TCNCYH 38 (5) - 2005
CHIẾT XUẤT, XÁC ĐỊNHHÀMLƯỢNG POLYPHENOL VÀ
ĐÁNH GIÁTÁCDỤNGCHỐNGOXYHOÁCỦA
CÁC MẪUBỘTCHIẾTLÁDÂU
Phạm Thiện Ngọc, Lê Ngọc Liễn
Bộ môn Hoá sinh - Trường Đại học Y Hà Nội
.
t
l
Đã có một số nghiên cứu trên thế giới đánhgiá về tácdụng quý có thể áp dụng trong sinh y học củalá
dâu. Cây dâu được trồng phổ biến ở nước ta để lấy lá nuôi tằm, nhưng chưa có nghiên cứu khoa học nào
về chiếtxuất,xácđịnhlượng polyphenol, tácdụngchốngoxyhoácủalá dâu. Mục tiêu: (1) Chiết xuất và
xác địnhhàmlượng polyphenol lá dâu. (2) Đánhgiá khả năng chố
ng oxyhoácủacácmẫubộtchiếtlá
dâu. Đối tượng và phương pháp: Dùng 5 loại dung môi methanol 100%, methanol 75%, n - hexan
100%, ethylacetat 100% để chiết xuất tạo bộtlá dâu. Hàmlượngpolyphenol trong cácmẫubộtchiết được
xác định bằng phương pháp đo quang đơn giản dùng ferrous sulphate. Sử dụng acid linoleic đánhgiá khả
năng chốngoxyhoá in vitro củacácmẫuchiết xuất. Kết quả: (1) Methanol 75% cho hiệu xuất chiết xuất
bột ládâu cao nhất (3,9%), trong đó lượngpolyphenol chiếm 2,62%. Xácđịnhhàm l
ượng polyphenol
trong mẫuchiết xuất bằng phương pháp Ferrous sulphat cho kết quả chính xác hơn phương pháp dùng
thuốc thử folin (2) Ở ngày thứ 7 và 12, acid linoleic với sự có mặt củacácmẫubộtchiếtládâu chỉ bị
peroxy hoá từ 15% tới 42,2%, trong khi ở mẫu đối chứng bị peroxy hoálà 100%. Kết luận: (1) Ládâu có
chứa polyphenolvà Ferrous sulpha là phương pháp đơn giản, tin cậy để xác địnhhàmlượng polyphenol
trong mẫuchiết xuất. (2) Bộtchiếtládâu từ 5 loại dung môi trên
đều có khả năng chốngoxyhoávà tốt
nhất làbộtchiết bằng methanol 75%.
Từ khoá: Lá dâu, polyphenol, acid linoleic, peroxy hoá.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây dâu được trồng khá phổ biến ở nước ta để
lấy lá nuôi tằm, lấy tơ dệt vải. Ládâuvàcác bộ
phận khác của cây dâu còn được dùng để chữa
một số bệnh, làm mỹ phẩm bảo vệ và làm đẹp da
[5,6]. Trái dâu ngâm rượu làm thức uống khai vị
kích thích ăn ngon. Ládâulà loại thảo dược dễ
tìm, giá thành rẻ, không độc, rất phù hợp với đời
sống kinh tế và nhu cầu chữa bệ
nh của người dân
nước ta [1].
Gần đây các công trình nghiên cứu của một số
tác giả Nhật Bản, Trung Quốc cũng chứng minh lá
dâu có nhiều tácdụng quí có thể áp dụng trong
sinh y học như: làm hạ Glucose máu, chốngoxy
hóa [3], hạn chế rối loạn lipid máu [2]. Hiện nay ở
nước ta chưa có nghiên cứu nào về lá dâu, chúng
tôi tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu:
1. Chiết xuất và xác địnhhàmlượng
polypheno từ ládâu sử dụng một số dung
môi khác nhau.
2. Đánhgiá khả năng chốngoxyhoácủa
các mẫu dịch chiếtlá dâu.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng
1.1. Chất liệu
Nguyên liệu nghiên cứu làládâu (Morus alba
L. thuộc họ Moraceae) được thu hái vào cuối
tháng 11 năm 2004 tại xã Tam Giang, huyện Yên
Phong, tỉnh Bắc Ninh.
1.2. Hóa chất
- Ethylgallate, ferrous sulfate, postasium
sodium tartrate tetratrydrat, phosphate buffer
sodium, acid linoleic, polyphenol chè xanh, folin
ciocalteau phenol.
