Hoạt tính kháng viêm của 5 hợp chất Cassaine diterpenoids từ lá cây lim xanh Erythrophleum fordi

Trong bài viết này, 5 hợp chất tự nhiên thuộc khung cassain diterpenoid là erythrofordin A (1), erythrofordin B (2), erythrofordin C (3), pseudo-erythrosuamin (4) và erythrofordin U (5) được phân lập từ lá cây lim xanh Erythrophleum fordii Oliver thu hái ở Quảng Nam.

ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 18, NO 8, 2020 13 HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA HỢP CHẤT CASSAINE DITERPENOIDS TỪ LÁ CÂY LIM XANH ERYTHROPHLEUM FORDII ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY OF CASSAINE DITERPENOIDS ISOLATED FROM THE LEAVES OF ERYTHROPHLEUM FORDII Trần Mạnh Hùng1, Nguyễn Thị Thùy Dương2, Đoàn Minh Thu2, Lê Phước Cường3, Giang Thị Kim Liên4* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Viện Nghiên cứu Đào tạo Việt Anh - Đại học Đà Nẵng Trường Đại học Bách khoa - Đại học Đà Nẵng 4* Đại học Đà Nẵng; giangkimlien@gmail.com Tóm tắt - Trong báo này, hợp chất tự nhiên thuộc khung cassain diterpenoid erythrofordin A (1), erythrofordin B (2), erythrofordin C (3), pseudo-erythrosuamin (4) erythrofordin U (5) phân lập từ lim xanh Erythrophleum fordii Oliver thu hái Quảng Nam Cấu trúc hóa học hợp chất xác định việc kết hợp phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR, phổ khối MS so sánh với tài liệu tham khảo Các hợp chất (1-5) thử nghiệm hoạt tính kháng viêm mơ hình ức chế sản sinh NO tế bào RAW264.7 bị kích thích lipopolysaccharides LPS Erythrofordin B (2) ức chế sản sinh NO mạnh so với chất khác với giá trị IC50 12,5  1,8 μM Khi tăng nồng độ erythrofordin B (2) từ đến 50 μM, biểu protein hai enzyme iNOS COX-2 giảm dần tế bào bị kích thích LPS Kết cho thấy, erythrofordin B (2) ức chế sản sinh NO trình viêm tế bào Abstract - In this study, cassain diterpenoids as erythrofordin A (1), erythrofordin B (2), erythrofordin C (3), pseudo-erythrosuamin (4) and erythrofordin U (5) are isolated from the leaves of Erythrophleum fordii Oliver collected in Quang Nam province The chemical structures of these compounds are identified by 1H and 13 C NMR and mass spectrum MS in comparasion with reported data The anti-inflammatory activity of these compounds is evaluated against lipopolysaccharides (LPS)-induced nitric oxide production in RAW264.7 cells in vitro Among them, erythrofordin B (2) shows significant inhibitory activitiy against the LPS-induced nitric oxide production with an IC50 value of 12.5  1.8 μM Erythrofordin B suppresses both cyclooxygenase-2 and inducible nitric oxide synthase expressions in protein levels These results indicate that erythrofordin B (2) may exert anti-inflammatory activity though NO production inhibition Từ khóa - Cây Lim xanh; hoạt tính kháng viêm; Caesalpinioideae; Cassaine diterpenoid; sản sinh NO Key words - Erythrophleum fordii; inflammatory Caesalpinioideae; Cassaine diterpenoid; NO production Đặt vấn đề Cây lim xanh (Erythrophleum fordii Oliver) loài thực vật thuộc phân họ Vang (Caesalpinioideae) họ Đậu (Fabaceae, Leguminosae) [1] Đây gỗ lớn, cao 30 m, thân thẳng, vỏ màu nâu có nhiều nốt sần màu nâu nhạt Về mặt sinh thái, lim xanh mọc chậm, ưa sáng lại chịu bóng cịn nhỏ Lim xanh mọc đất sét sét pha sâu dày, khí hậu nhiệt đới mưa mùa, có khả tái sinh hạt chồi tốt Lim xanh phân bố chủ yếu Việt