thực hành hóa sinh đại cương

PHÂN HIỆU ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM KHOA KHOA HỌC CƠ BẢN THỰC HÀNH HÓA SINH ĐẠI CƯƠNG (Thú y) HÀ THỊ LIÊN Lưu hành nội - 2019 -Yêu cầu SV: + Trước đến phòng thực hành: ôn lại kiến thức liên quan (cả hóa học), đọc trước thực hành + Phải mang theo tài liệu thực hành (bản cứng: giấy), khơng mang coi vắng (do nhìn điện thoại mà làm làm giảm chất lượng thực hành, dễ bị sai đọc không rõ…) + Đến (trễ 10’: trừ điểm), cấm thi: 10% số tiết trở lên (tương đương tiết trở lên) + Trong trình thí nghiệm: chăm chỉ, cẩn thận Làm xong, giải thích kết theo nhóm (80%/bài) (Vỡ dụng cụ: đền lại nhà trường, trừ điểm), dọn dẹp phòng…trước về, để lại dụng cụ cũ + Làm báo cáo (20%/bài) (làm nhà, nộp lại vào đầu buổi học tiếp theo, tới học mà chưa nộp trừ điểm, buổi cuối nộp sau ngày, khơng nộp rải rác (cơ khó quản lý) HÀ THỊ LIÊN Bài 1: Định tính protein I Mục tiêu: Sau làm thực hành xong, sinh viên: - Nhớ kiến thức lý thuyết tính chất protein enzyme - Thực phản ứng định tính protein - Giải thích tượng xảy - Phân tích ứng dụng thực tế thí nghiệm II Hóa chất, thiết bị, dụng cụ, nguyên liệu Thiết bị, dụng cụ: - Ống nghiệm: 50 - Pipet: Hóa chất: - Ninhydrin 0,1% - Cồn etylic 96% - Aceton - NaOH 10%, - Tinh thể ure - CuSO4 Nguyên liệu: - Trứng gà: - Gan heo: lạng III Nội dung: Người ta thường dùng phản ứng màu để nhận biết chất protein, nghiên cứu thành phần acid amin phân tử protein Phản ứng ninhydrin a) Nguyên tắc:Dung dịch protein, peptide axit amin đun nóng tạo phức chất có màu xanh tím Các axit amin peptit phản ứng với ninhydrin bị dezamin hóa, oxy hóa decacboxy hóa tạo NH 3, CO2, aldehyt tương ứng ngắn C so với axit amin ban đầu, ninhydrin dạng khử kết hợp trở lại với NH phân tử ninhydrin tạo sản phẩm ngưng kết có màu tím xanh HÀ THỊ LIÊN Phản ứng ninhydrin phản ứng đặc trưng để phát nhóm α-amin HÀ THỊ LIÊN b) Tiến hành Lấy ống nghiệm Ống (ống thí nghiệm): - Cho vào ống nghiệm 1ml dd protein trứng, - Thêm vào 1ml dd ninhydrin 0,1%, - Đun sôi 1-2 phút - Để nguội - Quan sát thay đổi màu sắc, giải thích Ống (ống đối chứng): Cho vào ml nước cất (không cho protein trứng), làm tương tự ống Kết tủa protein dung môi hữu cơ: a) Nguyên tắc: Protein chất keo ưa nước bề mặt phân tử protein có nhóm phân cực tích điện, có khả hấp thu phân tử nước lưỡng cực tạo thành màng nước bao quanh phân tử protein (vỏ hydrat) Dưới tác dụng yếu tố vật lý, hóa học làm trung hịa điện tích phân tử protein, phá vỡ màng nước dẫn đến protein bị kết tủa b) Tiến hành: Lấy ống nghiệm: Ống 1: giọt protein trứng + 20 giọt cồn etylic HÀ THỊ LIÊN Ống 2: giọt protein trứng + 20 giọt aceton Quan sát so sánh mức độ kết tủa ống Định tính protein Phản ứng Biure : a) Nguyên tắc: Các protein có acid amin gốc R có khả phản ứng tạo màu đặc trưng Phức Cu với biure Phức Cu với chuỗi polypeptide