Đang tải... (xem toàn văn)
Bài giảng Vi sinh vật đại cương: Chương 3 Sinh lý học vi sinh vật, cung cấp cho người học những kiến thức như: Dinh dưỡng và sự trao đổi chất; Sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật;...Mời các bạn cùng tham khảo!
Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 Chương III SINH LÝ HỌC VI SINH VẬT Nội dung chương 3.1 Dinh dưỡng trao đổi chất - Nhu cầu dinh dưỡng vsv - Các kiểu dinh dưỡng vsv - Các hình thức vận chuyển qua màng vsv - Quá trình trao đổi chất: phân giải tổng hợp 3.2 Sinh trưởng phát triển vsv - Lý thuyết sinh trưởng - Đặc điểm sinh trưởng vsv môi trường - Một số phương pháp xác định sinh trưởng vsv 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 3.1.1 Dinh dưỡng vi sinh vật 3.1 Dinh dưỡng trao đổi chất 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Chất dinh dưỡng vi sinh vật chất VSV hấp thu từ môi trường xung quanh sử dụng làm nguyên liệu cho trình sinh tổng hợp cho trình trao đổi lượng tế bào a Thành phần hóa học tế bào • Nước thành phần chủ yếu tế bào vi sinh vật Nước chiếm khoảng 80-% khối lượng tế bào vi sinh vật • Các thành phần lại gồm chất hữu protein, carbohydrate, lipid, axít nucleic, chất khống chất đặc biệt (vitamin ….) • Trong đó, 95% trọng lượng khô tế bào cấu tạo nguyên tố: Cacbon, oxy, hydro, nitơ, sulfur, phosphor, kali, canxi, magiê, sắt 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Thành phần nguyên tố cấu tạo nên tế bào vi sinh vật b Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật - Nước (cung cấp H O) - Carbon: carbon hữu (polysacarit, protein, lipit); carbon vô (CO2, muối carbonat) cung cấp lượng cho TB - Nitrogen: N hữu (protein, axit amin), vô (muối amon NH4+, muối nitrat NO3-), phân tử N2 (vsv cố định đạm) - Muối khoáng (P, K, Na, S…) - Các chất đăc hiệu (vitamin, kháng sinh…) 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 Nguồn C vi sinh vật sử dụng 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Nguồn N vi sinh vật sử dụng TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 9/12/2017 Các nguyên tố vi lượng Muối vô chức sinh lý 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 9/12/2017 10 Nguồn cung cấp C, lượng, điện tử vsv 3.1.2 Các kiểu dinh dưỡng VSV Nguồn Carbon) Căn vào khả đồng hoá VSV nguồn dinh dưỡng Carbon phân hai nhóm: - Nhóm vsv tự dưỡng (autotrophs): Đồng hoá nguồn dinh dưỡng chất vơ - Nhóm vsv dị dưỡng (heterotrophs): Đồng hố nguồn dinh dưỡng chất hữu Căn vào nguồn lượng sử dụng: - Nhóm vsv quang (phototrophs): Sử dụng lượng từ ánh sáng mặt trời ánh sáng nhân tạo - Nhóm vsv hóa (chemotrophs): Sử dụng lượng từ phản ứng hóa học xảy tế bào - Tự dưỡng (autotroph) - Dị dưỡng (heterotroph) Nguồn lượng - Quang (phototroph) - Hóa (chemotroph) Nguồn cung cấp điện tử - Vô - Hữu 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 11 CO2 nguồn C nhất/ chủ yếu Nguồn C chất hữu Nguồn lượng ánh sáng tự nhiên/nhân tạo Nguồn lượng lượng hóa học thu từ q trình oxy hóa hợp chất tế bào Sử dụng phân tử vô dạng khử để cung cấp điện tử Sử dụng phân tử hữu để cung cấp điện tử 12 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 Căn nguồn lượng nguồn Cacbon mà VSV sử dụng để đồng hoá chất, chia làm nhóm dinh dưỡng: - Tự dưỡng quang (Photoautotroph ) - Tự dưỡng hóa (Chemoautotroph) - Dị dưỡng quang (Photoheterotroph) - Di dưỡng hóa (Chemoheterotroph) Nếu nguồn dinh dưỡng đồng hóa Ni-tơ: - Tự dưỡng amin - Dị dưỡng amin 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 13 a Tự dưỡng quang năng: Là nhóm VSV sử dụng lượng ánh sáng mặt trời/nhân tạo để đồng hoá nguồn C chủ yếu CO2 với nguồn cung cấp H hợp chất vô VSV có sắc tố quang hợp: bacteriochlorophyll a, b, c, d hay carotenoid VSV quang năng:Tảo lục, vi khuẩn lam, vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (họ Chlorobiaceae), vi khuẩn lưu huỳnh tía (họ Chromatiaceae) 9/12/2017 14 b Dị dưỡng quang năng: c Tự dưỡng hố năng: • Là nhóm VSV sử dụng lượng ánh sáng để đồng hoá CO2 nguồn cung cấp H hợp chất hữu rượu, axit hữu đơn giản • Thuộc loại có giống vi khuẩn khơng lưu huỳnh màu lục, màu tía Rhodospirillum rubrum (xoắn khuẩn màu hồng hay đỏ tía) • Là nhóm VSV sử dụng lượng từ oxy hố chất vơ để đồng hố C vơ (CO2) • Nhóm vsv tự dưỡng hóa năng: VK phân giải lưu huỳnh, VK phân giải sắt, VK nitrat, nitrit hóa, VK oxy hóa methane, VK sử dụng hydrogen… • Sơ đồ tổng quát: VK oxy hóa hợp chất vơ để giải phóng lượng tham gia vào trình tổng hợp cac chất dinh dưỡng 9/12/2017 15 d Dị dưỡng hố năng: 9/12/2017 16 Tóm tắt loại hình dinh dưỡng vi sinh vật • Là nhóm VSV sử dụng lượng từ oxy hố chất hữu để thực q trình sinh tổng hợp chất cần thiết cho tế bào • Phần lớn nhóm VSV thuộc nhóm này: phần lớn vi khuẩn, nấm, protozoa) • Tuỳ theo loại VSV khác mà tiến hành q trình oxy hố cho lượng khác nhau: 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 17 9/12/2017 18 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 3.1.3 Cơ chế hấp thu chất dinh dưỡng VSV Các chất vận chuyển qua màng tế bào chất thông qua hai chế: Vận chuyển thụ động (Khuếch tán đơn giản): Các chất qua màng NSC nhờ chênh lệch nồng độ hai phía màng (khơng tiêu tốn lượng tế bào) Vận chuyển chủ động: Các chất qua lại màng NSC nhờ liên kết với phân tử vận chuyển đặc biệt nằm màng Những