Sự đồng nhiễm và tương quan giữa các kỹ thuật xét nghiệm PCV2 ở ca bệnh hô hấp phức hợp và còi cọc sau cai sữa

Bài viết Sự đồng nhiễm và tương quan giữa các kỹ thuật xét nghiệm PCV2 ở ca bệnh hô hấp phức hợp và còi cọc sau cai sữa được nghiên cứu nhằm khảo sát tỷ lệ đồng nhiễm các mầm bệnh liên quan PCV2 và đánh giá sự tương quan giữa các kỹ thuật xét nghiệm trên các ca bệnh khảo sát. Mẫu mô và máu từ heo có dấu hiệu lâm sàng được thu thập từ 90 trang trại khác nhau ở nhiều tỉnh thành.

HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 327-332 SỰ ĐỒNG NHIỄM VÀ TƯƠNG QUAN GIỮA CÁC KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PCV2 Ở CA BỆNH HƠ HẤP PHỨC HỢP VÀ CỊI CỌC SAU CAI SỮA Đỗ Tiến Duy1*, Ngô Thị Ngọc Trâm1, Nguyễn Thế Hiển1, Trần Hồng Vũ2 Nguyễn Tất Tồn1 Tóm tắt Mục tiêu nghiên cứu nhằm khảo sát tỷ lệ đồng nhiễm mầm bệnh liên quan PCV2 đánh giá tương quan kỹ thuật xét nghiệm ca bệnh khảo sát Mẫu mô máu từ heo có dấu hiệu lâm sàng thu thập từ 90 trang trại khác nhiều tỉnh thành Phương pháp PCR/RT-PCR thực để xác định mầm bệnh trường hợp Từ kết đó, tiếp tục khảo sát tương qua xét nghiệm thông qua phương pháp mổ khám, HE, IHC ELISA Kết sàng lọc cho thấy nhiễm ghép mầm bệnh có tỷ lệ cao chủ yếu đồng nhiễm PCV2 PRRSV, đồng nhiễm mầm bệnh (6,3 - 23,8%) theo trại (4,1 - 16,3%) theo ca bệnh Sự khác biệt tỷ lệ phát PCV2 kỹ thuật xét nghiệm lâm sàng, bệnh tích, PCR, qPCR, ELISA IHC có ý nghĩa PCV2 thường nhiễm ghép với mầm bệnh PRRSV, MH, HP CSFV Sự kết hợp dấu hiệu lâm sàng, bệnh tích đặc trưng với kỹ thuật xét nghiệm PCR có giá trị chắn để khẳng định ca bệnh PCV2 Từ khóa: Đồng nhiễm, heo, PCV2 CO-INFECTION AND CORRELATION BETWEEN PCV2 TEST TECHQUINES IN PORCINE RESPIRATORY DISEASE COMPLEX (PRDC) AND POST-WEANING MULTISYSTEMIC WASTING SYNDROME (PMWS) Abstract The aim of this study was to investigate the prevalence of the PCV2-related pathogens and to evaluate the correlation between the diagnostic assays in the surveyed cases Tissue and blood samples from clinical pigs were collected from 90 different farms in several provinces PCR/RT-PCR method was performed to identify the pathogen in each case From that result, continue to investigate the correlation between tests through surgery, HE, IHC and ELISA methods Screening results showed that double co-infection has the highest rate which is mainly co-infection between PCV2 and PRRSV, followed by co-infection with pathogens (6.3 - 23.8%) by farm and (4.1 - 16.3%) by case The difference in the detection rate of PCV2 in clinical, lesion, PCR, qPCR, ELISA and IHC diagnostic techniques was very significant PCV2 is co-infect with PRRSV, MH, HP and CSFV pathogens The combination of clinical signs, characteristic lesions with PCR testing technique has a certain value to confirm a case caused by PCV2 Keywords: Co-infection, pigs, PCV2 MỞ ĐẦU Circovirus virus khơng có vỏ bọc với gen có dạng vịng DNA mạch đơn thuộc họ Circoviridae (Segales