến nạp độc lập tái tổ hợp thống không xuất thường xuyên II.6 Cây bông: Phương thức biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens k thuật sử dụng để biến nạp gen vào giống Coker 312 (Umbeck 1987) Cây biến nạp gen giống phục hồi sau bắn gen vào dịch huyền phù nuôi cấy phát sinh phôi (Finer McMullen 1990) Hầu hết giống bơng có giá trị kinh tế khác tái sinh từ giai đoạn callus Một số giống tái sinh trình thiên biến dị dịng vơ tính KẾT LUẬN - Tóm lại cơng nghệ chuyển gen thực vật bậc cao mở cho hướng công tác tạo giống trồng nhằm đáp ứng nhu cầu ngày cao người đồng thời để giải tình trạng lương thực mà dân số ngày tăng nhanh diện tích đất phục vụ cho sản xuất nông nghịêp ngày giảm Nhìn chung việc ứng dụng chuyển gen có lợi ích rõ rệt sau: tăng sản lượng, giảm chi phí sản xuất, tăng lợi nhuận nơng nghiệp, cải thiện môi trường - Một số nguyên tắc sinh học việc chuyển gen: + Không phải tồn tế bào thể tính tồn + Các khác có phản ứng khơng giống với xâm nhập gen ngoại lai - 19 - + biến nạp tái sinh từ tế bào có khả tái sinh khả thu nhận gen biến nạp vào genome + Mô thực vật hỗn hợp quần thể tế bào có khả khác + Thành phần quần thể tế bào xác định loài, kiểu gen, quan, giai đoạn phát triển mô quan + Thành tế bào ngăn cản xâm nhập ADN ngoại lai + Khả xâm nhập ổn định gen vào genome không tỷ lệ với biểu tạm thời gen + Các ADN (trừ virus) xâm nhập vào genome tế bào vật chủ chưa đảm bảo liên kết ổn định với genome + Các ADN (trừ virus) không chuyển từ tế bào sang tế bào kia, nơi mà đưa vào + Trong đó, ADN virus xâm nhập vào genome chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào sang tế bào khác ngoại trừ mơ phân sinh - Q trình chuyển gen thực theo bước sau: + Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm + Phân lập gen + Gắn gen vào vector biểu để biến nạp + Biến nạp vào E.coli + Tách chiết ADN plasmid + Biến nạp vào mô tế bào thực vật + Chọn lọc cá thể biến nạp môi trường chọn lọc + Tái sinh biến nạp + Phân tích để xác định cá thể chuyển gen đánh giá mức độ biểu chúng - Một số phương pháp chuyển gen: + Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium: + Chuyển gen phương pháp bắn gen: + Chuyển nạp DNA ngoại lai vào protoplast xung điện: + Chuyển nạp DNA ngoại lai vào protoplast k thuật vi tiêm: + Chuyển nạp DNA ngoại lai vào protoplast PLO PEG: Hiện nước ta lĩnh vực nghiên cứu tạo sinh vật biến đổi gen, nghiên cứu chuyển gen vào trồng (GM) tiếp cận, đầu tư triển khai nghiên cứu, ứng dụng với trọng đặc biệt Nhiều gen quý có giá trị ứng dụng suất, chất lượng, khả chống chịu phân lập nghiên cứu nhằm chuyển vào trồng để tạo nên giống lý tưởng - 20 - ... (embryogenic culture) thực được, chẳng hạn loài tùng bách, loài ăn số lồi khác Cơng nghệ chuyển gen (biến nạp gen) thực việc chuyển gen ngoại lai vào tế bào mơ thực vật Có nhiều phương pháp chuyển gen. .. thái tế bào thực vật vấn đề quan trọng có tính chất định ứng dụng công nghệ gen chọn tạo giống thực vật Nếu sau chuyển gen, tế bào mô khả tái sinh, việc chuyển gen coi có ý nghĩa thực tế Khả... gắn vào gen thực vật, gen ngoại lai cần chuyển vào cịn có gen giúp phân lập tế bào mơ thí nghiệm Các gen lắp ghép vào DNA plasmid với mục đích gọi gen thị chọn lọc hay gen thị sàng lọc Gen thị