Khảo sát hoạt chất sinh học và khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết vỏ trái lựu (Punica granatum)

Mục tiêu của nghiên cứu là khảo sát một số hợp chất có hoạt tính sinh và có khả năng kháng oxy hoá. Cao chiết vỏ trái lựu được chiết xuất theo phương pháp ngâm dầm với các dung môi (nước, ethanol và acetone) và kết hợp với sóng siêu âm.

BIOACTIVE COMPOUNDS AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES FROM POMEGRANTE PEEL EXTRACT (Punica granatum) Nguyen Pham Tuan1*, Bang Hong Lam2, Nguyen Pham Tu1, and Nguyen Thi Bao Tran An Giang Biotechnology center, Chau Thanh district, An Giang province An Giang University, Viet Nam Nation University, Ho Chi Minh City *Corresponding author: ngphamtuan1983@gmail.com Tel +84.988202055 Abstarct The study was conducted to analyze some of the bioactive compounds and the antioxidant capacity Pomegranate peel extract was extracted by combining the immersion method use different solvents (water, ethanol 800 and acetone) and ultrasound Oxidation resistance was tested by DPPH method and the content of phenolic, flavonoid, polysaccharide, tannin were determined by the spectrophotometer method The results showed that the moisture content was 68.89% and extraction efficiency of pomegranate peel ranged from 6.72% to 10.24% The extract of pomegranate peel contained biological compounds such as alkaloids, saponin, flavonoids, steroids, tannins and phenols The phenolic, flavonoid, polysaccharide and tannin content of pomegranate peel per g of dry weight were 300.33 mg gallic acid/g; 73.72 mg quercetin/g; 77.18 mg GE/g and 115.78 mg tannic acid/g, respectively Pomegranate peel has antioxidant ability by DPPH method with IC50 value of water, ethanol 800 and acetone 98,95 µg/mg; 69.03 µg/mg; 79.92 µg/mg, respectively The results indicated that pomegranate peel contains many anti-oxidative bioactive ingredients, which were potential materials for further research and applications Keywords: Punica granatum, flavonoid,antioxidant, polyphenol, polysaccharide 241 KHẢO SÁT HOẠT CHẤT SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT VỎ TRÁI LỰU (Punica granatum) Nguyễn Phạm Tuấn1*, Bằng Hồng Lam2, Nguyễn Phạm Tú1 Nguyễn Thị Bảo Trân Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang, huyện Châu Thành, tỉnh An Giang Trường Đại học An Giang, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: ngphamtuan1983@gmail.com Số điện thoại: 0988.202055 Tóm tắt Mục tiêu nghiên cứu khảo sát số hợp chất có hoạt tính sinh có khả kháng oxy hố Cao chiết vỏ trái lựu chiết xuất theo phương pháp ngâm dầm với dung môi (nước, ethanol acetone) kết hợp với sóng siêu âm Khả kháng oxy hóa xác định phương pháp DPPH hàm lượng phenolic, flavonoid, polysaccharide tannin xác định phương pháp quang phổ Kết cho thấy, độ ẩm vỏ trái lựu đạt 68,89% hiệu suất trích cao vỏ trái lựu khoảng 6,72-10,24% Cao