cs., 2005) Bộ gen Circovirus chứa hai khung đọc mở (Open reading frames - ORFs) bao gồm ORF1 ORF2, mã hóa cho protein cap rep, hai protein mã hoá ngược chiều (Palinski cs., 2017) Cho đến nay, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh; Công ty Boehringer Ingelheim, Việt Nam; * Tác giả liên hệ: Đỗ Tiến Duy Email: duy.dotien@hcmuaf.edu.vn; ĐT: 0918.356744 327 HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 327-332 bốn loài Porcine circovirus (PCV) xác định, bao gồm PCV1 không gây bệnh heo (Tischer cs, 1986), PCV2 gây bệnh phổ biến đàn heo (Allan cs., 1998), PCV3 phát lần đầu vào năm 2015 (Palinski cs., 2017) PCV4 vừa phát Trung Quốc (Zhang cs., 2019) Ở Việt Nam, PCV2 xác định xuất từ năm 2000 Tỷ lệ nhiễm phức tạp đồng nhiễm với vi khuẩn vi-rút khác có xu hướng tăng dần qua năm (Lâm Thị Thu Hương, 2012) Các bệnh Porcine circovirus type (PCVD) bệnh liên quan đến Porcine circovirus type (PCVAD) thuật ngữ đề cập đến số thể bệnh gây PCV2 Cho đến nay, chế xác PCVD/PCVAD chưa biết rõ (Ren cs., 2016) Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu báo cáo đồng nhiễm PCV2 với mầm bệnh khác heo, chẳng hạn vi-rút gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản heo (PRRSV), Mycoplasma hyopneumoniae (MH), yếu tố quan trọng tăng mức độ nghiêm trọng PCVD/PDVAD Hơn nữa, việc tiêm phòng thất bại, stress mật độ đàn đông với nhiễm PCV2 gây PCVD/PCVAD (Ren cs., 2016; Chae cs., 2005; Segales cs., 2015; Zhai cs., 2011) Tuy nhiên, nghiên cứu đầy đủ tỷ lệ đồng nhiễm mầm bệnh PCV2 ca bệnh Post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) Porcine Respiratory disease complex (PRDC) Việt Nam phần hạn chế chưa cập nhật thời gian gần Trong nghiên cứu này, phân tích đồng nhiễm mầm bệnh đánh giá tiêu bệnh lý liên quan đến PCV2 ca bệnh lâm sàng thực phương pháp quan sát lâm sàng, mổ khám, mô học vi thể (HE), PCR, Realtime PCR, IHC huyết học (ELISA) NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu thập mẫu Mẫu thu thập từ 98 heo có dấu hiệu lâm sàng liên quan đến PCV2, lứa tuổi 328 - 10 tuần tuổi từ 63 trại khảo sát heo tỉnh thành khu vực phía Nam số tỉnh miền Trung Bắc Thu thập mẫu theo hai dạng: Mẫu mô tươi (Phổi, hạch, lách, thận, gan) cho kỹ thuật xét nghiệm PCR huyết cho kỹ thuật Realtime-PCR; Mẫu mô (Phổi, hạch, lách, thận, gan) cố định formalin 10% cho kỹ thuật HE IHC; huyết thu thập cho xét nghiệm ELISA Các xét nghiệm thực Phòng thí nghiệm nghiên cứu Chăn ni Thú y, Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường đại học Nông Lâm TP HCM) 2.2 Xác định diện mầm bệnh khảo sát Tách chiết DNA/RNA: Mẫu mô tươi xử lý với dung dịch PBS 1X, thu huyễn dịch 10% Ly tâm huyễn dịch thu phần dịch để tách chiết DNA/RNA theo quy trình Bộ kít thương mại (GeneJET Genomic DNA Purification Kit Thermo Scientific, Lithuania) RNA (SV Total RNA Isolation System-Promega, Mỹ) Huyết từ ca bệnh tách chiết DNA kit InviMAG Virus DNA/RNA (INVITEK Molecular, BerLin, Germany) Các kỹ thuật