- n - hexan, aceton, ethylacetat, methanol,
ethanol.
- Acid linoleic (Nhật bản).
- Sunphenon 100S của công ty Taiyokagaku
(Nhật Bản) chứa 68,5% polyphenol
- Acid galic.
1
TCNCYH 38 (5) - 2005
i
ị
l ị
1.3. Trang th ết bị
- Bộ cất quay chân không của hãng Buchi
(Thụy Sĩ).
- Quang kế photometer 4010 (Đức)
- Quang phổ kế Optizen 2120 UV (Hàn Quốc)
2. Phương pháp nghiên cứu.
2.1. Chiết xuất tạo d ch chiết cô đặc
Lá dâu sau khi thu hái được xử lý sơ bộ và
được chiết xuất các thành phần có hoạt tính bằng
5 loại dung môi.
Mẫu 1: 50g bộtládâu + 200ml n - Hexan 100%.
Mẫu 2: 50g bộtládâu + 200ml Ethyl axetat 100%.
Mẫu 3: 50g bộtládâu + 200ml Aceton 100%.
Mẫu 4: 50g bộtládâu + 200ml Methanol 100%.
Mẫu 5: 50g bộtládâu + 200ml Methanol 75%.
Chiết xuất 2 lần và dịch chiếtcủacácmẫu
được cô đặc ở áp suất và nhiệt độ thấp.
2.2. Địnhlượng polypheno d ch chiết
Polyphenol dịch chiếtládâu được xácđịnh
bằng 2 phương pháp Ferrous sulphate và phương
pháp dùng thuốc thử Follin. Biểu đồ chuẩn được
xây dựng bằng acid galic [5]. Nồng độ polyphenol
trong cácmẫuchiết xuất được tính toán theo nồng
độ polyphenol chuẩn có trong sản phẩm
sunphenon 100S.
2.3. Đánhgiá khả năng chốngoxyhóa
của cácmẫuchiếtlá dâu
Khả năng chốngoxyhoácủacácmẫuchiếtlá
dâu được xácđịnh qua việc bảo vệ acid linoleic
khỏi bị tác động oxyhoá [4] qua thực nghiệm sau.
- Tạo các nhóm hỗn hợp ủ:
quá trình peroxy
hóa acid linoleic được thực hiện trong 7 ống
nghiệm (kể cả ống chứng). Mỗi ống chứa 0,8 ml
acid linoleic 2,5% ; 1,6 ml đệm phosphat pH 7,0 ;
0,8 ml nước cất và 1,8 ml mỗi mẫu dịch chiết
0,001% (ống chứng được thay bằng 1,8 ml
ethanol 96
o
. Các ống nghiệm được nút kín, tránh
ánh sáng, ở 40
0
C.
- Thực hiện phản ứng xácđịnh mức độ peroxy
hoá củacácmẫu ở các thời điểm:
Trước khi tạo
hỗn hợp phản ứng, ngày thứ 7, ngày thứ 12 sau
khi tạo hỗn hợp phản ứng. Mức độ peroxy hoá
acid linoleic được xácđịnh bằng phản ứng màu với
hỗn hợp sau: dịch các ống nghiệm ở trên (0,05ml),
Ethanol 75
0
(4,85ml), NH
4
SCN 30% (0,05ml), FeCl
2
0,02M/HCl 3,5% (0,05ml). Lắc đều, đúng 3 phút
sau đo mật độ quang học cácmẫu thí nghiệm so
với ống trắng (Ethanol 75
0
) ở bước sóng 500nm.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Kết quả chiết xuất tạo dịch chiết cô đặc
Từ 50g ládâu khô chiết xuất bằng 5 loại dung môi khác nhau, kết quả như sau:
Chiết bằng n - Hexan 100% Lượngbột thu được: 0,09g
Chiết bằng Ethylacetate 100% 1,56g
Chiết bằng Aceton 100% 0,72g
Chiết bằng Methanol 100% 1,75g
Chiết bằng Methanol 75% 1,94g
Như vậy lượngbộtchiết thô thu được khi chiết bằng Methanol 75% là lớn nhất.
