Phân tích đa dạng di truyền dựa trên gene ORF5 của virus gây bệnh heo tai xanh (PRRS virus) tại một số tỉnh ở Việt Nam

Bài viết Phân tích đa dạng di truyền dựa trên gene ORF5 của virus gây bệnh heo tai xanh (PRRS virus) tại một số tỉnh ở Việt Nam nghiên cứu về sự biến đổi của virus PRRS giúp có thêm cơ sở khoa học trong đánh giá hiệu quả vaccine phòng chống bệnh PRRS trên đàn heo tại Việt Nam.

HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 333-339 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN DỰA TRÊN GENE ORF5 CỦA VIRUS GÂY BỆNH HEO TAI XANH (PRRS VIRUS) TẠI MỘT SỐ TỈNH Ở VIỆT NAM Nguyễn Ngọc Hải1,2*, Trần Hoàng Anh Thư2, Nguyễn Trung Quân2, Nguyễn Thị Phương Bình2 Lê Thị Thu Hà3 Tóm tắt Nghiên cứu biến đổi virus PRRS giúp có thêm sở khoa học đánh giá hiệu vaccine phòng chống bệnh PRRS đàn heo Việt Nam Mười sáu mẫu thu thập từ thực địa năm 2021, số tỉnh Việt Nam (Đồng Nai, Đắk Nơng, Hải Phịng, Lai Châu, Vĩnh Phúc), kĩ thuật RT-PCR xác định dương tính với virus PRRS Gene ORF5, có chiều dài 764 bp, thu nhận từ 16 mẫu giải trình tự so sánh với trình tự tương ứng chủng virus PRRS tham khảo ngân hàng gene Kết phân tích di truyền 16 chủng virus PRRS thực địa năm 2021 ghi nhận đa dạng di truyền chủng PRRSV thực địa, với 11 chủng thực địa thuộc dòng PRRSV Trung Quốc độc lực cao (HP), có độ tương đồng nucleotide từ 91,0% - 100%; chủng thực địa thuộc dòng PRRSV Bắc Mỹ cổ điển (C-PRRSV), có chủng NADC30-like Mặt khác, chủng virus PRRS thực địa năm 2021 nghiên cứu có khác biệt lớn di truyền so với chủng vaccine PRRS, mức độ tương đồng di truyền gene ORF5 thấp, thay đổi mức 83,9 - 84,4% với chủng vaccine Bắc Mỹ cổ điển, 83,4 - 84,2% với chủng vaccine độc lực cao Trung Quốc, 58,8 - 59,8% với chủng vaccine PRRSV châu Âu Từ khóa: Chủng PRRSV thực địa vaccine, ORF5, phân tích di truyền GENETIC ANALYSIS OF ORF5 GENE OF PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS IN SOME PROVINCES IN VIET NAM Abstract Research on genetic changes of PRRS virus helps to have more scientific basis in assessing effective prevention of PRRS in pigs in Vietnam with vaccination Sixteen samples collected from the field in 2021, in some provinces in Vietnam (Dongnai, Daknong, Haiphong, Laichau, and Vinhphuc), using RT-PCR technique were confirmed positive for PRRS virus ORF5 gene, 764 nucleotide length, was obtained from 16 samples and compared with corresponding sequences of PRRS virus strains referenced on gene banks The results of genetic analysis of the gene sequences of 16 field PRRSV strains in 2021 recorded the genetic diversity of the strains, with 11 strains belonging to the highly pathogenic Chinese PRRSV (HP) group, with similarity of nucleotides from 91.0% 100%; field strains belong to the classic North American PRRSV (C-PRRSV) group, in which strains belong to