PCR/RT-PCR: Các cặp mồi đặc hiệu sử dụng xác định diện mầm bệnh diện ca bệnh khảo sát tham khảo từ nghiên cứu trước đây: PRRSV (Duy cs., 2015), PCV2 (Larochelle cs., 1999), CSFV (Paton cs., 2000), MH (Abhijit cs., 2012), HP (Hicinova cs., 2010) Phản ứng PCR/RTPCR thực với tổng phản ứng 25 μl chu trình luân nhiệt thực theo quy trình hiệu chỉnh Phịng xét nghiệm thuộc Bệnh viện Thú y, Trường đại học Nông Lâm TP HCM Kết đọc gel agarose 1% buồng chiếu tia UV 2.3 Sự tương quan xét nghiệm PCV2 ca PMWS/PRDC Kỹ thuật Realtime PCR (qPCR) xét nghiệm PCV2: DNA tách chiết sử dụng để định lượng virus PCV2 kĩ thuật TaqMan Realtime PCR, theo hướng HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 327-332 dẫn protocol V615-42 (Chi cục Thú y Vùng VI, Tp HCM), với đoạn mồi: Forward: 5’-CAGATCCTCCGCCGCC-3’, Reverse: 5’-TBTGACTGTGGTASSCTTGACA-3’, Probe: 5’-FAM-CTCCCGCACCTCCMGBNFQ-3’ Phản ứng Realtime PCR có thành phần MasterMix of InvitrogenTM Platinum Quantitive PCR SuperMix-UDG (Cat.No: 1730-017, InvitrogenTM) Giá trị kết thể qua số Ct value, Ct 0.4 Kỹ thuật hóa mơ miễn dịch (IHC): Các khối paraffin cắt tiêu với kích thước - µm, nhuộm theo quy trình thường quy, sử dụng kháng thể sơ cấp đặc hiệu với PCV2 (antibody anti-PCV2 mouse; Rural technology corp) kháng thể thứ cấp (anti-mouse Polyclonal goat immunoglobin/ AP, Dako Denmark A/S) Kết dương tính chấm điểm kháng nguyên (số tế bào dương tính/mm2), quan sát kính hiển vi quang trường (10X), cho điểm từ điểm đến theo phần trăm (%) vi trường nang bạch huyết có tế bào dương tính với kháng ngun PCV2, 0: khơng diện, 1+: diện kháng nguyên < 10% vi trường, 2+: diện kháng nguyên 10 - 50% vi trường, 3+: diện kháng nguyên > 50% vi trường 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Các kết tỷ lệ nhiễm mầm bệnh tính dạng tỷ lệ (%), so sánh Chi-square (χ2) phần mềm thống kê Minitab 16.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tỷ lệ đồng nhiễm PCV2 mầm bệnh khảo sát Đồng nhiễm mầm bệnh chiếm tỷ lệ cao nhất, tỷ lệ nhiễm ghép PCV2 PRRSV chủ yếu (44,4% theo trại 41,8% theo ca bệnh), MH, HP CSFV Tiếp theo đồng nhiễm mầm bệnh (6,3% - 23,8%) theo trại (4,1% - 16,3 %) theo ca bệnh Các trường hợp nhiễm mầm bệnh lúc có tỷ lệ thấp (Hình 1) Hình Tỷ lệ đồng nhiễm PCV2 mầm bệnh theo trại theo ca bệnh Tỷ lệ đồng nhiễm cao PCV2 PRRSV phù hợp với nhiều nghiên cứu trước (Drolet cs., 2003) Cả PCV2 PRRSV có mục tiêu nhiễm gây hại đến tế bào miễn dịch từ làm giảm khả phòng vệ vật chủ (Ouyang cs., 329 HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 327-332 2019) Tổ hợp nhiễm MH PCV2 HP PCV2 chiếm tỷ lệ cao, tương tự kết báo cáo Pallarés cs (2002) Các kết cho thấy PCV2, PRRSV, MH, HP đóng vai trị quan trọng ca bệnh có dấu hiệu hơ hấp sớm heo, mà khảo sát chọn đối tượng lâm sàng PRDC/PMWS 3.2 Tương quan kết xét nghiệm PCV2 ca bệnh khảo sát thấp (26,7%) qPCR so với PCR (100 %), cho thấy mô hạch quan nội tạng có diện thường xuyên mầm bệnh quan đích để thu mẫu chẩn