2. Hàmlượngpolyphenol trong ládâu
Qua mẫupolyphenol chuẩn, chúng tôi thấy phương pháp xácđịnhhàm lượ
ng polyphenol trong dịch
chiết bằng thuốc thử ferrous sulphate có độ xác thực cao hơn hẳn phương pháp folin ( kết quả địnhlượng
bằng phương pháp folin không trình bày ở đây). Vì vậy kết quả về hàmlượngpolyphenol ở cácmẫu dịch
chiết ở bảng 1 là dựa theo phương pháp ferrous sulphate.
2
TCNCYH 38 (5) - 2005
Bảng 1. Hàmlượngpolyphenol ở cácmẫuchiết cô đặc thu được sau chiết xuất
Lượng polyphenol
Mẫu chiết xuất
Hàm lượng (mg) Tỷ lệ % trong bộtchiết
Mẫu 1 0,04 0,04%
Mẫu 2 5,30 0,34%
Mẫu 3 3,17 0,44%
Mẫu 4 17,50 1,01%
Mẫu 5 50,83 2,62%
Nhận xét: Trong 50g bộtládâu khô lượngpolyphenolchiết xuất được bằng dung môi methanol 75%
(mẫu 5) là cao nhất vàchiết xuất bằng n - hexan là thấp nhất (mẫu 1)
.
3. Đánhgiá hoạt tính chốngoxyhóacủacácmẫuchiếtládâu bằng cách sử dụng acid linoleic
Hoạt tính chốngoxyhoácủa 5 loại bộtchiếtládâu dựa theo ống chứng có so sánh với mẫu chè xanh
có cùng hàmlượngpolyphenol được trình bày ở bảng 2 và minh hoạ ở biểu đồ 1.
Bảng 2. MĐQH và mức độ peroxy hoá acid linoleic (POL)
của cácmẫu thí nghiệm ở các thời gian
Thời điểm
Trước khi ủ Ngày 7 sau ủ Ngày 12 sau ủ
Polyphenol
(0,01%)
MĐQH POL(%) ) MĐQH POL(% MĐQH POL(%)
Mẫu 1 0,020 1,57 0,148 11,60 0,376 29,47
Mẫu 2 0,023 1,80 0,216 16,93 0,536 42,01
Mẫu 3 0,031 2,43 0,174 13,64 0,420 32,92
Mẫu 4 0,025 1,96 0,146 11,44 0,232 18,18
Mẫu 5 0,018 1,41 0,179 14,03 0,191 14,97
Chè xanh 0,027 2,12 0,194 15,20 0,207 16,22
Chứng 0,018 1,41 1,271 99,61 1,276 100,00
Nhận xét:
Tất cả cácmẫubộtchiếtládâu có tácdụng hạn chế quá trình peroxy hóa lipid in vitro và
tác dụng mạnh nhất là ở mẫubộtládâu 5 tương đương với mãu chè xanh. Chúng tôi coi toàn bộ lượng
acid linoleic có trong ống nghiệm ở thời điểm 12 ngày sau ủ đã bị oxyhoá hết và có MĐQH là 1,276.
Biểu đồ 1. Mức độ peroxy hoá acid linoleic củacácmẫu thí nghiệm
với sự có mặt củacác loại bộtchiếtládâu
3
TCNCYH 38 (5) - 2005
IV. BÀN LUẬN
1. Kết quả xác địnhhàmlượng
polyphenol
Hàm lượngpolyphenol trong cácmẫuchiết
xuất được xácđịnh bằng phương pháp Ferrous
sulphate chính xác hơn dùng thuốc thử Follin. Cả 2
phương pháp đều dùng acid gallic là chất chuẩn để
dựng biểu đồ chuẩn.
Kết quả địnhlượngpolyphenol bằng phương
pháp Ferrous sulphate trên cơ sở phản ứng màu
của polyphenol với ion Fe
2+
. Mặc dù phương pháp
này có thể có sai số thừa vì các monophenol (nếu
có) trong mẫuchiết xuất có thể phản ứng với ion
Fe
2+
và làm tăng MĐQH, ảnh hưởng đến kết quả
định lượng. Tuy nhiên đây là phương pháp đơn
giản cũng cho phép xácđịnh sơ bộ hàmlượng
polyphenol trong dịch chiết trên cơ sở mẫu chuẩn,
cho kết quả phân tích khá chính xác. Theo tàiliệu
tham khảo mà chúng tôi có, trong ládâu hầu như
không chứa monophenol [1][4].