NADC-like subgroup Moreover, the 2021 field PRRS virus strains in this study are quite different genetically compared to the PRRS vaccine strains, the genetic similarity level of ORF5 is quite low, ranging from 83.9 to 84.4% with classic North American vaccine strain, form 83.4 to 84.2% with highly pathogenic Chinese vaccine strain, and from 58.8 to 59.8% with European PRRSV vaccine strain Keywords: Field and vaccine PRRSV strain, ORF5, phylogenetic GIỚI THIỆU Bệnh heo tai xanh hay gọi hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp bệnh truyền nhiễm cấp tính heo xuất lần Việt Nam vào năm 1997 gây Bộ môn Bệnh truyền nhiễm - Thú y Cộng đồng, Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại Học Nơng Lâm TP HCM; Phịng Xét nghiệm - Chẩn đốn thú y Hàn Việt, Khoa Chăn ni Thú y, Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM; Công ty TNHH MSD Animal Health Việt Nam; * Tác giả liên hệ: Nguyễn Ngọc Hải; Email: nguyenngochai@hcmuaf.edu.vn; ĐT: 0908840765 333 HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 333-339 nhiều thiệt hại cho người chăn nuôi Bệnh virus PRRS thuộc loài Nidovirales, họ Arteriviridae, giống Arterivirus, có cấu trúc vỏ bọc dạng chuỗi đơn RNA Kích thước gene virus PRRS khoảng 15,4 kb với 10 khung đọc mở (ORFs) nằm xung quanh vùng khơng dịch mã 5’ 3’, có cấu trúc đuôi poly (A) đầu 3’ (Goua Z H cs., 2019) Dựa theo khác biệt địa lý biến thể di truyền, virus PRRS chia làm PRRSV-type (kiểu gene châu Âu - EU) and PRRSV-type (kiểu gene Bắc Mỹ - NA) (Kuhn cs, 2015) Ngoài ra, dựa theo đặc điểm gen khả gây bệnh, PRRSVtype (kiểu gene Bắc Mỹ) (NA-PRRSV) chia thành phân nhóm chính: PRRSV Bắc Mỹ cổ điển (C-PRRSV), phân nhóm PRRS độc lực cao (HP-PRRSV) phân nhóm PRRSV giống NADC30 (NL-PRRSV) Cho đến nay, ba phân nhóm NA-PRRSV lưu hành Trung Quốc (Li Y cs., 2017) ORF5 mã hóa cho protein cấu trúc GP5 (khoảng 26 kDa) thành phần cấu thành protein vỏ (envelope glycoprotein) cần thiết cho lắp ráp virus PRRS, thường sử dụng phân tích đa dạng di truyền tiến hóa virus PRRS Mặc dù hầu hết trại heo kiểm soát hiệu bệnh PRRS qua việc tiêm phòng vaccine thương mại, bệnh PRRS xảy số trại liên quan đến xuất biến chủng virus PRRS (Han G cs., 2019) Nghiên cứu phân tích di truyền biến đổi virus PRRS thực địa, dựa gene ORF5, thu từ số trại số tỉnh Việt Nam năm 2021, tiêm vaccine PRRS có biểu lâm sàng liên quan đến PRRS, giúp xác định đa dạng di truyền góp phần làm rõ nguyên nhân bệnh PRRS xảy trại VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Xác định mẫu dương tính với virus PRRS kĩ thuật RT-PCR Tổng cộng 16 mẫu heo nghi ngờ lâm sàng bệnh PRRS (mô hạch, thận, lách huyết thanh) thu thập trại heo 334 từ tỉnh Đồng Nai, Đắk Nơng, Hải Phịng, Vĩnh Phúc, Lai Châu Sau đó, mẫu đồng với tỷ lệ g mẫu mL nước cất, hỗn hợp sau ly tâm 4000 vòng 10 phút, thu dịch để ly trích