b) Tiến hành: Lấy ống nghiệm: HÀ THỊ LIÊN - Ống 1: Đun nhẹ tinh thể ure nóng chảy bắt đầu đơng cứng lại ngừng đun, để nguội thêm vào 1ml NaOH 10%, lắc cho tan thêm vào giọt CuSO Quan sát màu giải thích kết kết Chú ý: Khơng cho nhiều CuSO4 màu xanh CuSO4 lấn át màu phản ứng - Ống 2: ml protein trứng + ml NaOH 10% + giọt CuSO Quan sát màu giải thích, so sánh với ống Định tính enzyme catalase: a) Nguyên tắc: Dựa tượng phản ứng xúc tác enzyme catalase: có sủi bọt khí b) Tiến hành: - Cân 1g gan heo, sau cho vào giọt H2O2 10% - Cân g gan heo, luộc chín, để nguội, sau cho vào giọt H 2O2 10% - Quan sát giải thích tượng ống nghiệm Catalase có vai trị thể sống? IV Nội dung báo cáo/vấn đáp Giải thích thí nghiệm protein - Protein gì? Protein đại phân tử sinh học (polyme) cấu tạo axit amin (amino axit), liên kết với liên kết peptid - Có loại protein nào: có loại protein  Protein đơn giản: chứa axit amin: anbumin (máu, lòng trắng trứng, tế bào), globulin (máu – vận chuyển chất, cấu tạo kháng thể  vai trò miễn dịch), histon (nhân – cấu tạo kháng thể)  Protein phức tạp: axit amin cịn có nhóm ngoại  Ví dụ: glycoprotein (màng sinh chất) có sacarit  nhận biết tế bào quen – lạ, vi khuẩn  Ví dụ: casein có sữa  Chromoprotein: chứa kim loại sắt, Hemoglobin  Nucleoprotein: axit nucleic nhiễm sắc thể chứa: protein histon ADN  Lipoprotein: LDL: tỉ trọng thấp (Low density), HDL: tỉ trọng cao (High Density), VLDL - Protein có vai trị thể sống? + Xúc tác phản ứng + Vận tải: Hemoglobin, anbmin (thuốc, ion, hocmon, axit béo) + Chuyển động, ví dụ: actin myorin giúp co + Bảo vệ: protein cấu tạo nên kháng thể, nhận biết, interferon  chất hoạt hóa tế bào bảo vệ khỏi vi sinh vật, vi khuẩn + Truyền xung thần kinh: Rhodopsin nhận ánh sáng chuyển hình ảnh nhận thành xung thần kinh đến não, Rhodopsin = vitamin A protein + Điều hòa hoạt động thể (hocmon: protein cấu tạo nên hocmon: insullin, glucagon) + Chống đỡ học: đàn hồi nhờ có collagen, elastin + Dự trữ, ví dụ: gan dự trữ protein, glicogen + Cấu tạo màng tế bào: màng bào quan: ti thể, Lizoxom, lạp thể, lưới nội chất, golgi HÀ THỊ LIÊN Viết sơ đồ trình chuyển hóa protein hệ tiêu hóa Sản phẩm cuối trình phân giải protein tế bào chất gì? tạo acid amin vào tế bào tạo cetoacid tham gia vào chu trình krebs tạo coenzyme khử (NADH2 FADH2) chất tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử tạo ATP cung cấp cho trình sống thể - Tại không cho heo ăn nhiều protein? Việc sử dụng sai protein phần ăn không làm giảm amino acid có sẵn heo q trình phát triển trao đổi chất heo mà dẫn đến rối loạn tiêu hoá đường ruột, gia tăng vi khuẩn gây bệnh gây tổn thương biểu mơ góp phần gây nên bệnh đường ruột Giải thích thí nghiệm enzyme - Enzyme gì? + Enzyme chất xúc tác sinh học, phần lớn có chất protein có khả xúc tác đặc hiệu cho phản ứng hóa học + Chất xúc tác sinh học là: Có