chiết vỏ trái lựu có diện hợp chất sinh học alkaloid, flavonoid, steroid, saponin, tannin phenol Hàm lượng phenolic, flavonoid, polysaccharide tannin cao chiết vỏ trái lựu 300,33 mg gallic acid/g; 73,72 mg quercetin/g cao; 77,18 mg GE/g cao 115,78 mg tannic acid/g cao Cao chiết vỏ trái lựu có khả kháng oxy hóa thử nghiệm phương pháp DPPH với giá trị IC50 cao chiết dung môi nước, ethanol 800, acteone 98,95 µg/mg; 69,03 µg/mg; 79,92 µg/mg Kết nghiên cứu cho thấy, vỏ trái lựu chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học có khả kháng oxy hóa nguồn nguyên liệu tiềm cho nghiên cứu ứng dụng Từ khóa: lựu, flavonoid, kháng oxy hóa, polyphenol, polysaccharide 242 Giới thiệu Cây lựu (Punica granatum) coi thuốc ăn biết đến loại trái quan trọng công nhận tồn cầu hương vị dễ chịu lợi ích sức khỏe tuyệt vời có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học (Karimi et al., 2017) Trái lựu sử dụng ăn tươi, làm nước uống sản phẩm khác tùy theo nhu cầu người Lợi ích sức khỏe lựu không giới hạn phần thịt quả, mà cịn phần khơng ăn (chủ yếu vỏ) có chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học phần ăn (Abid et al., 2017) Vỏ trái lựu chiếm gần 30-40% khối lượng phần lựu sản phẩm phụ sau chiết xuất nước ép (Çam et al., 2014) Theo Khan et al., 2018, vỏ lựu chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học phenolic, flavonoid, tanin,… Các hợp chất nghiên cứu ứng dụng để điều trị bệnh thuốc chống viêm, trị đái tháo đường, chống dị ứng kháng tiểu cầu Hiện nay, vỏ trái lựu nguồn phụ phẩm lớn tận dụng Do đó, việc ứng dụng vỏ trái lựu ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm mỹ phẩm mang lại lợi ích kinh tế đáng kể Với tiềm nêu, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát hoạt chất sinh học đánh giá khả kháng oxy hoá vỏ trái lựu (Punica granatum) nhằm đánh giá hợp chất sinh học tiềm vỏ trái lựu khả kháng oxy hóa; góp phần giảm thải nhiễm mơi trường gia tăng giá trị nguồn phụ phẩm Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên vật liệu Nguyên liệu Lựu thu từ chợ đầu mối huyện Châu Thành, tỉnh An Giang xác định hình thái dựa theo Đỗ Tất Lợi (2014) Hóa chất thiết bị gồm máy đo quang phổ (Human, Hàn Quốc), máy đông khô chân không (Christ, Đức), máy ly tâm (Orto alresa, Tây Ban Nha), máy cô quay chân không (Eyala, Nhật Bản), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, tannic acid, quercetin, glucose, gallic acid, FolinCiocalteu (Merck, Mỹ),… hóa chất thiết bị cần thiết khác 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp tạo cao chiết từ vỏ trái lựu Trái lựu thu từ chợ đầu mối huyện Châu Thành, tỉnh An Giang tiến hành loại bỏ phần thịt quả, thu phần vỏ đông khô phần vỏ trái lựu máy đông khô 96 nghiền thành bột mịn Bột vỏ trái lựu (200 g) ngâm dầm với dung môi khác (nước, ethanol 80% acetone) với tỷ lệ nguyên liệu dung môi 1:10 (w/v) Mẫu tiến hành ngâm dầm (72h) điều kiện nhiệt độ phòng, tối kết hợp sóng siêu âm 12h, Sau đó, hỗn hợp tiến hành ly tâm 5.000 vòng/phút 20 phút, loại bỏ phần cặn thu phần dịch Phần dịch lọc lọc qua giấy lọc Whatman có đường kính 0,45µm, thu dịch lọc bỏ phần cắn Phần dịch lọc sau tiến hành quay chân không để đuổi dung môi Dịch lọc sau cô quay đuổi dung môi tiến hành đông khô máy đông khô để thu cao chiết vỏ trái lựu Cao chiết vỏ trái lựu sau đông khô bảo quản điều kiện nhiệt độ 200C thực nghiên cứu 243 2.2.2 Định tính số hợp chất sinh học có cao chiết vỏ trái lựu Thành phần hóa học cao chiết vỏ trái lựu gồm: alkaloid, flavonoid, glycoside, tannin, steroid, saponin, polyphenol định tính sơ phương pháp định tính nhóm hợp chất thiên nhiên theo mơ tả Yadav et al (2014) Bảng Định tính hợp chất sinh học có cao chiết vỏ trái lựu Hiện tƣợng Hợp chất Thực nghiệm Alkaloid (Mayer) 1mL dịch trích + vài giọt TT Mayer Kết tủa màu nâu Flavonoid 1mL dịch trích + 2mL Pb(OAc)4 Xuất 10% vàng Saponin (Foam) 3mL dịch trích + 6mL H2O→ đun Xuất bọt nóng Steroid (Salkowski) 1mL dịch trích + 2mL CHCl3 + Xuất vòng đỏ 2mL H2SO4đậm đặc nâu lớp Tannin polyphenol (Braymer) Terpenoid 0,5mL dịch trích + 10mL H2O + 2-3 Kết tủa giọt FeCl3 0,1% dương đen màu xanh 2mL dịch trích + 2mL (CH3CO)2O Xuất màu đỏ + 2-3 giọt H2SO4đậm đặc đậm 2.2.3 Định lƣợng flavonoid cao chiết vỏ trái lựu Hàm lượng flavonoid tổng tiến hành theo mô tả Pieme et al (2014): lấy 10 mg quercetin hòa tan mL ethanol 80% sau pha lỗng nồng độ 25, 50, 100, 200 400 µg/mL Hút 0,1 mL quercetin, thêm vào 0,3 mL nước cất, 0,03 mL NaNO2 5% Ủ phút 250C, thêm 0,03 mL AlCl3 10% Ủ thêm phút, sau cho thêm 0,2 mL NaOH mM Thêm nước cất để tổng thể tích mL Đo bước sóng 510 nm Tiến hành tương tự với cao chiết vỏ trái lựu Hàm lượng flavonoid tổng xác định theo công thức: C = c * V/m Trong đó: C: hàm lượng flavonoid tổng (mg quercetin/g chiết xuất) c: giá trị x từ đường chuẩn với quercetin (mg/mL); V: thể tích dịch chiết (mL); m: khối lượng cao chiết có V (g) 2.2.4 Định lƣợng phenolic cao chiết vỏ trái lựu Hàm lượng phenolic tổng xác định theo mô tả Yadav Agarwala (2011): chuẩn bị dung dịch gallic acid nồng độ 20, 40, 60, 80 100 µg/mL; thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% pha loãng với nước Lần lượt cho mL dung dịch gallic acid (nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 120 µg/mL) vào 2,5 mL thuốc thử FolinCiocalteu 10% để phản ứng phút; sau đó, thêm tiếp vào mL dung dịch Na2CO3 2% Sau 45 phút phản ứng nhiệt độ phòng, độ hấp thụ xác định máy đo quang phổ bước sóng 765 nm Tương tự mẫu cao chiết vỏ trái lựu thực tương tự 244 Hàm lượng phenolic tổng tính theo cơng thức: P = a × V/m Trong đó: P: hàm lượng phenolic tổng (mg gallic acid/g cao chiết) a: giá trị x từ đường chuẩn với gallic acid (g/mL) V: thể tích dung dịch cao chiết (mL); m: khối lượng cao chiết có thể tích V (g) 2.2.5 Định lƣợng polysaccharide