phân tử gọi pecmeaza (protein thấm) Vận chuyển chủ động cần tiêu tốn lượng tế bào 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 19 a Vận chuyển thụ động Các phân tử qua màng nhờ chênh lệch nồng độ (trong trường hợp chất không điện phân) hay chênh lệch điện (trường hợp ion) hai phía màng Kiểu vận chuyển không tiêu tốn lượng tế bào vi sinh vật Có hình thức vận chuyển thụ động: - Khuếch tán đơn giản (simple diffusion) - Khuếch tán xúc tiến (kt gia tốc- facilitated diffusion) - Sự thẩm thấu (osmosis ) 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 20 a1: Khuếch tán đơn giản (simple diffusion): Là hình thức vận chuyển chất hịa tan từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp không tiêu tốn lượng Sự khác biệt nồng độ chất bên màng NSC tạo nên gradient nồng độ phần tử chất từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp đạt tới cân động hai bên màng mà khơng địi hỏi phải cung cấp lượng KTĐG phụ thuộc vào động (kinetic energy) phần tử nên khuếch tán xảy nhanh (1) nhiệt độ tăng, (2) gradient nồng độ lớn (3) vật thể có kích thước nhỏ Lipid, chất tan lipid oxy, nitơ, CO2, vitamin tan Khuếch tán đơn giản dầu (như vitamin A, D, E, K), rượu, cồn 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 21 a2 Khuếch tán xúc tiến (facilitated diffusion) • Đặc điểm: Tốc độ khuếch tán tăng dần đến mức tối đa dừng lại, nồng độ chất khuếch tán tiếp tục tăng Những chất vận chuyển khuếch tán xúc tiến: có kích thước lớn khơng màng phương thức khuếch tán đơn giản (glucose, mannose, galactose, xylose, arabinose phần lớn acid amin) TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 22 a3 Thẩm thấu (osmosis) • Là khuếch tán nhờ vai trị protein mang 9/12/2017 9/12/2017 • Là tượng vận chuyển thụ động phân tử nước từ nơi có nồng độ nước cao (nồng độ chất hịa tan thấp) tới nơi có nồng độ nước thấp (nồng độ chất hòa tan cao) Phân tử nước vận chuyển môi trường có nồng độ nước chất tan khác ? 23 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 24 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 b Vận chuyển chủ động Hiện tượng thẩm thấu (Osmosis) - Là hình thức vận chuyển sử dụng lượng ATP nhằm đưa chất tan ngược chiều gradient nồng độ chúng Mơi trường có nồng độ chất tan cao nồng độ chất tan tế bào Môi trường Ưu trương - Hình thức vận chuyển thực qua vai trò protein xuyên màng đặc hiệu, đóng vai trị bơm hoạt động nhờ ATP để đẩy ion Na+, K+, H+, Ca2+, I-, Clhoặc phân tử nhỏ acid amin, monosaccharide ngược lại chiều gradient nồng độ chúng Mơi trường có nồng độ nước cao nồng độ nước tế bào môi trường Nhược trương - Các hình thức vận chuyển chủ động; + Bơm ion (ion pump – vận chuyển chủ động nguyên phát) Nồng độ nước/chất tan cân môi trường TB MT đẳng trương + Đồng vận chuyển (cotransport – VCCĐ thứ phát) + Chuyển vị nhóm (group translocation) + Nhập bào (endocytosis) 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 25 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 26 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 28 b1: Bơm ion: Bơm Natri-kali • Bơm natri - kali (bơm Na+ - K + - ATPase): bơm Na+ khỏi tế bào, đồng thời bơm K + vào tế bào Bơm natri - kali có màng loại tế bào • Bơm natri - kali protein mang có hai phân tử protein dạng cầu, to nhỏ Chưa biết chức phân tử protein nhỏ Protein to có vị trí tiếp nhận (receptor) đặc hiệu với Na+ mặt vị trí tiếp nhận (receptor) đặc hiệu với K + mặt ngồi Ở mặt trong, gần receptor tiếp nhận Na+ có enzyme ATPase • Khi có Na+ gắn mặt K + gắn mặt phân tử protein mang enzyme ATPase hoạt hố, phân giải phân tử ATP giải phóng lượng Năng lượng làm thay đổi hình dạng phân tử protein mang, để đưa Na+ K + vào tế bào 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 27 b2: Đồng vận chuyển (cotransport) Video: Bơm Na - K • Là q trình vận chuyển lúc chất qua màng • Ví dụ: Bơm Na+ - K+ - ATPase hoạt động tạo nồng độ Na+ cao bên màng tế bào Nồng độ cao năng, có xu hướng làm Na+ khuếch tán vào bên trong, Na+ vào "kèm theo" chất khác gắn vào chất mang chung với Na+ • Những chất chiều với Na+ gọi "đồng vận-symport", chất ngược chiều gọi "đối vận -antiport" hay "đổi chỗ" 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 29 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 30 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 b3: Sự chuyển vị nhóm (group translocation) Video: chuyển vị nhóm vi khuẩn • Là hình thức vận chuyển vi khuẩn sử dụng để hấp thu đường (glucose, mannose, fructose cellobiose) nhờ hệ thống Phosphotransferase system (PTS) • PTS gồm enzyme (EI EII) protein ổn định nhiệt có phân tử lượng thấp • Hinh thức vận chuyển cần sử dụng lượng trao đổi chất từ Phosphoenolpyruvate (PEP) • PEP + Đường (ngoại bào) → Pyruvate + Đường + P (nội bào) thành gluocose 6-photsphate 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 31 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 32 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 34 b4 Nhập bào (endocytosis) • Là hình thức vận chuyển tế bào có nhân thật (Eukaryotes) Thực bào (phagocytosis- tế bào ăn): Hấp thu chất dinh dưỡng chất rắn,có kích thước lớn • Các sản phẩm tiếp xúc với màng tế bào màng tế bào lõm vào tạo túi thực bào, túi thực bào tách khỏi màng tế bào màng lại trở trạng thái bình thường Ẩm