nguồn gốc từ sinh vật, cấu tạo từ protein Hoạt động nhiệt độ thể (người 37 độ, gà 42 độ) Không bị biến đổi sau phản ứng - - Có loại enzyme nào? + Lipase chịu trách nhiệm phân hủy chất béo thành axit béo glycerol Lipase enzyme tiêu hóa dày miệng với lượng nhỏ lượng lớn tuyến tụy + Protease gọi peptidase, enzyme phân giải protein, enzyme tiêu hóa phân hủy protein thành axit amin Ngồi ra, chúng đóng vai trị nhiều q trình thể, bao gồm phân chia tế bào, đông máu chức miễn dịch Protease enzyme tiêu hóa dày tuyến tụy, gồm dạng sau: o Pepsin: Pepsin tiết dày để phân hủy protein thành peptit, nhóm axit amin nhỏ hơn, bị phân hủy sâu ruột non o Trypsin: Trypsin hình thành enzym tuyến tụy tiết kết hợp với enzym ruột non Sau đó, trypsin kích hoạt enzym tuyến tụy bổ sung carboxypeptidase chymotrypsin, để hỗ trợ việc phá vỡ peptide HÀ THỊ LIÊN o Chymotrypsin: Enzyme chymotrypsin phá vỡ peptide thành axit amin tự để chúng hấp thụ thành ruột o Carboxypeptidase A: Carboxypeptidase tuyến tụy tiết ra, phân tách peptit thành axit amin riêng lẻ o Carboxypeptidase B: Được tuyến tụy tiết ra, phân hủy axit amin + Amylase có tuyến nước bọt tuyến tụy cần thiết cho trình tiêu hóa carbohydrate, giúp phân hủy tinh bột thành glucose + Maltase tiết ruột non có nhiệm vụ phân hủy maltose thành glucose để giải phóng lượng + Lactase loại enzyme phân hủy lactose, loại đường có sản phẩm từ sữa, thành đường đơn glucose galactose Lactase sản xuất tế bào ruột nằm đường ruột + Sucrase tiết ruột non, nơi phân hủy sucrose thành fructose glucose, loại đường đơn giản mà thể hấp thụ Sucrase tìm thấy dọc theo nhung mao ruột giúp lót ruột đưa chất dinh dưỡng vào máu Bài Khảo sát lipid I Khảo sát tính hịa tan nhũ hóa mỡ Ngun tắc: Lipid có tính chất khơng tan nước có sức căng bề mặt cao, tan dung môi hữu alcohol, acetone, benzene…Để làm giảm sức căng bề mặt lipid hỗn hợp lipid nước, dùng muối kiềm, xà phịng, mật, hỗn hợp có màu trắng đục sữa, lipid dạng hạt nhỏ li ti (hạt micelle), tượng gọi nhũ tương hóa - Lipid khơng thể thiếu bữa ăn, ngun tố C,H,O ngồi cịn có N,P,S este ancol axit béo 1g lipid=9,3g calo Triglicerit chủ yếu lớp mỡ da dự trữ sử dụng tháng Hóa chất, vật tư: - Mỡ động vật - Dung dịch xà phòng - Mật heo (hoặc vịt gà cá) pha loãng - Dung môi hữu cơ: alcohol, aceton Nội dung a) Quan sát hòa tan Cho vào ống nghiệm - ống 1: 2ml alcohol Dầu ăn nằm dưới, cồn nằm Lúc lắc thi đục để hồi tách lớp KLR < rượu HÀ THỊ LIÊN - ống 2: ml acetone (dng môi không phân cực): tan tốt, cấu trúc aceton mạch thẳng vịng, gồm hydrocabon Sau cho vào ống giọt mỡ, lắc nhẹ, quan sát hòa tan lipid loại dung môi b) Quan sát nhũ hóa Cho vào ống nghiệm: - ống 1: ml nước cất KLR > dầu  dầu trên, hạt lipid to Khơng tan lipit chất không phân cực - ống 2: ml xà phòng - ống 3: ml sodium benzoate - ống 4: ml mật pha loãng Dầu trên, hạt lipid nhỏ, nhờ muối