đoán thể bệnh Mẫu bệnh phẩm tốt để chẩn đốn PCV2 mẫu mơ (đặc biệt hạch) kết luận nghiên cứu Lâm Thị Thu Hương Đường Chi Mai (2006) Tương tự kết khảo sát Grau-Roma cs (2009), chẩn đốn PCV2 thơng qua việc phát kháng ngun huyết có độ nhạy thấp Tỷ lệ mức độ dương tính với kháng nguyên PCV2 hạch bạch huyết (IHC) 24 ca bệnh mức thấp, tương ứng 1+ Mặc dù, theo báo Segales cs (2012), phổi viêm liên quan đến PCV2 cho kết dương tính qua nhuộm IHC mức trung bình đến cao (2+ đến 3+) Dấu hiệu lâm sàng, bệnh tích (đại thể vi thể) có kết tương tự 100% với kĩ thuật xét nghiệm PCR (24/24) Nhưng so với xét nghiệm qPCR huyết (4/15; 26,7%), xét nghiệm huyết học ELISA (13/15; 86,7%) xét nghiệm IHC mô tương ứng (3/16; 18,8%) kết ngược lại Sự khác biệt tỷ lệ phát PCV2 kỹ thuật xét nghiệm có ý nghĩa (P = 0,000) Đặc biệt, tỷ lệ phát PCV2 Bảng Tương quan kết xét nghiệm ca nhiễm PCV2 Ca bệnh PMWS /PRDC 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Lâm sàng Bệnh lý Đại thể Vi thể + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Cận lâm sàng PCR qPCR (Ct value) ELISA (S/P) IHC + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + > 40 > 40 > 40 > 40 kxn kxn kxn 38,7 > 40 27,3 29,8 25,4 > 40 > 40 > 40 > 40 > 40 > 40 > 40 kxn kxn kxn kxn kxn 1,76) kxn 0,17 1,81 1,89 2,21 1,75 0,55 0,38 1,86 1,31 1,20 0,99 2,62 2,42 0,78 kxn kxn 1+ 0 kxn kxn 0 1+ 1+ kxn 0 0 0 kxn 330 HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 327-332 22 23 24 Tổng Tỷ lệ (%) + + + 24/24 100 + + + 24/24 100 + + + 24/24 100 + + + 24/24 100 kxn kxn kxn 4/15 26,7 kxn kxn kxn 13/15 86,7 kxn kxn kxn 3/16 18,8 Ghi chú: kxn, không xét nghiệm; +, kết dương; -, kết âm on Biotechnology in agriculture, Ho Chi KẾT LUẬN Minh city Vietnam 65-67 PCV2 thường nhiễm ghép với mầm Ouyang, T., Zhang, X., Liu, X., and Ren, bệnh PRRSV, MH, HP CSFV Sự kết hợp L (2019) Co-infection of swine with dấu hiệu lâm sàng, bệnh tích đặc trưng với kỹ porcine circovirus type and other swine thuật xét nghiệm PCR có giá trị chắn để viruses Viruses 11(2): 185 khẳng định ca bệnh PCV2 Palinski, R., Piñeyro, P., Shang, P., Yuan, F., TÀI LIỆU THAM KHẢO Guo, R., Fang, Y., Byers, E and Hause, M.B (2017) A novel porcine circovirus Abhijit, K.B., Lee, H.Y., Jeong, H.W., distantly related to known circoviruses Truong, Q.L., Joo, H.G and Hahn, is associated with porcine dermatitis and T.W (2012) An improved multiplex nephropathy syndrome and reproductive PCR for diagnosis and differentiation failure Journal of virology 91(1): of Mycoplasma hyopneumoniae and e01879-16 Mycoplasma hyorhinis Korean J Vet Res 52(1): 39-43 Ren, L., Chen, X., Ouyang, H (2016) Interactions of porcine circovirus with Chae, C.A (2005) review of porcine its hosts Virus Genes 52: 437-444 circovirus 2-associated syndromes and diseases Vet J 169: 326-336 Segales, J (2015) Best practice and future challenges for vaccination against Drolet, R., Larochelle, R., Morin, M., Delisle, porcine circovirus type