Nam, Đài Loan Trung Quốc Lim sử dụng làm gỗ quý, làm bóng mát, nghiên cứu khoa học, vỏ chứa nhiều chất chát dùng để nhuộm Gỗ lim bốn loại gỗ tứ thiết Việt Nam (Đinh, Lim, Sến, Táu) Gỗ lim lồi gỗ cứng, chắc, nặng, khơng bị mối mọt, có màu nâu đến nâu thẫm, có khả chịu lực tốt [1, 2] Về mặt thành phần hóa học, lim xanh nguồn thực vật chứa nhiều hợp chất diterpenoid, triterpenoid, steroid alkaloid có khung diterpenoid amide [3-6] Các diterpenoid amide vỏ nhiều dao động khoảng 0,2 1% khối lượng khô Cây lim xanh thực vật có đồng thời dược tính tốt độc hại Trong y học cổ truyền Trung Quốc, vị thuốc sử dụng cho thúc đẩy lưu thông máu Gần đây, nghiên cứu khoa học cho thấy, lim xanh chứa alkaloid dạng khung cassaine diterpenoid amide, triterpenoid, steroid với hoạt tính sinh học phong phú khả gây độc tế bào ung thư, chống oxy hóa, chống viêm, kiến tạo mạch máu [4-7] Khung hợp chất cassaine diterpenoid nhiều nghiên cứu khoa học quan tâm có nhiều tác dụng dược lý chống khối u, chống sốt rét, chống viêm, chống virus, diệt khuẩn chống trypanosomal Cassaine diterpenoid chủ đề phổ biến chủ đề nóng hợp chất tự nhiên có khả ứng dụng để hỗ trợ điều trị chữa bệnh từ nhiều năm gần Trước đây, nhóm nghiên cứu chúng tơi phân lập nhiều hợp chất có khung mono cassaine diterpenoid amide từ vỏ lim xanh thu hái Quảng Nam [7] Các chất dạng mono cassaine diterpenoid cho thấy có khả ảnh hưởng lên hình thành ống nội mơ matrigel có tác dụng ức chế mạnh hình thành cấu trúc mao mạch giống tế bào nội mô mạch rốn người (HUVECs) [7] Thêm vào đó, theo phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư dẫn đường phân lập diterpenoid-diterpenoid dimer amide erythrophlesin H erythrophlesin I [8] Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR rằng, chúng bao gồm cấu trúc dimer đối xứng qua liên kết ester hai diterpenoids cassaine Thử nghiệm chống lại sinh trưởng tế bào ung thư tiền liệt tuyến PC-3 cho thấy hợp chất erythrophlesin H có tác dụng gây độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt, hợp chất gây nên chết tế bào PC3 theo lập trình sẵn (apoptosis) [8] Tuy nhiên, việc nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học từ lim xanh cịn nhiều hạn chế Do đó, nghiên cứu khoa học này, nhóm tác giả tiến hành nghiên cứu chiết xuất thử nghiệm hoạt tính ức kháng viêm hợp chất từ lim xanh thu hái Quảng Nam activity; 14 Trần Mạnh Hùng, Nguyễn Thị Thùy Dương, Đoàn Minh Thu, Lê Phước Cường, Giang Thị Kim Liên Thực nghiệm 2.1 Nguyên liệu Lá lim xanh thu hái xã Tiên Phước, Quảng Nam vào tháng 10 năm 2017 Mẫu thực vật PGS TS Phạm Thanh Huyền, Khoa tài nguyên, Viện Dược liệu trung ương, giám định tên khoa học Mẫu tiêu (TMH30-2017) lưu trữ phịng thí nghiệm Sinh Dược học, Khoa Khoa học Y Sinh, Viện Nghiên cứu Đào tạo Việt Anh, Đại học Đà Nẵng 2.2 Hóa chất thiết bị Độ quay cực (optical rotation) đo máy JASCO DIP 370 digital polarimeter Độ hấp thụ tử ngoại (ultraviolet) đo máy Thermo spectrometer Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D- 2D-NMR đo máy Varian Unity Inova 400 MHz spectrometer với chất nội chuẩn TMS, độ dịch chuyển hóa học ghi đơn vị  ppm Khối lượng phân tử (MS) hơp chất đo máy JEOL JMS-AX 300L spectrometer Silica gel sử dụng tách chiết loại Merck cỡ hạt 63−200 μm RP-18 loại Merck cỡ 75 μm Bản mỏng TLC sử dụng công ty Merck loại số 60 F254 RP-18 F254 Máy điều