mật giảm sức căng bề mặt Sau cho vào ống giọt mỡ, lắc đều, quan sát tượng, giải thích II Khảo sát sắc tố mật Nguyên tắc: Bilirubin biliverdin sắc tố mật, tạo màu vàng xanh mật Dưới tác dụng HNO3 đậm đặc iod, sắc tố mật bị oxy hóa tạo sản phẩm có màu đặc trưng Hóa chất - Mật pha lỗng - HNO3 đậm đặc - Dung dịch iod 0,5 % alcohol Nội dung a)Phản ứng Gmelin - Hút ml mật pha loãng cho vào ống nghiệm lớn - Đặt nghiêng ống nghiệm, lấy cẩn thận ml HNO3 cho chảy từ từ dọc theo thành ống - Quan sát thay đổi màu phần ống nghiệm Ghi nhận kết HÀ THỊ LIÊN b) Phản ứng Smith - Hút ml mật pha loãng cho vào ống nghiệm lớn - Đặt nghiêng ống nghiệm, lấy cẩn thận ml dung dịch iod cho chảy từ từ dọc theo thành ống - Quan sát thay đổi màu bề mặt dung dịch Ghi nhận kết III Nhận biết lipase Tụy quan sản sinh lipase Khi tụy bị tổn thương gây rối loạn tiêu hóa lipid Tuy nhiên nguyên nhân gây rối loạn tiêu hóa lipid thường gặp nhiều bệnh gan mật liên quan đến hoạt hóa lipase nhũ tương hóa lipid Trong lâm sàng người ta làm xét nghiệm xác định hoạt động lipase mẫu dịch ruột để chẩn đoán bệnh đường tiêu hóa 1.Nguyên tắc - Trong điều kiện tối thích (mơi trường kiềm, lipid nhũ tương hóa), lipase xúc tác thủy phân tryacyl glycerol sữa tạo glycerol acid béo Sự có mặt acid béo giải phóng làm thay đổi pH mơi trường, nhận biết nhờ thị phenolphtalein 2.Dụng cụ hóa chất - Ống nghiệm - Pipet Pasteur - Máy điều nhiệt - Sữa - Dịch chiết tụy - Dung dịch Na2CO3 1% - Phenolphtalein 1% HÀ THỊ LIÊN 3.Tiến hành - Thu dịch chiết tụy: cân g tụy heo, băm nhuyễn, cho thêm 10 ml nước cất, đem ly tâm 5000 vòng/10 phút - Cho vào ống nghiệm (do chất mẫu nên cho tăng phenolphthalein) Ống nghiệm Hoá chất (1) (2) Dung dịch sữa nhũ tương ml ml Dung dịch phenolphtalein 1% giọt giọt Dung dịch Na2CO3 1% giọt giọt Nước cất giọt Dịch tuỵ giọt Báo cáo: - Giải thích tượng, viết phương trình phản ứng - Lipid gì? Phân loại lipid  Lipid hợp chất hữu có tế bào sống (lipit este), cấu tạo từ alcol axit béo ROH + R’COOH  RCOOR’ + H2O  phân loại Lipit đơn giản: cấu tạo từ rượu axit béo, loại: + Triglycerit: glycerol axit béo (mô mỡ) + Sáp (cerid) lông cừu (chống thấm nước) cấu tạo rượu M lớn  axit béo bậc cao + steroid: rượu vòng (cholesterol) + aixt béo M lớn (vai trò cấu tạo nên hocmon) Lipit phức tạp: rượu, axit béo, nhóm ngoại + glycolipid(đường, axit béo, ancol) + glicerophospholipid: glicerol + axit béo H3PO4 (+ aminancol) VD: phospholipid màng tế bào + gliceroglycolipid: glicerol + aixt béo + sacarit (thường galactose) + sphingophospholipid: shigosin + axit béo + H3PO4 VD: Sphingomyelin cấu tạo tế bào thần kinh có bao + Sphingoglycolipid: shingosine + axit béo +sacarit (galactose) VD: cerebroside cấu tạo nên tế bào não (galactose + sphingosine + axit lignoseric) HÀ THỊ LIÊN Vai trị lipid (cấu tạo mơ mỡ, màng sinh chất, bào quan; nguồn lượng; ổn