cao chiết vỏ trái lựu Hàm lượng polysachcharide cao chiết vỏ trái lựu xác định dựa theo Dubois et al (1958) Sử dụng glucose làm chất chuẩn đối chiếu glucose chuẩn pha với nồng độ gốc mg/mL Tiến hành pha loãng thành nồng độ 0; 0,2; 0,4; 0,6 0,8 mg/mL Phản ứng tiến hành cách cho mL dung dịch glucose thêm mL dung phenol 5% Sau đó, thêm vào hỗn hợp mL dung dịch H2SO4 đậm đặc để phản ứng 10 phút tiến hành đo độ hấp thu bước sóng λ = 490 nm Tiến hành tương tự mẫu thí nghiệm cao chiết vỏ trái lựu Hàm lượng polysaccharide tính tốn dựa đường chuẩn glucose 2.2.6 Định lƣợng tannin cao chiết vỏ trái lựu Hàm lượng tannin cao chiết xác định dựa theo phương pháp Kavitha Indira (2016) có hiệu chỉnh Sử dụng tannic acid làm chất chuẩn đối chiếu (0; 20; 40; 60; 80 100 µg/mL) Phản ứng tiến hành cách cho 0,1 mL dung dịch tannic acid bổ sung thêm 7,5 mL nước cất 0,5 mL thuốc thử FolinCiocalteu, thêm mL dung dịch Na2CO3 35% bổ sung thêm nước cất đủ 10 mL, để phản ứng nhiệt độ phòng 30 phút Tiến hành đo độ hấp thu bước sóng λ = 700 nm Hàm lượng tannin tính theo cơng thức: P = a × V/m Trong đó: P: hàm lượng phenolic tổng (mg tannic acid acid/g cao chiết) a: giá trị x từ đường chuẩn với tannic acid (g/mL) V: thể tích dung dịch cao chiết (mL); m: khối lượng cao chiết có thể tích V (g) 2.2.7 Khảo sát khả kháng oxy hóa cao chiết vỏ trái lựu Phương pháp khảo sát khả ức chế gốc tự DPPH cao chiết vỏ trái lựu thực theo phương pháp Shekhar Anju (2014) hiệu chỉnh sau: mL cao chiết nồng độ khác phản ứng với mL dung dịch DPPH 0,1 mM Hỗn hợp phản ứng điều kiện nhiệt độ phòng 30 phút điều kiện tối để tránh tượng oxy hố Sau đó, hỗn hợp đo độ hấp thụ quang phổ bước sóng λ = 517 nm Khả ức chế gốc tự DPPH cao chiết hạt nhãn xác định theo công thức sau: AA% =(A0-A1/A0) x 100 Trong đó: AA%: Phần trăm ức chế gốc tự DPPH A0: Độ hấp thụ quang phổ mẫu đối chứng A1: Độ hấp thụ quang phổ mẫu cao chiết Vitamin C chất chuẩn thực tương tự mẫu cao chiết IC50 giá trị dùng để đánh giá khả ức chế mạnh yếu mẫu khảo sát IC50 nồng độ (mg/ml) mẫu, mà ức chế 50% gốc tự do, tế bào enzyme Mẫu có hoạt tính cao giá trị IC50 thấp Để xác định IC50 chúng tôitiến hành khảo sát hoạt tính mẫu nhiều nồng độ khác 245 Với mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, vẽ đường thẳng y = ax + b qua tất điểm (với y % ức chế x nồng độ); Với mẫu có hoạt tính khơng biến thiên tuyến tính với nồng độ, cách gần đúng, chọn hai nồng độ ức chế 50% tiến hành vẽ đường thẳng y = ax + b  thu phương trình y = ax + b với hệ số a, b biết Từ phương trình y = ax + b biết, thay y = 50% vào phương trình thu giá trị x, nồng độ ức chế 50% gốc tự (IC50) 2.3 Phƣơng pháp thống kê Số liệu sứ lý phần mềm Excel thống kê phần mềm Statgraphics plus 16.0 Kiểm tra khác biệt trung bình theo phép thử LSD Duncan Kết thảo luận 3.1 Độ ẩm vỏ trái lựu Việc xác định độ ẩm mẫu vỏ trước tiến hành ly trích giúp biết điều kiện