Expert Rev B and Magar, R (2003) Detection rates Vaccines 14: 473-487 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine circovirus type Segalés, J., Sibila, M., Fort, M., Nofrarías, 2, and swine influenza virus in porcine M., Rozas D.P.A., Cardiel, G.I and proliferative and necrotizing pneumonia Mateu, E (2012) Simultaneous porcine Veterinary pathology 40(2): 143-148 circovirus type and mycoplasma hyopneumoniae co-inoculation does Duy, D.T., Park, C., Choi, K., Jeong, J., not potentiate disease in conventional Nguyen, T.T., Le, D.T., Vo, K.M and pigs Journal of comparative pathology Chae, C (2015) Nucleotide sequence 147(2-3): 285-295 analysis of Vietnamese highly pathogenic porcine reproductive and respiratory Sinha, A., Shen, G.H., Schalk, S., Beach, syndrome virus from 2013 to 2014 based M.N., Huang, W.Y., Meng, J.X., Halbur, on the NSP2 and ORF5 coding regions G.P and Opriessnig, T (2011) Porcine Arch Virol 161: 669-675 reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) influences infection Lam Thu Huong and Duong Chi Mai (2006) dynamics of porcine circovirus type Detection of porcine circovirus from (pcv2) subtypes pcv2a and pcv2b by lesions of postweaning-pig with wasting prolonging pcv2 viremia and shedding disease at some farms in Ho Chi Minh Veterinary Microbiology 152: 235-246 city and some adjacent provinces Proceedings of international workshop Tischer, I., Mields, W., Wolff, D., Vagt, 331 HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 327-332 M and Griem, W (1986) Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus Archives of virology 91(3-4): 271-276 Xiao, C.T., Halbur, G.P and Opriessnig, T (2015) Global molecular genetic analysis of porcine circovirus type (PCV2) sequences confirms the presence of four main PCV2 genotypes and reveals a rapid increase of PCV2d Journal of General Virology 96(7): 1830-1841 Zhai, S.L., Chen, S.N., Wei, Z.Z., Zhang, 332 J.W., Huang, L., Lin, T., Yue, C., Ran, D.L., Yuan, S.S and Wei, W.K (2011) Co-existence of multiple strains of porcine circovirus type in the same pig from china Virol J 8: 517 Zhang, H.H., Hu, W.Q., Li, J.Y., Liu, T.N., Zhou, J.Y., Opriessnig, T and Xiao, C.T (2019) Novel circovirus species identified in farmed pigs designated as porcine circovirus 4, Hunan province, China Transboundary and Emerging Diseases  ... 86,7%) xét nghiệm IHC mô tương ứng (3/16; 18,8%) kết ngược lại Sự khác biệt tỷ lệ phát PCV2 kỹ thuật xét nghiệm có ý nghĩa (P = 0,000) Đặc biệt, tỷ lệ phát PCV2 Bảng Tương quan kết xét nghiệm ca nhiễm. .. %) theo ca bệnh Các trường hợp nhiễm mầm bệnh lúc có tỷ lệ thấp (Hình 1) Hình Tỷ lệ đồng nhiễm PCV2 mầm bệnh theo trại theo ca bệnh Tỷ lệ đồng nhiễm cao PCV2 PRRSV phù hợp với nhiều nghiên cứu... Phịng xét nghiệm thuộc Bệnh viện Thú y, Trường đại học Nông Lâm TP HCM Kết đọc gel agarose 1% buồng chiếu tia UV 2.3 Sự tương quan xét nghiệm PCV2 ca PMWS/PRDC Kỹ thuật Realtime PCR (qPCR) xét nghiệm