Do vậy lượngpolyphenolđịnhlượng được
trong dịch chiết bằng phương pháp sử dụng thuốc
thử Ferrous sulphate có độ xác thực cao h
ơn, kết
quả địnhlượng được như sau: Hàmlượng
polyphenol dịch chiếtládâu (từ 50g bộtládâu
khô) cao nhất ở mẫuchiết bằng Methanol 75%
(50,8mg), tiếp đến làmẫuchiết bằng Methanol
100% (17,5mg), sau đó làmẫuchiết bằng
Ethylacetate 100% (5,36mg), mẫuchiết bằng
Aceton 100% (3,17mg) và thấp nhất làmẫuchiết
bằng n - Hexan 100% (0,04mg).
Sự khác nhau về lượng dịch chiết thô thu được
cũng như hàmlượngpolyphenol dịch chiết ở
đây
phụ thuộc hoàn toàn vào dung môi dùng để chiết
xuất. Vì cácmẫuchiết xuất trên cùng một lượng
50g bộtládâu khô (lá dâu cùng loại), qui trình và
điều kiện chiết xuất giống nhau. Tỷ lệ polyphenol
trong dịch chiết ở cácmẫuđánhgiá chất lượng
dịch chiết thu được ở mỗi mẫuchiết bằng các
dung môi khác nhau. Tỷ lệ này cao nhất ở mẫu
chiết bằng Methanol 75% (2,62%), tiếp theo là
mẫu chiết b
ằng Methanol 100% (1,01%), sau đó
là mẫuchiết bằng Aceton 100% (0,44%), mẫu
chiết bằng Ethylacetate 100% (0,34%), thấp nhất
ở mẫuchiết bằng n - Hexan 100% (0,04%).
2. Đánhgiá hoạt tính chốngoxyhóacủa
các mẫuchiết bằng cách sử dụng acid
linoleic
Trong thí nghiệm này chung tôi đánhgiátác
dụng chốngoxyhoácủacácpolyphenol trong các
mẫu chiết (ở nồng độ 0,01%) thông qua lượng acid
linoleic bị peroxy hoá (POL) theo thời gian ủ ở 40
0
C.
Lượng acid linoleic bị peroxy hóa ở thời điểm 7
ngày sau ủ nhỏ hơn lượng acid linoleic bị peroxy
hóa ở thời điểm 12 ngày sau ủ. Mức độ chênh lệch
này ở các thí nghiệm là khác nhau: Mẫu chứng
(100% - 100%), Mẫubộtládâu 1 (11,6% -
29,6%), Mẫubộtládâu 2 (17% - 42%), Mẫubột
lá dâu 3 (13,7% - 33%), Mẫubộtládâu 4 (11,5%
- 18,3%), Mẫubộtládâu 5 (14,1% - 15%), Mẫu
chè xanh (15,3% - 16,3%).
Kết quả thực nghiệm cho thấy ở các nhóm thí
nghiệm ủ với polyphenol thì lượng acid linoleic bị
peroxy hóa giảm so với nhóm chứng. Lượng acid
linoleic bị peroxy hóa tỷ lệ nghịch với tácdụng
chống oxyhóacủacác polyphenol. Polyphenolcác
mẫu chiết đều có tácdụng hạn chế quá trình
peroxy hóa acid linoleic nhưng ở mức độ khác
nhau:
- Ngày 7 sau ủ:
PolyphenolMẫu 4 có tácdụng
chống peroxy hóa tốt nhất, sau đó làpolyphenol
Mẫu 3, tiếp theo làpolyphenolMẫu 5, polyphenol
Mẫu 1, polyphenolMẫu chè xanh và thấp nhất là
polyphenol Mẫu 2.
- Ngày 12 sau ủ:
PolyphenolMẫu 5 có tácdụng
chống oxyhóa tốt nhất, sau đó làpolyphenolMẫu
chè xanh, tiếp theo làpolyphenolMẫu 4,
polyphenol Mẫu 1, polyphenolMẫu 3 và thấp nhất
polyphenol Mẫu 3.
Sự khác nhau về hoạt tính chốngoxyhóacủa
các polyphenol ở cácmẫuchiết có thể do thành
phần vàlượng polyphenol. Hay nói cách khác,
dùng cácdung môi chiết xuất khác nhau có thể
thu được cácpolyphenol có phẩm chất khác nhau.