chế loại sắc ký lỏng cao áp HPLC hãng Gilson Trilution System với đầu dò UV detector (UV/VIS - 156), loại cột YMC-Pack ODS-A cỡ 250 × 20 mm, μm, công ty YMC Co Ltd., (Nhật Bản) Dung môi sử dụng cho chạy cột cung cấp công ty Samchun Co Ltd., (Hàn Quốc), dung môi dùng cho HPLC mua từ công ty Burdick & Jackson (Mĩ) 2.3 Chiết xuất phân lập hợp chất Lá lim xanh thu hái phơi khơ bóng râm (5,0 kg), xay nhỏ chiết nóng hồi lưu với cồn ethanol 70% (3,0 L × lần) Dung dịch chiết sau cất loại dung mơi áp suất âm thu 280,5 g cặn chiết cồn 70% Cặn chiết hòa tan với nước 3,0 L) chiết phân đoạn với n-hexane, methylene dichloride, ethyl acetate thu cặn chiết n-hexane (26,5 g), methylene dichloride (CH2Cl2, 16,4 g), ethyl acetate (EtOAc, 107,6 g) phần nước lại Theo kết nghiên cứu điều tra hoạt tính ức chế NO mơ hình tế bào đại thực bào RAW 246.7, phân đoạn CH2Cl2 cho thấy khả ức chế sản sinh NO mạnh với IC50 112 µg/mL Do đó, phân đoạn CH2Cl2 sử dụng để nghiên cứu thành phần hóa học Tiến hành sắc ký cặn CH2Cl2 cột silica gel rửa giải với hệ dung môi n-hexane : EtOAc tuyến tính 50:1 → 1:1 (v:v) thu 32 phân đoạn (C-1 → C-32) dựa theo phân tích kết mẫu TLC Phân đoạn C-8 (0.65 g) chạy sắc ký qua cột silica gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (20:1, 10:1 v:v) thu hợp chất số (1) (12,5 mg) (2) (10,3 mg) Phân đoạn C-15 (0,47 g) chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải n-hexane:EtOAc (10:1 → 8:1, v/v) thu hợp chất số (3) (15,6 mg) Tiến hành sắc ký cặn phân đoạn C-20 (1,6 g) cột silica gel rửa giải với hệ dung mơi n-hexane : acetone tuyến tính (30:1 → 1:1, v:v), sau sử dụng hệ dung mơi n-hexane:acetone (20:1 → 10:1, v:v) thu 12 phân đoạn nhỏ (C-21-1 → C20-12) dựa theo phân tích kết mẫu TLC Phân đoạn C-21-3 tiếp tục sắc ký qua cột silica gel với hệ dung môi n-hexane : acetone (10:1, v:v) thu hợp chất số (4) (46 mg) Từ phân đoạn C-21-6 sau lắng đọng hệ dung môi n-hexane : acetone (10:1) thu hợp chất số (5) (10,2 mg) Chất số (1) (Erythrofordin A): Chất bột vơ định hình màu trắng; [α]24D +30º (c 0,25, MeOH); mp 138–139oC; FAB-MS m/z 395,2 [M+H]+ H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 5,75 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-15), 3,98 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-7), 3,78 (3H, s, H-21), 3,50 (1H, dd, J = 11,5, 4,2 Hz, H-3), 2,80 (1H, m, H-14), 2,40 (1H, s, H-5), 2,65 (1H, m, H-12a), 2,30 (1H, m, H-2a), 2,15 (1H, m, H-12b), 2,07 (1H, m, H-10), 2,30 (1H, m, H-11a), 1,95 (1H, m, H-6), 1,92 (1H, m, H-2b), 1,80 (1H, m, H-11b), 1,65 (1H, m, H-1a), 1,86 (1 H, m, H-8), 1,60 (1H, m, H-9), 1,52 (1 H, m, H-2b), 1,46 (1H, m, H-1b), 1,30 (3H, s, H-19), 1,15 (3H, d, J = 8,0 Hz, H-17), 0,72 (3H, s, H-20) 13 C-NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 208,5 (C-6), 174,3 (C-18), 170,4 (C-16), 163,0 (C-13), 112,7 (C-15), 78,5 (C-3), 75,1 (C-7), 64,0 (C-5), 50,7 (C-21), 51,5 (C-8), 48,2 (C-4), 45,6 (C-9), 45,3 (C-10), 40,0 (C-14), 37,1 (C-1), 24,0 (C-11), 25,6 (C-2), 25,3 (C-19), 20,1 (C-12), 14,0 (C-20), 14,8 (C-17) Chất số (2) (Erythrofordin B): Chất bột vơ định hình màu trắng; [α]24D +40º (c 0,2, MeOH); EI-MS m/z 437,2 [M+H]+ H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 5,80 (1H, s, H-15), 3,95 (1H, d, J = 9,4 Hz, H-7), 3,70 (3H, s, H-21), 3,55 (1H, dd, J = 11,0, 4,2 Hz, H-3), 2,75 (1H, m, H-14), 2,63 (1H, s, H-5), 2,40 (1H, td, J = 13,0, 3,6 Hz, H-12a), 2,20 (1H, m, H-2b), 2,16 (1H, m, H-12b), 1,90 (3H, s, H-23), 1,94 (1H, m, H-11), 1,82 (1H, m, H-1b), 1,70 (1H, m, H-8), 1,78 (1H, m, H-11), 1,68 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, dd, J = 13,2, 3,0 Hz, H-2a), 1,27 (1H, m, H-1a), 1,30 (3H, s, H-19), 1,10 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-17), 0,86 (3 H, s, H-20) 13 C-NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 210,6 (C-6), 177,5 (C-22), 175,8 (C-18), 171,2 (C-16), 164,3 (C-13), 115,9 (C-15), 78,4 (C-3), 77,2 (C-7), 65,3 (C-5), 51,9 (C-21), 51,3 (C-8), 47,6 (C-9), 46,6 (C-4), 43,4 (C-10), 37,8 (C-1), 32,9 (C-12), 32,4 (C-14), 28,1 (C-11), 28,0 (C-2), 26,2 (C-19), 22,5 (C-23), 14,9 (C-20), 13,3 (C-17) Chất số (3) (Erythrofordin C): Chất bột vô định hình màu trắng; [α]24D +150,2 (c 0,15, MeOH); EI-MS m/z 395,2 [M + H]+ H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 5,75 (1H, brs, H-15), 4,52 (1H, dd, J = 12,0, 1,2 Hz, H-6), 3,75 (3H, s, H-21), 3,50 (1H, dd, J = 12,2, 4,0 Hz, H-3), 2,87 (1 H, s, m, H-14), 2,47 (1 H, d, J = 14,3 Hz, H-8), 2,45 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-12a), 2,10 (1H, m, H-2b), 2,05 (1 H, m, H-12b), 1,90 (1 H, m, H-1a), 1,92 (2H, m, H-2a, H-11b), 1,70 (1H, m, H-11a), 1,68 (1H, dd, J = 12,0, 3,5 Hz, H-9), 1,58 (3H, s, H-18), 1,42 (1H, d, J = 12,5 Hz, H-5), 1,30 (1H, m, H-1b), 1,05 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-17), 0,95 (3H, s, H-20) 13 C-NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 210,5 (C-7), 178,5 (C-18), 175,7 (C-16), 150,5 (C-13), 122,8 (C-15), 79,0 (C-3), 76,3 (C-6), 59,5 (C-5), 52,0 (C-8), 50,8 (C-4), 50,9 (C-21), 47,0 (C-9), 41,5 (C-14), 37,6 (C-1), 37,7 (C-10), 28,0 (C-11), 28,5 (C-2), 26,8 (C-19), 25,0 (C-12), 14,3 (C-17), 14,5 (C-20) ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 18, NO 8, 2020 Chất số (4) (Pseudo-erythrosuamin): Dạng bột vơ định hình màu vàng nhạt; [α]24D -30,5 (c 0,20, MeOH); ESI-MS m/z: 431,2, [M+Na]+ H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 5,76 (1H, brs, H-15), 4,52 (1H, dd, J = 12,0, 1,2 Hz, H-6), 3,70 (3H, s, H-21), 3,60 (3H, s, H-22), 3,75 (1H, m, H-12a), 3,25 (1H, dd, J = 12,2, 4,0 Hz, H-3), 2,95 (1H, s, m, H-14), 2,80 (1H, m, H-8), 2,15 (1H, m, H-2a), 2,10 (1H, m, H-11a), 2,05 (1 H, m, H-12b), 1,95 (1H, m, H-1a), 1,78 (1H, m, H-2b), 1,30 (1H, m, H-11b), 1,70 (1H, dd, J = 12,0, 3,5 Hz, H-9), 1,65 (3H, s, H-19), 1,40 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-5), 1,30 (1H, m, H-1b), 1,15 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-17), 0,90 (3H, s, H-20) 13 C-NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 210,8 (C-7), 177,5 (C-19), 170,2 (C-16), 165,5 (C-13), 115,0 (C-15), 79,0 (C-3), 76,8 (C-6), 59,0 (C-5), 52,1 (C-8), 50,2 (C-4), 51,0 (C-21), 47,3 (C-9), 41,2 (C-14), 37,8 (C-1), 37,8 (C-10), 28,5 (C-11), 28,6 (C-2), 177,8 (C-19), 24,0 (C-12), 15,0 (C-17), 14,2 (C-20) Chất số (5) (Erythrofordin U): Dạng dầu không màu [α]24D +20,5 (c 0.15, CHCl3) H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1,70 (1H, m, H-1a), 1,08 (1H, m, H-1b), 1,65 (1H, m, H-2a), 1,42 (1H, m, H-2b), 2,80 (1H, m, H-3a), 1,20 (1H, m, H-3b), 1,40 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-5), 4,60 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-6), 2,62 (1H, m, H-8), 1,80 (1H, m, H-9), 2,30 (1H, m, H-11a), 2,12 (1H, m, H-11b), 5,50 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12), 2,70 (1H, m, H-14), 3,05 (1H, d, J = 15,0 Hz, H-15a), 3,15 (1H, d, J = 15,0 Hz, H-15b), 0,90 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-17), 1,45 (3H, s, H-19), 0,95 (3H, s, H-20), 3,65 (3H, s, H-21), 3,75 (3H, s, H-22) 13 C-NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 38,5 (C-1), 20,5 (C-2), 40,5 (C-3), 45,0 (C-4), 59,0 (C-5), 78,2 (C-6), 210,5 (C-7), 48,5 (C-8), 45,0 (C-9), 35,0 (C-10), 25,2 (C-11), 125,0 (C-12), 135,8 (C-13), 32,0 (C-14), 41,6 (C-15), 175,6 (C-16), 14,5 (C-17), 30,0 (C-18), 178,6 (C-18), 14,0 (C-20), 52,5 (C-21), 52,8 (C-22) 2.4 Thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng viêm Sự xác định nồng độ NO dựa chuyển đổi nitrat thành nitrite enzym nitrate reductase Phản ứng thực đo chất màu nitrite, sản phẩm phản ứng Griess Phản ứng Griess dựa phản ứng diazot hóa NO2tạo tác nhân nitrat hóa phản ứng với axit sulfanilic để tạo ion diazonium Sau đó, ion kết hợp với ethylenediamine N-(1-naphthyl) để tạo dẫn xuất azo nhiễm sắc thể hấp thụ ánh sáng bước sóng khoảng 540 - 570 nm Dòng tế bào kháng viêm macrophage RAW264.7 (ATCC, Rockville, MD, Mỹ) nuôi đĩa petri môi trường nuôi cấy Dulbecco’s Modified Eagle Medium – DMEM (Sigma, St Louis, MO, Mỹ) với 10% FBS (fetal bovine serum, Sigma, Mỹ), 100 đơn vị/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin tủ ấm (5% CO2) nhiệt độ 37oC Tế bào tách khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy tiến hành ly tâm với tốc độ 1000 vịng phút Loại bỏ mơi trường giữ lại phần cắn có chứa tế bào, thêm vào 10 mL mơi trường DMEM-FBS 10% sau tiến hành đếm số lượng tế bào pha loãng tế bào mơi trường ni cấy đến mật độ thích hợp Nồng độ NO môi trường nuôi cấy đánh giá dựa phản ứng NO 15 với thuốc thử Griess 100 µL dịch mơi trường ni cấy pha trộn với 100 µL hỗn hợp đồng thể tích thuốc thử Griess (1% sulfanilamide pha 5% axit phosphoric 0,1% naphthylethylenediamin dihydrochlorid pha nước) Hỗn hợp sau pha trộn ủ 10 phút nhiệt độ phòng điều kiện tránh ánh sáng Tiến hành đo bước sóng hấp thu 540 nm máy đọc 96 giếng xác định phần trăm nồng độ ức chế nồng độ ức chế IC50 theo công thức bên Natri nitrit sử dụng để xây dựng đường chuẩn NO dựa nhiều nồng độ khác (0; 12,5; 25,0; 50,0; 100,0) tiến hành đo độ hấp thu quang bước sóng 540 nm Nồng độ ức chế (%) = [1 − (B − C)/(A – C)] × 100 Trong đó, A: LPS (+), mẫu thử (); B: LPS (+), mẫu thử (+); C: LPS (), mẫu thử () - Đánh giá nồng độ protein iNOS COX-2 phương pháp Western blot: Tế bào RAW264.7 rửa với PBS, ủ ly giải với dung dịch đệm [10% glycerol, 1% Triton X-100, mM Na3PO4, mM EGTA, 10 mM NaF, mM Na4P2O7, 20 mM đệm Tris (pH 7,9), 100 mM β-glycerophosphat, 137 mM NaCl, mM EDTA] đá khoảng Sau ly tâm với tốc độ 12000 vòng 30 phút oC rửa protein nhiều lần với PBS Sau hịa tan protein PBS lạnh chuẩn bị cho điện di gel Tiến hành nạp 20 - 30 µg protein, phân tách protein phương pháp điện di gel với 10% SDS-PAGE Kết thúc trình điện di, chuyển protein tách gel sang màng polyvinyliden difluorid Sau chuyển từ gel sang màng, protein màng bất hoạt với 5% skim milk nhiệt độ phòng dung dịch Tris-buffer salin−Tween (TBST; 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 7,5, 0,1% Tween 20) Màng sau ủ với kháng thể đơn