bào (pinocytosis - tế bào uống): trình diễn trên, khác chất nhập bào dịch lỏng chất tan có kích thước nhỏ • Tiêu hóa qua receptor trung gian (receptor-mediated endocytosis): màng tế bào lõm vào receptor protein đặc biệt gắn với chất nhập bào để tạo thành túi thực bào 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 33 Video: Vận chuyển qua màng vsv 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Vận chuyển qua receptor trung gian nấm men 9/12/2017 Bài tập: Cho biết hình thức vận chuyển hình 35 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 36 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 3.2 Trao đổi chất vsv (metabolism) 3.2.2 Quá trình trao đổi lượng 3.2.1 Khái niệm chung a Hô hấp VSV a Khái niệm trao đổi chất: Là chuyển hoá có liên quan đến qúa trình tổng hợp phân huỷ tế bào Trao đổi chất gồm có hai q trình đồng hố dị hố • Q trình đồng hoá (anabolism): Tổng hợp chất hữu phức tạp từ chất đơn giản (quá trình chế biến lại chất dinh dưỡng hấp thụ thành chất riêng tế bào loại vi sinh vật) Quá trình q trình sử dụng lượng • Q trình dị hố (catabolism): q trình phân cắt phân tử hữu phức tạp (từ TA) thành phân tử đơn giản cung cấp lượng (ATP) cho hoạt động sống TB Quá trình tạo lượng Ở vi sinh vật, trình TĐC tổng hợp phản ứng hoá học diễn tế bào, gồm hai dạng: Trao đổi lượng trao 37 đổi kiến tạo Hô hấp hiếu khí Q trình hơ hấp diễn điều kiện có oxy để chuyển hóa glucose thành CO2 cung cấp lượng (ATP) cho TB Gồm giai đoạn: đường phân, Kreb cycle, chuỗi vận chuyển điện tử • Đường phân glucose bị thủy phân thành pyruvat - Pyruvat bị khử carboxyl -> acetyl coenzyme A + CO2 - NAD+ oxi hóa NADH+ H+ • Acetyl coenzyme A tham gia chu trình Kreb khử carboxyl giải phóng CO2; NAD+ oxi hóa thành NADH2; FAD+ FADH2 • NADH2 tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử điều kiện có oxy oxi hóa để tạo thành H2O giải phóng lượng ATP Chất nhận điện tử: Oxy phân tử Sản phẩm cuối cùng: 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 39 Hơ hấp yếm khí • Là trình phân giải hợp chất carbohydrate điều kiện khơng có oxy • Gồm giai đoạn: Đường phân chu trình Kreb chuỗi hơ hấp, vận chuyển điện tử giống hơ hấp hiếu khí • Trong ĐK khơng có oxy: NADH+H+ bi oxy hóa trở lại thành NAD+ Mục đích: để tái tạo NAD+ trình đường phân tiếp tục điều kiện khơng có oxy • Chất nhận điện tử: chất vô cơ: NO3-, SO42-, CO32- NO3- (nitrate) bị khử thành NO2- (nitrite) - SO42- (sulfate) bị khử H2S (hydrogen sulfide) - CO32- (carbonate) bị khử CH4 (methane) • Tạo thành ATP • Khả sinh ATP thấp so với hô hấp hiếu khí phần chu trình Kreb diễn điều kiện khơng có oxy 41 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Là q trình oxi hố khử hợp chất hữu cơ, chủ yếu carbonhydrate Đối với vsv q trình oxi hóa khử thực cách tách H khỏi chất chuyển cho chất nhận khác nhau: oxi phân tử (O2), chất hữu chất vơ VSV có kiểu hơ hấp: Yếm khí hiếu khí Đối với hơ hấp carbonhydrate giống trình đường phân 9/12/2017 38 • Ở vsv nhân thật, glucose bị oxi hoá tận cho 36 ATP; Ở nhân sơ 38 ATP Hơ hấp hiếu khí nguồn cung cấp lượng ATP cho hoạt động sống TB • Q trình hơ hấp diễn ty thể (TB nhân thật) màng NSC (TB nhân sơ) Một số nấm sợi, vi khuẩn oxi hóa không triệt để hợp chất hữu CO2 H2O mà tạo sản phẩm trung gian axit hữu cơ: - Nấm Aspergillus niger cho axit oxalic - Nấm Penicillium glaber cho axit limonic - Nấm Mucor, Rhizopus cho axit fumaric - Vi khuẩn axitic thuộc giống Acetobacter oxi hoá ethanol axit axetic 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 40 Ví dụ: Nitrat oxy hóa điều kiện yếm khí Nitrat bị oxy hóa oxy chuyển thành Nitrit + nước Một số vk Pseudomonas, Bacillus oxy hóa nitrit nitric oxide (NO), nitrous oxide (N2O) khí N2 có vài trị quan trọng vịng tuần hoàn N tự nhiên 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 42 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 b Lên men Lên men lactic Là trình oxy hóa khơng hồn tồn đường glucose hợp chất hữu khác điều kiện khơng có oxy Axit pyruvic hình thành trình đường phân khơng tham gia vào chu trình Kreb, chuỗi hơ hấp bị khử để tạo thành a lactic, ethanol sản phẩm khác Giải phòng lượng nhỏ lượng: ATP Chất nhận điện tử cuối cùng: hợp chất hữu Sản phẩm tạo thành qua trình lên men nhờ nấm men, vi khuẩn lactic….: - Ethanol + CO2 - Các dung môi hữu cơ: acetone, butanol - Các axit hữu cơ: a lactic, a axetic - Vitamin, kháng sinh, hormone, axit amin… 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 43 : Pyruvat tạo thành q trình đường phân bị oxi hóa nhờ enzyme lactase dehydrogenase thành a lactic Lên men lactic đồng hình: Là trình lên men mà sản phẩm cuối axit lactic Glucose (fructose) Lactic acid + ATP Lên men lactic dị hình: trình lên men mà sản phẩm cuối thu ngồi axit lactic cịn có có sản phẩm khác axit axetic, ethylic, CO2… Ứng dụng: Sản xuất a lactic công nghiệp; Lên men sản phẩm sữa (sữa chua, phomat…); sản phẩm thực vật (muối dưa…); Ủ chua thức ăn xanh cho gia súc nhai lại; Sản xuất chế phẩm probiotics… 9/12/2017 Lên men rượu 44 Một số trình lên men khác: Các vsv tham gia sản phẩm cuối Được thực nấm men môt số vi khuẩn Ứng dụng: Sản xuất cồn - Sản xuất rượu/bia… Ethanol hình thành lên men tiếp đê hình thành axit acetic (dấm) nhờ vk Acetobacter Axit acetic lên men tiếp methan (CH4) vk Methanosarcina 9/12/2017 45 3.2.3 Quá trình phân giải hợp chất môi trường 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 46 a Sự phân giải hợp chất không chứa N Phân giải cellulose) Quá trình phân giải VSV: trình phân giải chất dinh dưỡng môi trường thành chất đơn giản nhờ enzyme ngoại bào (protease, amylase, cellulase …) Sản phẩm trình phân giải VSV hấp thu để sinh tổng hợp thành phần tế bào tiếp tục phân giải theo kiểu hô hấp hay lên men Đặc điểm: - Quá trình phân giải xơ trải qua giai đoạn khác với tham gia enzyme Cellulase khác là: C1: Cellobiohydrolase Cx: Endoglucanase Exoglucanase -glucosidase - Sản phẩm q trình phân giải: glucose •Sự phân giải hợp chất khơng chứa N •Sự phân giải hợp chất chứa N 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 47 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 48 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 Vi sinh vật phân giải xơ: Một số nấm sợi có khả phân giải chất xơ tốt Vi sinh vật hiếu khí: - Một số giống niêm vi khuẩn Cytophaga, Sporocytophaga, Cellulomonas - Một số loài vi khuẩn: giống Bacillus, Clostridium - Một số loài thuộc giống xạ khuẩn Streptomyces - Nấm mốc: Trichoderma, Aspergillus Vi sinh vật yếm khí: điển hình lồi vi khuẩn sống cỏ loài nhai lại Ruminococcus - Ứng dụng: Các enzyme phân giải cellulose phân lập từ vsv ứng dụng lĩnh vực: + Sản xuất phân bón vi sinh (nấm trichoderma….), chất tẩy rửa sinh học + Sử dụng lên men thức ăn chăn nuôi gia súc nhai lại (ủ chua) + Sản xuất enzyme cellulase qui mô công nghiệp + Tham gia phân giải chất xơ đất tăng độ phì nhiêu đất, cung cấp chất dinh dưỡng cho trồng 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 49 Aspergillus 9/12/2017 Mucor Fusarium TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 50 Sự phân giải pectin Phân giải xylan • Xylan loại hemicenlullose phân bố rộng tự nhiên có nhiều thành phần tế bào thực vật, rơm rạ, bẹ ngô, trấu… - Vi sinh vật phân giải xylan: sinh enzyme xylanase + Những VSV phân giải cellulose phân giải xylan +Trừ vài loại VSV (Clostridium) hầu hết enzyme xylanase sinh có mặt xylan chất cảm ứng - Quá trình phân giải: nhờ enzyme xylanase + Hemicellulose (xylan) bị thủy phân nhờ xylanase thu hexose (mannose, galactose ) pentose (arabinose, xylose) Ứng dụng: Enzyme xylanase thu từ vsv ứng dụng để: - Sản xuất phân bón vi sinh hữu - Lên men nguyên liệu giàu xơ sử dụng chăn nuôi, sản xuất cồn sinh học (đường hóa xơ) 9/12/2017 Vi nấm Trichoderma sp TS Nguyễn Thị Tuyết Lê •Pectins tồn dạng: Rhamnogalacturonans, Arabinans, Galactans Arabinogalactans •Vi sinh vật phân giải pectin: VK (Bacillus), xạ khuẩn (Streptomyces nocardia), Nấm mốc (Mucor stolonifer), Nấm men (Saccharomyces fragilis) •Q trình phân giải pectin: Nhờ enzyme pectinase gồm loại: Pectin acetylesterase, Rhamnogalacturonase, Polygalactorunase Pectin esterase • Sản phẩm trình phân giải: Các pectin bị thủy phân chất hòa tan axit galacturonic, arabinose, xylose, galactose, axit acetic, methanol 51 52 Ứng dụng trình phân giải pectin vsv • Phần lớn pectin có loại hạt có dầu (đỗ tương, hạt hướng dương, hạt cải dầu…) Trong ngũ cốc (ngô 5-7%) với tỷ lệ thấp • Trong thành phần nonstarch polysaccharide (NSP) đỗ tương, pectin chiếm tỷ lệ lớn 50-55%, tồn hai dạng: Arabinogactactan Galacturonan Động vật dày đơn khơng có enzyme tiêu hóa pectin 53 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Các vsv có khả phân giải pectin sử dụng để sản xuất enzyme pectinase công nghiệp Enzyme thu được sử dụng lĩnh vực: Sản xuất thức ăn gia súc: pectinase bổ sung vào thức ăn để tăng khả tiêu hóa chất xơ động vật dày đơn Cơng nghiệp sợi, dệt, làm bao bì… (đay, gai Ngâm vào bể có vsv phân giải pectin sợi đay, gai rời nhau, bóng sạch) Phân giải hợp chất xơ đất cung cấp chất dinh dưỡng cho trồng Sản xuất phân bón vi sinh hữu Trong sản xuất nước rượu nho: Enzyme pectinase sử dụng nhằm mục đích tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng dịch quả, làm dung dịch 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 54 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 Sự phân giải lignin: Tóm tắt q trình phân giải lignin chất xơ khác • Vi sinh vật phân giải lignin: -Nấm (Acomycestes, Basidiomycetes); Xạ khuẩn (Streptomyces) Vi khuẩn (Pseudomonas Flavobacterium, Agrobacterium ) • Q trình phân giải: VSV tiết enzyme Ligninase: Lignin peroxidase; Mananese peroxydase, Laccase • Các sản phẩm phân giải lignin: axit a gallic, a protocatechic VSV huy động phần vào tổng hợp chất mùn đất, cịn phần khác bị oxi hố tiếp thành chất vơ • Ứng dụng lĩnh vực - Xử lý rác thải; Sản xuất phân bón vi sinh hữu Phân giải chất xơ đất tăng độ phì nhiêu cho đất Sản xuất nhiên liệu sinh học; Chế biến thức ăn chăn nuôi (đường hóa xơ) - Cellulose hemicellulose polymers cấu tạo từ phân tử đường Sử dụng enzyme thủy phân lignin, cellulose hemicellulose giải phóng phân tử đường làm nguyên liệu lên men sản xuất cồn 55 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 56 Phân giải tinh bột • Tinh bột chất dự trữ chủ yếu thực vật Đơn vị cấu tạo tinh bột -glucose liên kết với liên kết glucosid Trong tinh bột có hai thành phần amylose (20%) amylopectin (80%) • Vi sinh vật phân giải tinh bột có khả tiết mơi trường enzyme amilase • Enzyme Amylase phân giải tinh bột: α-amylase, -amylase, γAmylase (tên khác glucoamylase) • Sản phẩm cuối trình thủy phân tinh bột đường đơn (glucose, mannose…) Các giai đoạn thủy phân tinh bột nhờ enzyme amylase sản phẩm tạo thành 57 • Vi sinh vật phân giải tinh bột: 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 58 Phân giải hợp chất carbohydrate vsv cỏ: - -amylase: Vi khuẩn (Bacillus subtilis, B licheniformis, B megaterium; Lactobacillus brevis…), Nấm men (Candida sitophila, C.japonica); Nấm sợi, Xạ khuẩn VSV cỏ (chủ yếu vi khuẩn) lên men carbohydrate đê giải phóng lượng + khí (CH4, CO2) axit béo bay (VFA): a axetic, a.propionic, a butyric (95%) - -amylase: chủ yếu thực vật Một vài vsv có sinh amylase như: Bacillus megaterium, B polymyxa, B cereus; Streptomyces… - Glucoamylase: Nấm sợi sản sinh nhiều nhóm vsv (Aspergillus sp., Rhizopus sp., Endomyces sp….) Ứng dụng: - Sản xuất thực phẩm - Sản xuất rượu, bia -Chế biến thức ăn chăn nuôi: lên men cám gạo, bột ngô với nấm men… - Xử lý nước thải, chất thải chăn nuôi … 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 59 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 60 10 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 Phân giải lipid vsv cỏ: Phân giải lipid VSV phân giải lipid: Anaerovibrio lipolytica - VSV tiết enzyme lipase thủy phân lipid glycerol axit béo - Glycerol lên men axit béo bay - Axit béo vk sử dụng để tổng hợp phospholipid màng TB - VSV cỏ khử axit béo không no axit béo no VSV thủy phân lipid nhờ tiết enzyme lipase thành sản phẩm cuối glycerol axit béo: - Glycerol chuyển hóa thành dihyroxyacetone phosphate tham gia vào trình đường phân sản phẩm cuối pyruvate - Axit béo bị oxi hóa axetyl CoA tham gia vào chu trình Kreb 9/12/2017 61 62 b Sự phân giải hợp chất có chứa N Phân giải protein • Vi sinh vật phân giải protein: Hầu hết VSV phân giải protein mức độ khác nhau, hoạt tính protease cao thuộc giống nấm mốc vi khuẩn • Enzyme: protease, peptidase • Q trình phân giải: protease peptidase Protein polypeptide, oligopeptide axit amin Quá trình phân giải protein axit amin protease peptidase - Axit amin tế bào hấp thu, phần sử dụng tổng hợp protein tế bào, phần tiếp tục phân giải thành NH3 Ứng dụng trình phân giải protein vsv: - Chế biến thực phẩm: tương, xì dầu, nước mắm….(nấm Aspergillus oryzae…) - Xử lý chất thải chăn nuôi, rác thải… - Sản xuất enzyme protease qui mô công nghiệp 9/12/2017 63 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 64 Sự phân giải urê • Urê hợp chất hữu đơn giản chứa tới 46,6% N • Urê thành phần N hữu chủ yếu nước tiểu động vật (chiếm (2,2%) • Nêu đặc điểm trình phân giải hợp chất vi sinh vật • Ứng dụng tác hại trình phân giải vi sinh vật đời sống • Các vi khuẩn, số xạ khuẩn nấm mốc có khả sinh enzyme urease có khả phân giải tốt urê Các vi khuẩn phân giải urê thường sống hiếu khí yếm khí tuỳ tiện, chúng phát triển tốt mơi trường trung tính kiềm, sử dụng nguồn N mà không sử dụng nguồn C urê urease urease 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 65 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 66 11 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 Tóm tắt hoạt động phân giải tổng hợp VSV 3.2.4 Các trình tổng hợp chất hữu • Là q trình sử dụng nguyên liệu thu từ trình phân giải hấp thu qua màng để tổng hợp nên thành phần tế bào vsv Đây trình tiêu tốn lượng TB - Tổng hợp polysaccharide - Tổng hợp Lipids - Tổng hợp amino acids protein - Tổng hợp axit nucleic 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 67 a Tổng hợp polysaccharide vsv dị dưỡng - Polysaccharide tham gia cấu tạo thành TB VSV gồm: peptidoglycan, lipopolysaccharide VK, glucan cellulose VSV nhân thật Các polysaccharide tổng hợp từ hợp chất C đường đơn đường phân tham gia vào chu trình Kreb UDP-glucose ADP-glucose • UDP-glucose (uridine diphosphate glucose): Là tiền chất để tổng hợp màng TB VK • ADP-glucose (Adenosine diphosphate glucose): tiền chất để tổng hợp glycogen VK Các polysaccharide tổng hợp từ hợp chất phi C (lactate, pyruvate, glycogenic, amino acids, propionate, glycerol, dihydroxyacetone dicarboxylic acids ) tham gia vào đường Gluconeogenesis pentose phosphate để tổng hợp glucose đường phân Glucose bị phosphoryl hóa nhờ enzyme hexokinase glucokinase glucose-6phosphate UDP glucose nhờ enzyme UDP glucose phosphorylase: tiền chất để tổng hợp cellulose, lipopolysaccharide, 69 peptidoglycan b Cố định quang hợp CO2 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Tổng hợp polisaccharide TB vsv 9/12/2017 Tổng hợp glycogen VK TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 70 c Sinh tổng hợp lipid Glucose tham gia q trình đường phân chuyển hóa thành glyceraldehyde 3phosphate dihydroxyacetone phosphate Glycerol Các vsv tự dưỡng sử dụng CO2 làm nguồn C chủ yếu VSV cố định CO2 qua đường TĐC: - Chu trình Calvin-Benson: VSV nhân thật - Con đường 3hydroxypropionate bi-cycle: cổ khuẩn (Thermoproteus, Sulfolobus) vk Chlorobium, Desulfobacter - Chu trình Kreb/TCA khử: VK sinh CH4, khử sulfate, vk sinh acetat 9/12/2017 68 Axit pyruvic hình thành trình đường phân Kreb cycle Acetyl CoA axit béo Lipid tổng hợp từ axit béo glycerol 71 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 72 12 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 