định nhiệt độ thể tạo nhiệt; bảo vệ mặt học; dự trữ lượng, nước; hấp thụ vitamin A,D,E,K) + Là thành phần cấu tạo quan trọng màng sinh học + Là nguồn nhiên liệu dự trữ quan trọng cung cấp lượng cho thể + Tạo nhiệt cho thể động vật máu nóng + Bảo vệ nội quan động vật khỏi tác dụng chấn động mạnh + Lớp mỡ da có tác dụng cách nhiệt + Bảo đảm vận chuyển, hấp thu chất hòa tan chất béo vitamin A,D,E,K + Dự trữ hạt hầu hết thực vật - Thành phần dịch mật, vai trò dịch mật - Thành phần tác dụng dịch mật muối mật (chiếm 50% thành phần) có thêm cholesterol, lecithin, bilirubin chất điện giải, cụ thể: + Cholesterol: Là nguyên liệu để sản xuất muối mật Cholesterol có đặc tính khơng tan nước nhũ hóa lecithin muối mật để ngăn cản kết tủa Lượng cholesterol có mật phụ thuộc vào lượng lipid tiêu thụ vào hàng ngày Do đó, ta ăn nhiều lipid thời gian dài dẫn tới sỏi mật + Muối mật: Là thành phần quan trọng mật có tác dụng tiêu hóa thức ăn hấp thu sản phẩm tiêu hóa lipid acid béo, cholesterol, monoglyceride lipid ruột non Muối mật đóng vai trị quan trọng cho việc hấp thu vận chuyển vitamin tan dầu A, D, E K Mỗi ngày gan tiết khoảng 0,5g muối mật Muối mật không bị thường tái hấp thu sau sử dụng 80-90% theo máu chuyển gan kích thích gan sản sinh thêm mật + Sắc tố mật: Được gan sản xuất từ protein hemoglobin trình tiêu hủy hồng cầu gan Chất Stercobilin có sắc tố mật nhuộm vàng chất, dịch chứa Điều lý giải phân bình thường có màu vàng Khi sắc tố mật bị ứ lại, không xuống ruột tắc mật, xơ gan hay bệnh lý khác khiến phân màu vàng - - - Dịch mật có vai trị hỗ trợ vào q trình tiêu hóa thể Cụ thể: + Kích thích q trình sản sinh men tiêu hóa dịch tụy dịch ruột, đồng thời hoạt hóa men + Giúp kích thích nhu động ruột từ tạo mơi trường kiềm ruột, ngăn ngừa công loại vi khuẩn lên phần ruột non Khi thực hoạt động ăn uống, dịch mật đẩy xuống tá tràng để làm nhiệm vụ tiêu hóa thức ăn Nếu khơng có dịch mật đồng nghĩa với việc chất béo khơng tiêu hóa, khiến thể khơng thể hấp thu chất béo vitamin tan dầu A, D, E K Ngoài chức hỗ trợ q trình tiêu hóa trên, dịch mật cịn hỗ trợ loại bỏ bớt sản phẩm thối hóa hồng cầu, hình thành nên màu sắc mật Tụy có vai trị động vật Viết sơ đồ trình phân giải lipid hệ tiêu hóa HÀ THỊ LIÊN ... non Sau đó, trypsin kích hoạt enzym tuyến t? ?y bổ sung carboxypeptidase chymotrypsin, để hỗ trợ việc phá vỡ peptide HÀ THỊ LIÊN o Chymotrypsin: Enzyme chymotrypsin phá vỡ peptide thành axit amin... Carboxypeptidase A: Carboxypeptidase tuyến t? ?y tiết ra, phân tách peptit thành axit amin riêng lẻ o Carboxypeptidase B: Được tuyến t? ?y tiết ra, phân h? ?y axit amin + Amylase có tuyến nước bọt tuyến... Pepsin tiết d? ?y để phân h? ?y protein thành peptit, nhóm axit amin nhỏ hơn, bị phân h? ?y sâu ruột non o Trypsin: Trypsin hình thành enzym tuyến t? ?y tiết kết hợp với enzym ruột non Sau đó, trypsin kích