dịng (monoclonal antibody) anti-iNOS anti-COX2 (tỷ lệ pha loãng 1:1000) 5% sữa bột không béo/TBST nhiệt độ phòng Màng sau ủ với kháng thể rửa lần với TBST nhiệt độ phòng ủ tiếp với kháng thể thứ cấp IgG (antimouse IgG secondary antibody, Sigma, St Louis, MO, Mỹ) với tỷ lệ pha lỗng 1:2000 2,5% sữa bột khơng béo/TBST nhiệt độ phòng Màng chứa protein tiếp tục rửa lần với TBST phản ứng protein miễn dịch phát phản ứng quang hóa (chemiluminescence–ECL, Amersham International PLC, Buckinghamshire, Anh) sử dụng hyperfilm thuốc thử quang hóa Kết Western blot định lượng cách đo tương quan mật độ quang so với mẫu đối chứng phần mềm Fujifilm Image Reader Las-4000 (FujiFilm Corp., Tokyo, Nhật Bản) Kết quả thảo luận 3.1 Cấu trúc hợp chất hóa học phân lập Hợp chất số (1) thu dạng bột màu trắng, có độ nóng chảy 139-140oC Phổ khối FAB-MS (1) thể đỉnh ion giả phân tử m/z 395,2, đỉnh phù hợp với công thức phân tử C21H30O7 Phổ 1H NMR 13C NMR cho thấy hợp chất có đặc trưng dạng diterpenoid khung cassaine với nhóm β-carbomethoxy C-4 [3, 6] Các tín hiệu phổ trùng khớp với hợp chất có khung cassain diterpenoid lim xanh có tên 16 Trần Mạnh Hùng, Nguyễn Thị Thùy Dương, Đoàn Minh Thu, Lê Phước Cường, Giang Thị Kim Liên erythrophordin A dựa theo so sánh với thông tin từ công bố khoa học trước [3] Do đó, cấu trúc (1) xác định erythrofordin A δ 78,2 (C-6) exocyclic carbon metylen δ 41,6 (C-15) Cấu trúc so sánh với tài liệu khoa học cơng bố từ trước có tên erythrofordin U [10] Cấu trúc hợp chất trình bày Hình 3.2 Hoạt tính kháng viêm hợp chất hóa học Bảng Kết ức chế khả sản sinh NO từ tế bào RAW264.7 Hình Cấu trúc hóa học hợp chất (1-5) Hợp chất số (2) phân lập dạng bột vơ định hình màu trắng, có độ truyền quang +40º (c 0,2, MeOH) Công thức phân tử xác định C23H32O8 theo tính tốn từ mũi ion phân tử proton hóa m/z 437,2 [M+H]+ phổ khối FAB-MS So sánh phổ H 13C NMR (2) với phổ hợp chất erythrofordin A (1) cho thấy hai hợp chất có cấu trúc tương tự với Tuy nhiên hai hợp chất có khác biệt, xuất thêm nhóm acetoxy δ 1,90 (3H, s, H-23) δC177,5 (C-22), 22,5 (C-23) cấu trúc hợp chất (2) Từ liệu phổ với so sánh liệu phổ từ công bố khoa học trước, cấu trúc (2) xác định erythrofordin B (2), hợp chất chiết từ lim xanh thu hái Trung Quốc [3] Hợp chất số (3) thu dạng bột vơ định hình khơng màu có cơng thức phân tử C21H30O7 dựa theo phổ khối FAB-MS Các tín hiệu phổ cho thấy, giống chất (1) (2), hợp chất (3) diterpenoid có khung cassaine với nhóm β-carbomethoxy vị trí C-4 [3, 6] So với chất số (1) (2), tín hiệu proton H-5 hợp chất số (3) dịch chuyển lên δ 1,42 (1H, d, J = 12,5 Hz) ghép với proton δ 4,52 (1H, dd, J = 12,0, 1,2 Hz, H-6) Do đó, nhóm hydroxyl định C-6 nhóm carbonyl dịch chuyển sang vị trí C-7, vị trí cịn gọi 6α-hydroxy-7-keto Đồng thời, so sánh với công bố khoa học trước đây, cấu trúc xác định erythrofordin C [3] Hợp chất thu dạng bột vơ định hình màu vàng nhạt Dữ liệu phổ ESI-MS cho thấy có đỉnh ion giả phân tử m/z 431,2 [M+Na]+ xác định công thức phân tử C22H32O7 Tương tự 1, hợp chất cho thấy tín hiệu carbon proton đặc trưng cho nhóm -carbomethoxy C-4 Hơn nữa, chứng phổ 1H 13C cho thấy có nhóm 6α-hydroxy-7-keto giống cấu trúc Do đó, cấu trúc pseudoerythrosuamin [9] Hợp chất số thu dạng dầu không màu Phổ EI-MS có mơt đỉnh ion phân tử xuất m/z 392,2 [M] + gợi ý cho công thức phân tử C22H32O6 Phổ H 13C NMR cho thấy có ba tín hiệu carbonyl δ 210,5 (C-7), 178,6 (C-18) 175,6 (C-16), cặp cacbon olefinic δ 125,0 (C-12), 135,8 (C-13), oxymethine Phân đoạn/Hợp chất Giá trị ức chế 50% IC50 value (M)a) n-hexaneb) > 300 µg/mL CH2Cl2 112,6  15,7 µg/mL EtOAc 248,5  14,2 µg/mL 23,5  1,6 12,5  1,8 46,5  3,7 45,0  2,8 > 100 1,0 ± 0,1 Celastrolc) Giá trị nồng độ ức chế 50% (IC50 M) so sánh với lô đối chứng b) Giá trị ức chế dịch chiết đo nồng độ µg/mL c) Chất đối chứng dương S.D n = a) Để kiểm tra tác dụng gây độc tế bào hợp chất (1-5) lên tế bào RAW 264.7, đánh giá cách sử dụng phương pháp MTT (3- (4,5-dimethylthiazol2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide ) nhóm tế bào có mặt LPS khơng có LPS Kết cho thấy, hợp chất (1-5) khơng có ảnh hưởng đến khả sống tế bào nhóm tế bào nồng độ cao 100 μM sau 24 ủ Để kiểm tra hoạt động ức chế sản sinh NO, tế bào RAW 264.7 xử lý hợp chất phân lập với dải nồng độ 0-100 μM mức độ sản sinh NO sau bị gây viêm LPS xác định nồng độ nitrite có chất bề mặt thu nuôi cấy tế bào Theo kết Bảng 1, chất số (5) cho thấy có tác dụng yếu ức chế sản xuất NO với giá trị lớn 100 μM Chất xem khơng có tác dụng Trong đó, hợp chất (3) (4) ức chế sản sinh NO với giá trị IC50 tương ứng 46,5  3,7, 45,0  2,8 μM Hợp chất (1) có giá trị IC50 23,5  1,6 μM, nhiên, hợp chất (2) có giá trị ức chế mạnh so với chất khác với giá trị IC50 12,5  1,8 μM Trong thí nghiệm này, celastrol, chất chuyển hóa thứ cấp tự nhiên sử dụng làm đối chứng dương, chất ức chế sản phẩm NO LPS gây với giá trị IC50 1,0 μM Hợp chất (2) cho thấy, có tác dụng ức chế mạnh việc sản sinh NO LPS tạo tế bào RAW 264.7 bị gây viêm Do đó, chúng tơi lựa chọn chất (2) để thử nghiệm kiểm sốt tác dụng ức chế lên enzyme cảm ứng nitric oxide synthase (iNOS) cyclooxygenase2 (COX-2) iNOS ba enzyme tạo oxit nitric (NO) từ axit amin L-arginine NO có nguồn gốc từ iNOS đóng vai trò quan trọng nhiều biểu sinh lý bệnh điều hòa huyết áp, gây viêm, nhiễm trùng, gây bệnh ác tính iNOS nghiên cứu điểm đánh dấu mục tiêu trị liệu bênh trên, đặc biệt viêm Trong đó, COX-2 enzyme chịu trách nhiệm sản xuất chất trung gian gây viêm prostaglandins ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 18, NO 8, 2020 (PG) chất chuyển hóa chúng PGE2, PGF2α PGD2 Nồng độ protein hai enzyme iNOS COX-2 không phát tế bào RAW 264.7 khơng kích thích với LPS Tuy nhiên, tế bào bị kích thích viêm LPS, cytokine điều chỉnh tăng rõ rệt mức độ protein (Hình 2) Đáng ý, tăng nồng độ hợp chất số (2) từ đến 50 μM, nồng độ protein hai enzyme iNOS COX-2 bị giảm dần tế bào bị kích thích LPS Điều cho thấy, hợp chất số (2) có tác dụng ức chế biểu enzyme gây viêm theo nồng độ Để kiểm chứng, thời gian ủ, biểu protein alpha-tubulin không thay đổi Hình Sự ức chế biểu protein iNOS LPS tế bào RAW264.7 erythrofordin B (2) Các tế bào RAW264.7 xử lý trước 30 phút với erythrofordin B (2) (0-50 μM) sau kích thích LPS (1 μg/mL) 24 Các protein định vị kháng thể định đặc hiệu Mức độ biểu α-tubulin sử dụng làm kiểm chứng Các biểu iNOS COX-2 xác định phân tích immunoblot phát protein điện di gel SDS-PAGE Kết luận Từ phân đoạn methylene dichloride chiết xuất từ lim xanh E fordii Oliver thu hái Quảng Nam, hợp chất thuộc khung cassain diterpenoid erythrofordin A (1), erythrofordin B (2), erythrofordin C (3), pseudoerythrosuamin (4) erythrofordin U (5) phân