d Sinh tổng hợp axit amin protein Tất amino acid tổng hợp trực tiếp gián tiếp từ sản phẩm trung gian trình phân giải hợp chất carbohydrate, đặc biệt chu trình Kreb Phản ứng amin hóa/trao đổi amin: Axit hữu + nhóm amin axit amin Một số vsv khơng thực q trình này, mà cần phải có sẵn axit amin để tổng hợp protein Sinh tổng hợp purine pyrimidine Nhiều VK nấm sử dụng glutamate-dehydrogenase để chuyển nhóm amin từ glutamate aa 73 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 9/12/2017 74 e Quá trình cố định N2 - Một số VSV có khả cố định N khơng khí chúng có enzyme nitrogenase phá vỡ mối liên kết bền vững phân tử N2 (NN) Vi sinh vật cố định nitơ: VSV cố định nitơ gồm có nhóm vi khuẩn • Vi khuẩn cố định nitơ tự do: Có giống chủ yếu Azotobacter, Clostridium vi khuẩn lam sống tự do, hai giống quan trọng Azotobacter Clostridium • Vi khuẩn lam: Anabaena azollae sống cộng sinh với bèo hoa dâu (Azolla) có khả cố định N nhờ vào hệ thống nitrogenase chúng Hoạt tính cố định N vào khoảng 1-2,5 = mol/g/giờ, có ý nghĩa quan trọng ruộng lúa • Vi khuẩn cộng sinh: Vi khuẩn nốt sần rễ họ đậu Tổng hợp protein vsv: nhóm nhân sơ nhân thật 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 75 Cơ chế cố định N • Sự cố định N cần có enzyme Nitrogenase • Nitrogenase dễ bị bất hoạt O2 VK hiếu khí phải có chế giữ N2-ase khơng tiếp xúc với O2 • Enzyme xúc tác phản ứng chuyển N2 thành Ammonia (NH3) TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 9/12/2017 76 3.3 Sinh trưởng vi sinh vật T0=0 Phút Sinh trưởng vsv gì? Nó khác với sinh trưởng sinh vật bậc cao? T1=20 phút T2= 40 phút • Sinh trưởng vi khuẩn tăng số lượng tế bào quần thể, khơng phải tăng kích thước TB • Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển vsv nghiên cứu biến đổi quần thể 77 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 78 13 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 a Cơ sở lý thuyết sinh trưởng 3.3.1 Lý thuyết sinh trưởng vi khuẩn Có thể biểu thị tăng số lượng tế bào nói theo cấp số nhân: • Nghiên cứu sinh trưởng vi khuẩn tiến hành quần thể cá thể TB có kích thước nhỏ, thời gian sinh trưởng ngắn khó tách biệt xác định chi tiết khối lượng kết cấu tế bào để đánh giá sinh trưởng • Các phương pháp nghiên cứu - Đếm số lượng tế bào - Xác định trọng lượng tế bào (sinh khối) - Phân tích hàm lượng thành phần hố học ARN, ADN, protein sản phẩm trao đổi chất (rượu, axit hữu ) - Xác định hệ số hô hấp (sự hấp thu O2 hay CO2 thải CO2 hay O2) TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 9/12/2017 79 Số lượng TB tăng theo logarithm (giả sử thời gian hệ 20 phút, nuôi cấy từ TB ban đầu) 21 22 23 24 25 26 … 2n Cơng thức tính số lượng TB thời điểm: Nt = N0 x 2n Nt: Số lượng TB tính thời điểm kết thúc ni cấy N0: số lượng TB ban đầu thời điểm bắt đầu nuôi cấy n: Số lần TB phân chia Tính n theo logarith thập phân: log Nt = log N0 + n log2 n = (log Nt – log N0)/log2 = (log Nt – log N0)/0,301 Ví dụ: Nuôi cấy 500 TB Staphylococcus aureus môi trường 6h Số lượng TB tăng lên 3x106TB Hỏi TB tụ cầu vàng phân chia lần? Thời gian lần phân chia bao lâu? n = log(3x106)- log(500)/0,301 =(6,47-2,7)/0,301 = 12,5 g = (60 phút x giờ)/ 12,5 = 28,8 phút/thế hệ 80 Thời gian hệ (g): Là thời gian cần thiết để tế bào tăng gấp đôi số lượng quần thể t Đơn vị tính (phút, giờ) n = t/g g= n 2n N x 2n Log10 SLTB 20 25 32 1,51 10 210 1024 3,01 Thời gian hệ E coli g= 360 : 18 = 20 phút = 0,33 15 215 32.768 4,52 16 216 65.356 4,82 Tốc độ sinh trưởng (R): Là số hệ sinh đơn vị thời gian n logNt – logNo 18 218 262.144 5,42 20 220 1.048.576 6,02 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Ví dụ: Ni cấy TB E coli phịng thí nghiệm 37oC quần thể TB phân chia 18 lần Hỏi thời gian hệ E coli bao nhiêu? 6h = x 60 phút = 360 phút R= t 81 b Quy luật sinh trưởng điều kiện nuôi cấy tĩnh (hệ thống đóng) • MT ni cấy tĩnh: Là môi trường không bổ sung chất dinh dưỡng khơng loại bỏ sản phẩm trao đổi chất • Sinh trưởng vsv biểu đường cong sinh trưởng gồm có giai đoạn/pha: - Pha lag (pha tiềm tàng) - Pha log (pha logarith) - Pha cân - Pha tử vong 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê n 83 = 0,301 t Tốc độ sinh trưởng VSV phụ thuộc vào: - Loài vi khuẩn - Môi trường dinh dưỡng - Yếu tố ngoại cảnh (Nhiệt độ nuôi cấy, độ ẩm…) 82 Pha lag (pha tiềm tàng): • Khơng tăng số lượng tế bào Nguyên nhân: tế bào vsv cần có thời gian để thích ứng với điều kiện chuyển từ trạng thái nghỉ sang trạng thái hoạt động Đó thời gian cần cho tổng hợp enzyme thành phần cần thiết cho trình chuyển hố • Độ dài pha phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tuổi tế bào, giống, môi trường dinh dưỡng, điều kiện ni cấy • Nếu cấy tế bào trẻ, giai đoạn sinh trưởng nhanh vào môi trường không khác môi trường nuôi cấy cũ điều kiện ni cấy thích hợp không xuất pha lag 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 84 14 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 Pha logarit (pha sinh trưởng theo luỹ thừa) • Số lượng tế bào tăng lên nhanh theo luỹ thừa Tế bào có kích thước điển hình, có tương tự thành phần hố học hoạt tính sinh lý trao đổi chất Tế bào có đề kháng cao với điều kiện ngoại cảnh Pha ổn định (cân bằng) • Độ dài độ cao đường biểu diễn pha phụ thuộc vào yếu tố giống, dinh dưỡng, điều kiện ni cấy • Số lượng TB sống giảm theo luỹ thừa số lượng tế bào tổng cộng khơng giảm • Một số lồi vi khuẩn có hình thành nha bào • Nguyên nhân: nồng độ chất dinh dưỡng giảm thấp, trao đổi chất tế bào giảm mạnh, xuất phân huỷ chất dự trữ tế bào; Thêm vào tích luỹ tăng cao chất độc làm chết hàng loạt tế bào Trong môi trường tự nhiên (đất, nước…), pha log vi khuẩn có diễn khơng? Tại sao? 