Ta thấy polyphenolMẫu 1 (chiết bằng Methanol
75%) có khả năng chống peroxy hóa tốt vàtác
dụng này được kéo dài theo thời gian .
V. KẾT LUẬN
1. Ládâuchiết bằng dung môi methanol 75%
thu được lượngbột lớn nhất (3,9%); trong đó hàm
lượng polyphenol cũng nhiều nhất (2,62%).
4
TCNCYH 38 (5) - 2005
2. Cácmẫuchiết xuất ládâu đều có khả năng
chống oxy hóa, mẫuchiết bằng methanol 75% có
khả năng chốngoxyhóa cao nhất, tiếp đến làmẫu
chiết bằng methanol 100%, mẫuchiết bằng dung
môi n - hexan 100%, mẫuchiết bằng dung môi
aceton 100% và thấp nhất làmẫuchiết bằng dung
môi ethylacetate 100%.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đỗ Tất Lợi (2001), Cây thuốc và vị thuốc
Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật , tr
252 - 253, 498 - 499, 721 - 723, 734 - 735, 820 -
821.
2. Alan R.L. (1994), "Cholesterol and
triglyceride", Free Radical, Biology of Medicin.
3. Gow - Chin Yen, She - Ching - Wu and
Pin - Der Duh, Extraction and identification of
antioxidant components from the leaves of
mulberry (Morus alba L.), J. Agre Food Chen:
1996, 44, 1687 - 1690.
4. Husain S.R, Cillard J, cillard P. (1987),
"Hydroxyl radical scavenging activity of
flavonoids", Phytochemistry, (26), pp. 2489 - 2491.
5. Kayo Dol, Takashi Kojima, and Yasuo
Fujimoto (2000), Mulberry leaf extract inhibits
the oxidative modification of rabbit and human low
density lipoprotein, Biol, Pharm, Bull 23 (9), 106 -
1071.
6. Vijavan K, Srivastava PP, Awasthi AK.
Analysis of phylogenetic relationship among five
mulberry (Morus) species using molecular markers.
Genome 2004; 47: 439 - 48.
Summary
EXTRACTION, DETERMINATION OF POLYPHENOL CONCENTRATION AND
ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF MULBERRY LEAF EXTRACT POWDERS
It has been being some studyes on biomedical effects of mulberry leaves in the world. Mulberry trees
are widly cultivated in VietNam to take leaves for fed of silkworm. However, it has not been a study on
extraction, determination and antioxidation of mulberry leaves in VietNam. Objectives: extraction and
determination of polyphenol from mulberry leaves. Evaluation of antioxidant capacities of mulberry leaf
extract powders. Methods: Mulberry leaf extract powder were extracted from mulberry leaves by five
solvens: methanol 100%, methanol 75%, n - hexan 100%, ethylacetat 100%. Polyphenol concentration of
the extracts are determined by ferrous sulphate and follin reagent assay. Antioxidant capacities of the
powders are based on peroxidation of linoleic acid at 40oC. Results: Among five solvens, the extract by
methanol 75% from 50g dryed leaves is best. The powder is 1,94g with 2,62% of polyphenol. Polyphenol
concentraion of the extract powders are determined by two methods: ferrous sulphate and follin reagent.
The result with ferrous sulphate method is more accurate than follin reagent method. The mulberry leave
extract powders inhibited linoleic acid peroxidation at the 7
th
and 12
th
of reaction (only 15,5 % to 42,2%
linoleic acid peroxidated) in comparison with control (100% linoleic acid peroxidated). Conclusions:
Polyphenol from mulberry leaves was extracted by some solvens. Among them extraction of polyphenol by
methanol 75% is best. Polyphenol concentration of extract powders can be dedermined by ferrous sulphat.
The extract powders from mulberry leaves exhibited antioxidant capacities in vitro. The extract powder by
methanol 75% showed highest antioxidant capacitiy.
Keywords: mulberry leaf, polyphenol, linoleic acid peroxidation.
5
. nào
về chiết xuất, xác định lượng polyphenol, tác dụng chống oxy hoá của lá dâu. Mục tiêu: (1) Chiết xuất và
xác định hàm lượng polyphenol lá dâu. (2) Đánh giá. 2005
CHIẾT XUẤT, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL VÀ
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA
CÁC MẪU BỘT CHIẾT LÁ DÂU
Phạm Thiện Ngọc, Lê Ngọc Liễn
Bộ môn Hoá