ARN virus ARN virus PRRS thu nhận kit ly trích GeneJET Viral DNA/ RNA Purification Kit (Thermo, Mỹ), sau đó, cDNA virus tổng hợp phản ứng phiên mã ngược thông qua RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo, Mỹ) Kĩ thuật RT- PCR thực theo quy trình Phịng xét nghiệm chẩn đoán thú y Hàn Việt, với cặp primer nhân đoạn gene mục tiêu ORF6 có kích thước 508 bp, để phát diện virus PRRS mẫu thực địa Sản phẩm sau điện di gel agarose 1,5% quan sát đèn UV Thu nhận gene ORF5 Mẫu ARN sau xác nhận dương tính với PRRSV thơng qua phản ứng RT-PCR tiếp tục sử dụng để thu nhận đoạn gene ORF5 virus PRRS kích thước 764 bp, theo quy trình Phịng xét nghiệm chẩn đoán thú y Hàn Việt Kết phản ứng RT-PCR điện di gel agarose 1,5% quan sát đèn UV Giải trình tự phân tích di truyền Sản phẩm PCR sau xác nhận có chứa đoạn gene ORF5 gửi giải trình tự hai chiều với cặp mồi đặc hiệu dùng phản ứng phát gene ORF5 Công ty Nam Khoa Biotek Kết xử lý lắp ráp phần mềm Sequencher 5.4.6 Trình tự nucleotide aminoacid mẫu phân tích so sánh với trình tự tham khảo cơng bố ngân hàng gene phần mềm Bioedit 7.2.6 Tiến hành xây dựng di truyền dựa gene ORF5 16 chủng thực địa với 43 chủng tham khảo ngân hàng gene (Bảng 1) phần mềm MEGA 7.0.26, theo phương pháp Neighbor Joining với số bootstrap 1000 lần lặp lại (Tamura cs., 2013) HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 333-339 Bảng Danh sách chủng PRRSV tham khảo dùng phân tích di truyền STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 Tên chủng JX143 JXA1 07BJ HUB2 10-10FUJ-5 10-10GX-1 JL-04/12 YN07-2012 HENAU-QBS-1 HeNlh1-17 SCwhn14XC-2 SCdz15 07QN BD.R1 DN1 HUA/HP1963 D51/DN10/VN_2014 JXA1-P170 HeNzm1-16 NADC30 FJ1402 JL580 CHsx1401 HeNxx2-16 HeNhb1-17 HeNlh2-17 HNjz15 PRRSV29 VR-2332 PRRSV2000000676 PL97-1/LP1 K15-3-N11_GS ML3 Lelystad EuroPRRS JXA1‐R JXA1 P80 JXA1-P120 Ingelvac MLV BSL-PS 100 Porcilis Amervac Prime Pac Năm phân lập 2006 2006 2007 2007 2010 2010 2012 2012 2013 2017 2014 2015 2007 2010 2010 2011 2014 2009 2016 2008 2014 2013 2014 2016 2017 2017 2015 2000 2003 2008 2004 2015 2007 1991 2004 - Nơi phân lập China China China China China China China China China China China China QuangNam/Vietnam BinhDuong/Vietnam DongNai/Vietnam Vietnam Vietnam China China USA China China China China China China China USA USA USA Korea Korea Taiwan Netherlands USA Vaccine/China Vaccine/China Vaccine/China Vaccine/USA Vaccine/Singapore Vaccine/Netherlands Vaccine/Spain Vaccine/MSD 335 Mã truy cập ngân hàng gen EU708726 EF112445 FJ393459 EF112446 JQ663550 JQ663558 JX177644 KJ854752 KF416323 MG847424 KT030990 KY620014 FJ394029 JQ860381 JQ860375 KF699844 KR261802 JQ804986 MF474323 JN654459 KX169191 KR706343 KP861625 MG847414 MG847422 MG847425 KT945017 AF176451 AY150564 EU759827 AY612613 KU666170 EU273673 M96262.2 AY366525 FJ548855 FJ548853 