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 85 Sinh trưởng kép • Khi chuyển TB sinh trưởng logarith vào mơi trường khác với mơi trường trước có xuất pha lag • Ngun nhân: thích ứng vi khuẩn với điều kiện ni cấy (tổng hợp enzyme mới) • Đặc trưng tượng sinh trưởng kép đường cong sinh trưởng gồm hai pha lag hai pha log • Số lượng tế bào trạng thái cân động học - số lượng tế bào sinh cân với số lượng tế bào chết sinh khối TB ổn định • Nguyên nhân: nồng độ chất giảm dần, tích luỹ dần chất độc xuất yếu tố bất lợi làm cho tốc độ sinh trưởng giảm dần Pha tử vong 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 86 c Quy luật sinh trưởng điều kiện nuôi cấy liên tục Đường cong sinh trưởng kép E.coli nuôi cấy mơi trường Glucose - Sorbitol • Ni cấy liên tục (hệ thống mở): Là môi trường bổ sung liên tục chất dinh dưỡng đồng thời loại bỏ chất thải trì cân động học • Trong phương pháp thể tích bình ni cấy giữ không đổi, cách điều chỉnh tốc độ môi trường vào sản phẩm cuối q trình ni TB cung cấp điều kiện mơi trường khơng đổi • Hệ thống ni cấy Chemostat Chemostat 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 87 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 88 c Ứng dụng quy luật sinh trưởng vsv Trong nuôi cấy, nhân giữ giống : Nhân giống môi trường chuẩn với điều kiện thuận lợi dùng giống gốc trẻ để rút ngắn pha lag chuyển nhanh sang pha log nhằm thu số lượng tế bào lớn có hoạt tính cao thời gian ngắn Cần cấy truyền giống nhân giống định kỳ sản xuất, tế bào VSV chưa giai đoạn già, thoái hoá Đường cong sinh trưởng môi trường nuôi cấy liên tục Ứng dụng phương pháp nuôi cấy liên tục: Trong sản xuất sinh khối protein, sản xuất chế phẩm sinh học (enzyme, kháng Công tác nghiên cứu giống mặt hoạt động sinh lý khác VSV cần thiết phải tiến hành pha log pha số lượng tế bào lớn, có lực trao đổi chất mạnh, có hình thái đặc tính sinh lý điển hình sinh …), sản xuất chế biến thực phẩm (bia, sản phẩm lên men…) 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 89 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 90 15 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 Trong chế biến thực phẩm, sản xuất chế phẩm sinh học: Để đạt hiệu cao chế biến sản xuất chế phẩm sinh học cần phải tạo điều kiện để tế bào vsv phát triển nhanh đạt số lượng tế bào lớn: tế bào đạt nhanh tới giai đoạn sinh trưởng luỹ thừa trì sinh trưởng ổn định chúng giai đoạn Sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục (dụng cụ Chemostat): Mục đích: - Sản phâm thu pha log có q trình trao đổi chất cao, khả sinh tổng hợp cao, có số lượng tế bào lớn nên tích luỹ sản phẩm sinh học cao - Không thời gian thay môi trường 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 91 - Phòng bệnh: sử dụng biện pháp loại trừ VSV để giảm nguy gây nhiễm làm khả gây bệnh VSV - Trong trị bệnh: phải ý chữa trị kịp thời, sớm tốt bệnh phát, vi trùng pha lag chuyển sang pha log số lượng tế bào có độc tính chưa cao đặc biệt tế bào nhạy cảm với nhân tố ngoại cảnh (các thuốc điều trị) bệnh dễ khỏi thời gian khỏi bệnh nhanh TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 93 3.3.3 Đặc điểm sinh trưởng vsv môi trường a Môi trường đặc (rắn) Mơi trường có sử dụng chất làm đơng đặc môi trường: 1,5-2% thạch (agar) Một số loại môi trường chủ yếu: - Môi trường dinh dưỡng: + Môi trường đơn giản/MT sở peptone + agar; môi trường nước thịt peptone + Mơi trường phức tạp: có bổ sung chất dinh dưỡng cao thịt, cao nấm men, casein… + chất khoáng chất đặc hiệu - Môi trường chọn lọc: Dựa nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt tưu tiên sinh trưởng số VSV (ví dụ Mt chọn lọc VK sinh protease có bổ sung gelatin/casein…) - Mơi trường chẩn đốn/ phân biệt: Có thành phần hóa chất giúp phân biệt vsv mắt thường (Ví dụ: mơi trường 95 MacConkey phân biệt E coli Salmonella) TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 92 Đọc thêm: Quorum sensing Phòng trị bệnh 9/12/2017 Trong bảo quản giống VSV, nguyên vật liệu thức ăn - Trong bảo quản giống VSV: Phải đảm bảo giống có tỷ lệ chết thấp, đảm bảo hoạt tính sinh học đặc tính di truyền - Phương pháp tiến hành cụ thể là: Sau giống đạt tới sinh trưởng tốt pha log dùng biện pháp bảo quản để không cho chuyển sang giai đoạn sinh trưởng (pha ổn định tử vong), sử dụng biện pháp bảo quản lạnh, đông khô, bảo quản lớp dầu vô trùng… Các vk “nói chuyện” với cách truyền phân tử tín hiệu cho Hiện tượng tích tụ phân tử tín hiệu để TB liên lạc với số TB VK khác quần thể Quorum sensing Mục đích: hợp tác để thực tập tính bình thường giúp cho VK thích nghi nhanh chóng với ĐK mơi trường sống thay đổi (nguồn dinh dưỡng, cạnh tranh với vsv khác, chống lại tác nhân có hại, tăng cường độc lực trình gây bênh…) VSV sinh trưởng mơi trường đặc (rắn) hình thành khuẩn lạc Khuẩn lạc tập trung số lượng lớn tế bào nơi, hình thành từ tế bào ban đầu Sự sinh trưởng đánh giá