để xác định phương pháp ly trích phù hợp, nhằm thu lượng cao chiết tối ưu Ngoài ra, việc xác định độ ẩm nguyên liệu tạo điều kiện để xác định nhiệt độ thời gian sấy mẫu thích hợp để tiến hành ly trích có hiệu suất cao (Viện Dược liệu, 2008) Theo Dương Thị Phượng Liên Nguyễn Nhật Minh Phương (2014), suốt trình sấy mẫu, nhiệt độ cao làm phá vỡ cấu trúc tế bào bên nguyên liệu, tạo điều kiện cho dung môi nguyên liệu tiếp xúc tốt hơn, tăng khả ly trích Bên cạnh đó, q trình sấy cịn có tác dụng làm giảm độ ẩm nguyên liệu giúp tăng tỷ lệ dung môi sử dụng với nguyên liệu Độ ẩm hàm lượng nước tự có mẫu, độ ẩm cao tương ứng với hàm lượng nước có mẫu nhiều Để đánh giá hiệu phương pháp trích cao, người ta thường dựa hiệu suất trích cao Hiệu suất trích cao phản ánh tối ưu việc kết hợp điều kiện khác phương pháp ly trích Quy trình trích cao thực với vỏ trái lựu 3.000 gram (tươi), độ ẩm vỏ trái lựu 71,82% vỏ trái lựu chiết xuất với dung môi khác 300 gram (khô) (Bảng 2) Kết nghiên cứu cho thấy, hiệu suất trích cao có khác biệt dung mơi chiết, hiệu suất chiết cao dung môi nước đạt hiệu suất 10,24%; dung môi ethanol 80% đạt hiệu suất 7,02% dung môi acetone đạt hiệu suất 6,72% Hiệu suất chiết dung mơi có khác biệt phụ thuộc vào dung môi Các dung môi khác sử dụng để chiết xuất hợp chất khác tùy thuộc vào độ phân cực dung môi (Boeing et al., 2014) Dựa thang phân cực, nước có độ phân cực cao nên cho hiệu suất chiết cao cao Trong nghiên cứu dung môi phân cực nhiều cho hiệu suất trích cao (Farahziela et al., 2017) 246 Bảng Độ ẩm, hiệu suất cao chiết vỏ trái Lựu từ loại dung môi khác Chỉ tiêu theo dõi Cao chiết nƣớc Cao chiết ethanol Cao chiết acetone Khối lượng mẫu tươi (g) 3.000 3.000 3.000 Độ ẩm (%) 68,89 68,89 68,89 Khối lượng mẫu khô (g) 300 300 300 Khối lượng cao khô (g) 30,73 21,07 20,16 Hiệu suất chiết (%) 10,24 7,02 6,72 3.2 Định tính số hợp chất sinh học có cao chiết vỏ trái lựu Cao chiết vỏ trái lựu từ dung mơi khác điều có diện hợp chất alkaloid, terpenoids, , flavonoid, steroid, tanin polyphenol (Bảng 3) Kết tương tự nghiên cứu Jayaprakash Sangeetha (2015) cho rằng, dịch trích vỏ trái lựu có diện hợp chất saponin, flavonoid, alkaloid, terpenoid, steroid, tanin polyphenol Kết phân tích định tính phương pháp hóa học cho thấy, cao chiết vỏ trái lựu nguồn nguyên liệu tiềm có chứa hợp chất có hoạt tính sinh học Bảng Định tính số hợp chất có hoạt tính sinh học cao chiết vỏ trái lựu Cao chiết nƣớc Cao chiết acetone Cao chiết ethanol Saponin (+) (-) (+) Flavonoid (+) (+) (+) Terpenoids (+) (+) (+) Alkaloid (+) (+) (+) Tanin polyphenol (+) (+) (+) Steroid (+) (+) (+) Chỉ tiêu theo dõi Ghi chú: „+‟: dương tính „-„: âm tính 3.3 Hàm lƣợng phenolic cao chiết vỏ trái lựu Những hợp chất phenolic nhóm lớn, chúng có tác dụng ngăn ngừa ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng oxy hóa, bảo vệ tim mạch đồng thời giúp tiêu thụ tốt thức ăn (Han et al., 2007) Hàm lượng phenolic tổng phân tích phương pháp quang phổ đường chuẩn y = 0,0049x + 0,0127 với hệ số R2 = 0,9985 (Hình 2a) Hàm lượng phenolic tổng có khác biệt loại dung mơi trích ly tạo cao chiết vỏ trái lựu (Bảng 4) Hàm lượng phenolic thấp cao chiết vỏ trái lựu nước 210,91 mg gallic acid/g cao chiết; hàm lượng phenolic vỏ trái lựu acetone đạt 257,81 mg gallic acid/g cao chiết Cao hàm lượng phenolic vỏ trái lựu ethanol đạt 300,33 mg gallic acid/g cao chiết 247 y = 0,0054x + 0,0185 R² = 0,9992 0,6 (a) (b) 0,8 Độ hấp thu 0,5 Độ hấp thu 0,4 0,3 y = 1,0415x + 0,0068 R² = 0,989 0,6 0,4 0,2 0,2 0,1 0 20 40 60 80 100 0,2 Quercetin (µg/mL) 0,4 Glucose (g/mL) 0,6 0,8 Hình Đƣờng chuẩn quercetin (a) đƣờng chuẩn glucose (b) 0,6 0,5 0,6 (a) (b) Độ hấp thu Độ hấp thu y = 0,0128x + 0,0122 R² = 0,9899 0,7 y = 0,0049x + 0,0127 R² = 0,9985 0,4 0,3 0,2 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,1 0 20 40 60 80 100 Gallic acid (µg/mL) 10 20 30 Tannic acid (µg/mL) 40 50 Hình Đƣờng chuẩn gallic acid (a) đƣờng chuẩn tannin acid (b) So sánh với kết nghiên cứu khác, Derakhshan et al (2018) cho thấy, hàm lượng phenolic cao chiết 09 loại vỏ trái lựu Iran, có hàm lượng phenolic dao động khoảng 12,4-413 mg/ gallic acid/g cao chiết trích ly với dung mơi ethanol 80% Trong đó, nghiên cứu Mashkor (2014) cho thấy, hàm lượng phenolic cao chiết vỏ trái lựu đạt hàm lượng phenolic khoảng 84,15-168,26 mg gallic acid/g tiến hành trích ly với dung môi khác methanol, ethanol, acetone nước Hơn nghiên cứu Shahindokht Doostkam (2019) cho rằng, hàm lượng phenolic cao chiết vỏ trái lựu khoảng 59,73-189,1 mg gallic acid/g tiến hành trích ly vỏ trái lựu từ loại dung môi khác nguồn nguyên liệu địa phương khác Nguyên nhân khác biệt hàm lượng phenolic so với nghiên cứu trước khác nguồn gốc trồng, phương pháp trích ly có hỗ trợ sóng siêu âm dung mơi sử dụng tiến hành ly trích có khả hịa tan hợp chất chống oxy hóa dung mơi có ảnh hưởng đáng kể đến việc thu hồi hợp chất thời điểm chiết xuất Do đó, độ phân cực dung mơi có ảnh hưởng gián tiếp q trình chiết xuất làm tăng khả hịa tan hợp chất kháng oxy hóa 248 3.4 Hàm lƣợng flavonoid cao chiết vỏ trái lựu Flavonoid tổng cao chiết vỏ trái lựu từ dung môi khác cho hàm lượng khác (Bảng 4) Hàm lượng flavonoid tổng phân tích phương pháp quang phổ đường chuẩn y = 0,0054x + 0,0185 với hệ số R2 = 0,9992 (Hình 1a) Cụ thể, hàm lượng flavonoid tổng cao cao chiết vỏ trái lựu ethanol (73,72 mg quercetin/g cao chiết); cao chiết vỏ trái lựu acetone (58,63 mg quercetin/g cao chiết) thấp cao chiết vỏ trái lựu nước (40,75 mg quercetin/g cao chiết) Kết nghiên cứu cho thấy hàm lượng flavonoid tổng cao chiết (73,72 mg quercetin/g cao chiết) thấp nghiên cứu Shahindokht Doostkam (2019) cho rằng, hàm lượng flavonoid cao chiết vỏ trái lựu đạt hàm lượng flavonoid khoảng 18,61-126,0 mg quercetin/g cao chiết tiến hành trích