KC422727 AF066183.4 GU187014 KJ127878 GU067771 DQ779791 Kiểu gene HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV NL-PRRSV NL-PRRSV NL-PRRSV NL-PRRSV NL-PRRSV NL-PRRSV NL-PRRSV NL-PRRSV C-PRRSV C-PRRSV C-PRRSV C-PRRSV C-PRRSV C-PRRSV EU-PRRSV EU-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV C-PRRSV C-PRRSV EU-PRRSV EU-PRRSV C-PRRSV HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 333-339 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong nghiên cứu này, 16 mẫu bệnh phẩm (hạch, lách, thận huyết thanh) heo bệnh thu thập từ tỉnh Đồng Nai, Đắk Nông, Lai Châu, Vĩnh Phúc cho kết dương tính với virus PRRS Sản phẩm RT- Hình Kết điện di RT-PCR phát virus PRRS (508 bp) (L): Thang DNA 100 bp; (1): DakNong1; (2): DakNong2; (3): DakNong3; (4): DakNong4 PCR sau điện di gel agarose 1,5% cho thấy diện đoạn ADN có kích thước 508 bp (Hình 1) Sau đó, đoạn gene ORF5 có kích thước 764 bp, từ mẫu ARN dương tính với virus PRRS, nhân kỹ thuật RT-PCR (Hình 2) Hình Kết điện di RT-PCR đoạn gene ORF5 (764 bp) (L): Thang DNA 100 bp; (1): DakNong1; (2): DakNong2; (3): DakNong3; (4): DakNong4 Trong 16 chủng virus PRRS nghiên lực cao (HP-PRRSV) Theo nghiên cứu cứu sau giải trình tự có 11 chủng thuộc Nguyen cs (2013), chủng virus PRRS phân nhóm PRRS độc lực cao (HP-PRRSV), thu nhận từ tỉnh Việt Nam gồm Hậu chủng lại thuộc phân nhóm PRRS Bắc Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, Bình Dương, Mỹ cổ điển (C-PRRSV) (Bảng 2) Nghiên Đồng Nai, thành phố Hồ Chí Minh Điện cứu Feng cs (2007) ghi nhận chủng Biên cho kết tương tự Các nghiên virus PRRS phân lập tỉnh Quảng Nam có cứu dựa vào biến đổi di truyền đối kiểu gene thuộc phân nhóm chủng PRRS độc với gene ORF5 virus PRRS Bảng Kiểu gene chủng PRRSV thực địa phân tích di truyền STT 10 11 Tên chủng 1/2848 2/2848 3/2848 4/2848 U4 73/2816 74/2816 75/2816 76/2816 1402/2934 DakNong1 Năm phân lập 2021 2021 2021 2021 2021 2021 2021 2021 2021 2021 2021 336 Nơi phân lập Đồng Nai Đồng Nai Đồng Nai Đồng Nai Lai Châu Hải Phòng Hải Phòng Hải Phịng Hải Phịng Đăk Nơng Đăk Nơng Kiểu gene C-PRRSV C-PRRSV C-PRRSV C-PRRSV C-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 333-339 12 13 14 15 16 DakNong2 DakNong3 DakNong4 DakNong5 U1 Đăk Nông Đăk Nông Đăk Nông Đăk Nông 2021 2021 2021 2021 2021 Dựa vào di truyền (Hình 3) cho thấy 16 chủng PRRSV thực địa nghiên cứu thuộc genotype 2, phân chia thành nhóm Nhóm gồm chủng PRRS thu nhận Đồng Nai (1/2848, 2/2848, 3/2848, 4/2848) chủng thu nhận Lai Châu, có tỷ lệ tương đồng nucleotide với cao, từ 99,3 - 100,0%, thuộc dòng US-PRRSV, chủng 1/2848, 2/2848, 3/2848, 4/2848 tách riêng thành nhóm phụ, gần với chủng NADC30 - like (NL-PRRSV) với tỷ lệ tương đồng nucleotide với chủng tham khảo NADC30 từ 83,5 86,2% Bốn chủng thực địa NADC30-like nghiên cứu có tỷ lệ tương đồng nucleotide với chủng