thơng qua tiêu chí: - Số lượng khuẩn lạc (đếm phương pháp pha lỗng nồng độ) - Hình thái, kích thước khuẩn lạc - Rìa, bề mặt, trạng thái, kết cấu khuân lạc - Màu sắc khuẩn lạc; Mùi môi trường Hai dạng khuẩn lạc thường gặp: - Khuẩn lạc láng bóng (dạng S): thường có bề mặt cong lồi, rìa gọn mịn, mặt láng bóng, nhẵn - Khuẩn lạc nhám (dạng R): bề mặt nhám xù xì, rìa nhọn hay có góc cạnh Khuẩn lạc nhầy, khuân lạc con, khuẩn lạc mảng … 96 16 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 Một số loại môi trường rắn Một số dạng khuẩn lạc vsv Casein media: chọn lọc Protease/casease Thạch máu (blood agar) MT chọn lọc: Salmonella agar) Môi trường thạch ống 97 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê • Là mơi trường khơng bổ sung thêm chất đơng đặc (thạch) • Đánh giá sinh trưởng qua tiêu chí: - Đếm số lượng tế bào - Độ đục môi trường (so màu): đục hay dạng bông, dạng vẩn mây - Sự lắng hay kết tủa: dầy hay mỏng, xốp hay kết chặt, dạng hạt hay keo - Hình thành màng: màng trịn hay màng kín, bề mặt màng thơ hay mịn, dầy hay mỏng - Sinh khí - Màu, mùi mơi trường Bề mặt Rìa/ bờ viền TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 98 b Môi trường dịch thể (lỏng) Mô tả đặc điểm khuẩn lạc 9/12/2017 9/12/2017 99 9/12/2017 Đục lắng Môi trường Trypticase soy nuôi cấy Enterobacter TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 100 Đọc thêm: Môi trường bán rắn Mơi trường có từ 0,2-0,7% thạch Được sử dụng để quan sát khả di động vsv Phản ứng lên men đường Mycobacterium Phle: cặn, màng, không đục 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 101 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 102 17 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 c.Một số phương pháp xác định số lượng vsv Phương pháp pha loãng nồng độ: đếm số lượng khuẩn lạc thạch đĩa Phương pháp đếm trực tiếp kính hiển vi: - Mỗi TB VSV sống phát triển thành đơn vị khuẩn lạc (colony forming unit – CFU) Sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer Ứng dụng cho vsv có kích thước lớn nấm men, vi tảo, vk lam đếm nhanh Nên sử dụng kính hiển vi phản pha để tránh nhầm lẫn - Mẫu pha lỗng trước ni cấy mơi trường thạch đĩa rắn đếm số lượng khuẩn lạc đĩa tính số lượng vsv có 1g/1ml mẫu Nhược điểm: không phân biệt TB sống chết; độ xác khơng cao với mật độ 106/ml mức độ đục mà mắt thường phát Mức độ đục máy phát từ 107 – 108/ml - Phương pháp khơng xác mơi trường nuôi cấy bị tạp với số lượng nhỏ vk khác - Đặc biệt pha suy vong trình sinh trưởng, số lượng TB chết cao Kết cho mật độ TB cao không phân biệt TB sống TB chết TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 104 Phương pháp xác định số có xác xuất lớn MPN (Most probale number) Thao tác cấy gạt đổ đĩa 9/12/2017 - Độ xác cao - Là kỹ thuật nhằm ước lượng số vk lớn có mẫu 95% số lượng vk nằm khoảng xác định - Sử dụng vk không phát triển môi trường rắn - Thường sử dụng để kiểm tra vk coliform mẫu nước (Kiểm tra lên men đường lactose a lactic) - Pha loãng mẫu dãy ống/9 ống đếm số ống dương tính - Kết so sánh với bảng MPN: Đơn vị MPN/ml 106 Phương pháp màng lọc (membrane filtration) - Sử dụng số lượng vk mẫu nhỏ để phát với phương pháp khác: Kiểm tra coliform mẫu nước uống VK thị - Lấy tối thiểu 100ml mẫu nước lọc qua màng lọc vi khuẩn có đường kính lỗ lọc nhỏ vi khuẩn không qua được, nằm lại màng lọc - Màng lọc sau lọc đặt vào đĩa Petri có dung dịch nuôi cấy VK mọc màng lọc đếm số lượng khuẩn lạc 107 Màng nuôi MT lactose glucuronide agar Khuẩn lạc màu vàng màu xanh nước biển: coliform; Khuẩn lạc màu xanh cây: E.coli 108 18 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 Các phương pháp xác định gián tiếp: Ôn tập chương Xác định sinh khối - VSV nuôi cấy MT dịch thể/lỏng lọc/ly tâm loại bỏ dung dịch cân toàn phần cặn (xác TB) Nhu cầu dinh dưỡng VSV: Vai trò C, N, H2O, khống - Phương pháp khơng phân biệt TB chết TB sống Cơ chế hấp thu chất dinh dưỡng VSV Xác định sản phẩm TĐC: - Hơ hấp hiếu khí, hơ hấp yếm khí, lên men Các kiểu dinh dưỡng VSV Trao đổi chất VSV: - Trong trình sinh trưởng, vsv tiến hành trình TĐC sản phẩm q trình hơ hấp, lên men: axit lactic, rượu, axit hữu cơ, CO2 … Định lượng sản phẩm - Quá trình phân giải hợp chất hữu Quy luật sinh trưởng VK Đặc điểm sinh trưởng VSV môi trường nuôi cấy Phương pháp đếm khuẩn lạc thạch đĩa (pha loãng nồng độ) Tốn 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 109 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 111 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 110 19 .. .Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 Nguồn C vi sinh vật sử dụng 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê Nguồn N vi sinh vật sử dụng TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 9/12/2017 Các nguyên tố vi lượng Muối vô chức sinh. .. "đồng vận-symport", chất ngược chiều gọi "đối vận -antiport" hay "đổi chỗ" 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 29 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 30 Vi sinh vật đại cương... thể 77 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 9/12/2017 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê 78 13 Vi sinh vật đại cương 9/12/2017 a Cơ sở lý thuyết sinh trưởng 3. 3.1 Lý thuyết sinh trưởng vi khuẩn Có thể biểu thị tăng số