ly vỏ trái lựu từ loại dung môi khác nguồn nguyên liệu địa phương khác Hơn nữa, nghiên cứu Mashkor (2014), cho thấy, hàm lượng flavonoid cao chiết vỏ trái lựu đạt hàm lượng flavonoid khoảng 42,40-87,21 mg quercetin/g cao chiết tiến hành trích ly với dung môi khác methanol, ethanol, acetone nước Sự khác hàm lượng flavonoid cao chiết vỏ trái lựu (i) phương pháp trích cao giống cho kết khác khác biệt yếu tố giai đoạn sinh trưởng thời gian lấy mẫu thí nghiệm (Weecharangsan et al., 2006); (ii) hợp chất có hoạt tính sinh học thực vật bậc cao vị trí khác có hàm lượng, thành phần khác Điều giải thích cao chiết từ phận vỏ, thân cho kết phân tích hàm lượng hoạt chất sinh học khác (Tachakittirungrod et al., 2007); (iii) thành phần hóa học cao chiết khác cho kết hàm lượng hoạt chất sinh học khác (Mayachiew Devahastin, 2008) Bảng Kết phân tích hàm lƣợng flavonoid, polyphenol, tannin polysaccharide cao chiết vỏ trái lựu Mẫu cao chiết Hoạt chất Hàm lượng phenolic (mg gallic acid/g cao chiết) Hàm lượng flavonoid (mg quercetin/g cao chiết) Hàm lượng polysaccharide (mg GE/g cao chiết) Hàm lượng tannin (mg tannic acid/g cao chiết) Cao chiết nước Cao chiết ethanol Cao chiết acetone 210,91c±0,08 300,33b±0,13 57,81a±0,07 40,75c±0,04 73,72b±0,12 58,63a±0,03 35,77b±0,08 77,18ab±0,13 49,79a±0,21 69,75c±0,18 115,78b±0,11 89,45a±0,05 Ghi chú: số liệu cột có chữ theo sau giống khơng khác biệt thống kê mức ý nghĩa 5% 249 3.5 Hàm lƣợng polysaccharide cao chiết vỏ trái lựu Hàm lượng polysaccharide tổng phân tích phương pháp quang phổ đường chuẩn y = 1,0415x + 0,0068 với hệ số R2 = 0,989 (Hình 1b) Cụ thể, hàm lượng polysaccharide tổng cao vỏ trái lựu ethanol (77,18 mg GE/g cao chiết); cao chiết vỏ trái lựu acetone (49,79 mg GE/g cao chiết) thấp cao chiết vỏ trái lựu nước (35,77 mg GE/g cao chiết) Hàm lượng polysaccharide tổng cao chiết vỏ trái lựu từ dung mơi khác khác (Bảng 4) Hàm lượng polysaccharide tổng từ cao chiết vỏ trái lựu cao so sánh với nhóm nghiên cứu trước đây, Yun et al (2018) cho rằng, hiệu suất chiết xuất polysaccharide đạt cao 22,31% tiến hành trích ly polysaccharide từ vỏ trái lựu điều kiện có hỗ trợ enzyme q trình chiết xuất Hơn nữa, nghiên cứu Caiping et al (2015) cho rằng, hiệu suất chiết xuất polysaccharide đạt cao 13,66% tiến hành trích ly polysaccharide từ vỏ trái lựu điều kiện có hỗ trợ sóng siêu âm q trình chiết xuất Đồng thời, nghên cứu Caiping Liu (2013), cho hiệu suất chiết xuất polysaccharide đạt cao 10,42% tiến hành trích ly polysaccharide từ vỏ trái lựu điều kiện thời gian trích 1,9 giờ; nhiệt độ trích ly 98oC; tỷ lệ dung mơi nước nguyên liệu (1: 37, v/w) 3.6 Hàm lƣợng tannin cao chiết vỏ trái lựu Hàm lượng tannin tổng phân tích phương pháp quang phổ đường chuẩn y = 0,0128x + 0,0122 với hệ số R2 = 0,9899 (Hình 2b) Theo Amarowicz (2007), tannin khơng chất kháng oxy hoá sơ cấp cách cho nguyên tử hydro hay electron, mà