vaccine dòng Bắc Mỹ cổ điển từ 83,9 - 84,4%, bao gồm chủng vaccine tham khảo PrimePac, Ingelvac MLV BSL-PS 100; tương đồng nucleotide với dòng vaccine độc lực cao Trung Quốc từ 83,4 - 84,2% với dòng vaccine PRRSV châu Âu mức từ 58,8 - 59,8% Theo nghiên cứu năm 2019 Wei cs, phân tích phát sinh lồi dựa gene ORF5, đàn heo nuôi Trung quốc xuất chủng PRRSV thuộc dòng linaege 1, đại diện NADC30, gây tỷ lệ mắc bệnh, tử vong cao heo nái heo Chủng thực địa U4 thu nhận Lai Châu, Việt Nam thuộc dịng PRRSV Bắc Mỹ cổ điển (C-PRRSV) có tỷ lệ tương đồng nucleotide với chủng thực địa 1/2848, 2/2848, 3/2848, 4/2848 nhóm từ 83,5 - 83,9%, với chủng tham khảo nhóm PRRSV Bắc Mỹ cổ điển (C-PRRSV) từ 84,5 - 92,3% Tỷ lệ tương đồng nucleotide chủng U4 với chủng vaccine PRRS Bắc Mỹ cổ điển tham khảo gồm PrimePac, Ingelvac MLV BSL-PS 100 cao nhiều so với chủng PRRSV thực địa thuộc nhóm NADC-like, dao động từ 91,3 - 92,5% so với Vĩnh Phúc HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV HP-PRRSV 83,9 - 84,4% So với chủng vaccine Trung Quốc độc lực cao tương đồng trình tự nucleotide chủng U4 93,6% với chủng vaccine JXA1-R 93,3% với chủng vaccine JXA1 P80, JXA1 P120 Nhóm gồm chủng Đắk Nơng (Daknong1, Daknong2, Daknong3, Daknong4, Daknong5 1402/2934), chủng thu nhận Hải Phòng (75/2816, 76/2816, 77/2816, 78/2816) chủng thu nhận Vĩnh Phúc (U1), thuộc dịng HP-PRRSV Tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide 11 chủng thực địa với từ 96,3 100,0% So với chủng vaccine chủng Trung Quốc độc lực cao tham khảo, độ tương đồng nucleotide ORF5 11 chủng PRRSV thực địa mức 97,8 - 98,6% chủng vaccine JXA1-R, 97,3 - 99,3% chủng vaccine JXA1 P80 97,3 - 99,6% chủng vaccine JXA1 P120 Trong đó, tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide 11 chủng thực địa với chủng PRRSV vaccine tham khảo dòng châu Âu từ 61,3 - 62,1%; so với chủng vaccine tham khảo dòng Bắc Mỹ cổ điển từ 87,8 - 90,3% KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Qua phân tích di truyền, xây dựng sinh dòng dựa nucleotide gene ORF5 16 chủng PRRSV thu nhận nghiên cứu cho thấy PRRSV Việt Nam có đa dạng di truyền rõ, với nhóm PRRSV, nhóm PRRSV độc lực cao (HP-PRRSV) nhóm PRRSV Bắc Mỹ cổ điển (C-PRRSV) Đặc biệt xuất biến chủng PRRSV thuộc lineage 1, nhóm NADClike gây bệnh PRRS nghiêm trọng so với chủng C-PRRSV Ngoài ra, chủng PRRSV nhóm HP-PRRSV tách thành phân nhóm riêng: chủng PRRSV thu nhận Đắk Nông chủng PRRSV thu nhận Hải Phịng 337 HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 333-339 Các chủng PRRSV thực địa năm 2021, dựa gene ORF5, có khác biệt di truyền lớn với chủng virus PRRS vaccine thương mại Sự đa dạng di truyền liên quan đến hiệu tiêm phòng vaccine PRRS đàn heo Việt Nam, sở lựa chọn sử dụng loại vaccine phù hơp để tiêm phòng bệnh PRRS, hạn chế cao rủi ro thiệt hại cho người chăn ni Tuy nhiên, cần