lập, hợp chất cơng bố có rễ lim xanh Trung Quốc Kết thử nghiệm hoạt tính kháng viêm mơ hình ức chế sản sinh NO tế bào RAW264.7 bị kích thích LPS cho thấy, erythrofordin B (2) ức chế NO mạnh với giá trị IC50 17 12,5  1,8 μM Khi tăng nồng độ hợp erythrofordin B (2) từ đến 50 μM, biểu protein hai enzyme iNOS COX-2 giảm dần tế bào bị kích thích LPS Kết cho thấy, hợp chất erythrofordin B (2) ức chế sản sinh NO trình viêm tế bào Lời cám ơn: Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (Nafosted) đề tài mã số 104.01-2017.57 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Tất Lợi, Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học, 2005 [2] Qu J, Hu YC, Yu SS, Chen XG, Li Y “New cassaine diterpenoid amides with cytotoxic activities from the bark of Erythrophleum fordii”, Planta Medica, 2006, 72(5), pp 442-449 [3] Tsao CC, Shen YC, Su CR, Li CY, Liou MJ, Dung NX, Wu TS “New diterpenoids and the bioactivity of Erythrophleum fordii”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 16(22), pp 9867-9870 [4] Du D, Qu J, Wang JM, Yu SS, Chen XG, Xu S, Ma SG, Li Y, Ding GZ, Fang L “Cytotoxic cassaine diterpenoid-diterpenoid amide dimers and diterpenoid amides from the leaves of Erythrophleum fordii”, Phytochemistry, 2010, 71(14-15), pp 1749-1755 [5] Du D, Fang L, Qu J, Yu S, Ma S, Lv H, Liu J, Liu Y, Wang J, Wang X “Oleanane-type triterpene saponins and cassaine-type diterpenoids from Erythrophleum fordii”, Planta Medica 2011, 77(14), pp 1631-1638 [6] Li L, Chen L, Li Y, Sun S, Ma S, Li Y, Qu J “Cassane and norcassane diterpenoids from the roots of Erythrophleum fordii” Phytochemistry 2020, 174, pp 112343 [7] Hung TM, Cuong TD, Kim JA, Tae N, Lee JH, Min BS “Cassaine diterpene alkaloids from Erythrophleum fordii and their antiangiogenic effect”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2014, 24(1), pp 168-172 [8] Hung TM, Cuong TD, Kim JA, Lee JH, Woo MH, Min BS “In vitro apoptotic effect of cassaine-type diterpene amides from Erythrophleum fordii on PC-3 prostate cancer cells”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2014, 24(21), pp 4989-4994 [9] Huang X, Chen Z, Zhou S, Huang P, Zhuo Z, Zeng S, Wang L, Wang Y, Xu C, Tian H “Cassaine diterpenoids from the seeds of Erythrophleum fordii and their cytotoxic activities”, Fitoterapia 2018, 127, pp 245-251 [10] Ha MT, Tran MH, Phuong TT, Kim JA, Woo MH, Choi JS, Lee S, Lee JH, Lee HK, Min BS “Cytotoxic and apoptosis-inducing activities against human lung cancer cell lines of cassaine diterpenoids from the bark of Erythrophleum fordii”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2017, 27(13), pp 2946-2952 (BBT nhận bài: 29/4/2020, hoàn tất thủ tục phản biện: 25/8/2020) ... erythrofordin U [10] Cấu trúc hợp chất trình bày Hình 3.2 Hoạt tính kháng viêm hợp chất hóa học Bảng Kết ức chế khả sản sinh NO từ tế bào RAW264.7 Hình Cấu trúc hóa học hợp chất (1 -5) Hợp chất. .. (C-1), 20 ,5 (C-2), 40 ,5 (C-3), 45, 0 (C-4), 59 ,0 (C -5) , 78,2 (C-6), 210 ,5 (C-7), 48 ,5 (C-8), 45, 0 (C-9), 35, 0 (C-10), 25, 2 (C-11), 1 25, 0 (C-12), 1 35, 8 (C-13), 32,0 (C-14), 41,6 (C- 15) , 1 75, 6 (C-16),... (C-18), 1 75, 7 (C-16), 150 ,5 (C-13), 122,8 (C- 15) , 79,0 (C-3), 76,3 (C-6), 59 ,5 (C -5) , 52 ,0 (C-8), 50 ,8 (C-4), 50 ,9 (C-21), 47,0 (C-9), 41 ,5 (C-14), 37,6 (C-1), 37,7 (C-10), 28,0 (C-11), 28 ,5 (C-2),