có thêm nghiên cứu chuyên sâu để theo dõi biến đổi virus PRRS phù hợp vaccine PRRSV Việt Nam Hình Cây di truyền dựa trình tự nucleotide gen ORF5 chủng virus PRRS Cây di truyền xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining phần mềm MEGA 6.06 Các số nhánh đại diện cho phần trăm giá trị bootstrap với 338 1000 lần lặp lại (Giá trị < 70 khơng trình bày).l Các chủng virus PRRS khảo sát; Các chủng virus PRRS vaccine HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 333-339 TÀI LIỆU THAM KHẢO Wei C H., Ailing Dai, Jialin Fan, Yan Li, Anni Chen, Xia Zhou, Manlin Luo, XiaoyanYang and Jiankui Liu (2019) Efficacy of Type PRRSV vaccine against challenge with the Chinese lineage (NADC30-like) PRRSVs in pigs Scientific Reports 9:10781 J H Kuhn, M Lauck, A.L Bailey, A.M Shchetinin, T.V Vishnevskaya, Y Bao, et al (2016) Reorganization and expansion of the nidoviral family Arteriviridae Arch Virol., 161: 755-768 Nguyen Thi Dieu Thuy, Nguyen Thi Thu, Nguyen Giang Son, Le Thi Thu Ha, Vo Khanh Hung, Nguyen Thao Nguyen and Do Vo Anh Khoa (2013) Genetic analysis of ORF5 porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolated in Vietnam Microbiol Immunol 57: 518-526 Li Y., Guobiao J, Xiaodong Xu, Juan Wang, Yingying Li , Feifei Tan and Xiangdong Li (2017) Development and Application of an RT-PCR to Differentiate the Prevalent NA-PRRSV Strains in China The Open Virology Journal 11.(Suppl-1, M4): 66-72 Feng Y., Tiezhu Zhao, Tung Nguyen, Ken Inui, Ying Ma, Thi Hoa Nguyen, Van Cam Nguyen, Di Liu, Quang Anh Bui, Long Thanh To, Chuanbin Wang, Kegong Tian, and George F Gao (2008) Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Variants, Vietnam and China, 2007 Emerging Infectious Diseases 14(11): 1774-1776 Guoa Z., Xin-xin Chena, Xiang Lid, Songlin Qiaoa, Ruiguang Denga, Gaiping Zhang, et al (2019) Prevalence and genetic characteristics of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in central China during 2016-2017: NADC30- like PRRSVs are predominant Microbial Pathogenesis Han G., HuilingXu, KexiongWang and Fang He, 2019.  Emergence of Two different recombinant PRRSV strains with low neutralizing antibody susceptibility in China. Scientific Reports. 9: 2490 339 ... cứu phân tích di truyền biến đổi virus PRRS thực địa, dựa gene ORF5, thu từ số trại số tỉnh Việt Nam năm 2021, tiêm vaccine PRRS có biểu lâm sàng liên quan đến PRRS, giúp xác định đa dạng di truyền. .. nghiên virus PRRS phân lập tỉnh Quảng Nam có cứu dựa vào biến đổi di truyền đối kiểu gene thuộc phân nhóm chủng PRRS độc với gene ORF5 virus PRRS Bảng Kiểu gene chủng PRRSV thực địa phân tích di truyền. .. địa năm 2021, dựa gene ORF5, có khác biệt di truyền lớn với chủng virus PRRS vaccine thương mại Sự đa dạng di truyền liên quan đến hiệu tiêm phịng vaccine PRRS đàn heo Việt Nam, sở lựa chọn sử