tannin hoạt động chất oxy hoá thứ cấp với khả chelate hoá ion kim loại Fe (II) làm chậm oxy hoá cách can thiệp vào phản ứng Fenton Ngoài ra, tannin ngăn cản oxy hố chất béo thơng qua ức chế cyclooxygenase Hàm lượng tannin tổng có khác biệt loại dung mơi tiến hành trích ly vỏ trái lựu (Bảng4) Thông qua bảng 4, hàm lượng tannin cao chiết vỏ trái lựu đạt thấp cao nước với… tiếp đến cao acetone đạt … nhiều cao ethanol đạt… So sánh với kết nghiên cứu trước đây, Abderrezak Chibane (2019) cho rằng, tổng hàm lượng tannin cao chiết vỏ trái lựu dao động khoảng 549,14-798,76 mg tannic acid/g cao khơ tiến hành trích ly vỏ trí lựu loại dung môi khác ethanol 96%, methanol, acetone, nước and hỗn hợp nước: methanol (50:50, v/v) Hơn nữa, nghiên cứu Hadjadj et al (2018) cho rằng, hàm lượng tannin đạt cao 47,78 mg CE/g cao chiết tiến hành trích ly vỏ trái lựu dung môi ethanol Sự khác hàm lượng tannin cao chiết vỏ trái lựu nghiên cứu khác biệt giống trồng, mùa thời kỳ thu hoạch, điều kiện khí hậu nơng nghiệp, phương pháp thời gian khai thác dung môi chiết xuất (Borochov et al., 2009) 3.7 Khả kháng oxy hóa cao chiết vỏ trái lựu DPPH gốc tự có chứa ngun tử nitrogen bền trung tâm, nhận electron hay gốc hydrogen để hình thành phân tử nghịch từ bền Hợp chất có hoạt động kháng oxy hố mạnh khả cho hydrogen cao Gốc DPPH 250 phản ứng với chất khử phù hợp nhận electron, từ màu dung dịch DPPH bị dần từ tím sang vàng phụ thuộc vào số electron nhận (Patel Natvar, 2011) Vitamin C sử dụng chất chuẩn vitamin C chất kháng oxy hóa mạnh, có khả loại bỏ gốc tự cao Hiệu khử gốc tự vitamin C thực nồng độ khác (0-0,1 µg/mL) Phần trăm khử gốc tự vitamin C đạt cao nồng độ 100 µg/mL, đạt hiệu 85,27% Kế đến nồng độ 80 µg/mL với hiệu suất 71,15% thấp nồng độ 20 µg/mL, phần trăm khử gốc tự 23,28% (Hình 1a) Tiến hành vẽ đường biểu diễn thể phần trăm ức chế gốc tự do, phương trình đường chuẩn y = 0,8383x + 3,2718; từ suy giá trị IC50 vitamin C 55,73 µg/mL Hiệu khử gốc tự cao chiết nước vỏ trái lựu thực nồng độ khác (0-100 µg/mL) Phần trăm khử gốc tự cao chiết nước đạt cao nồng độ 100 µg/mL với hiệu 57,75% Kế đến nồng độ 80 µg/mL với hiệu suất 47,72% thấp nồng độ 20 µg/mL với phần trăm khử gốc tự 8,11% (Hình 1b) Tiến hành vẽ đường biểu diễn phần trăm ức chế gốc tự phương trình đường chuẩn y = ,4707x + 3,4246 có R2 = 0,9885; từ đó, suy giá trị IC50 cao chiết nước vỏ trái lựu 98,95 µg/mL 80 100 (b) y = 0,8383x + 3,2781 R² = 0,9948 80 Phần trăm ức chế (%) Phần trăm ức chế (%) (a) 60 40 20 y = 0,4707x + 3,4246 R² = 0,9885 60 40 20 0 20 40 60 80 Nồng độ Vitamin C (µg/mL) 100 20 40 60 80 Nồng độ cao chiết (µg/mL) 100 120 Hình Hiệu khử gốc tự Vitamin C (a) cao chiết vỏ trái lựu dung môi nƣớc (b) Tương tự, hiệu khử gốc tự cao chiết ethanol vỏ trái lựu thực nồng độ khác (0-100 µg/mL) Phần trăm khử gốc tự cao chiết ethanol đạt cao nồng độ 100 µg/mL (60,11 %) Kế đến nồng độ 80 µg/mL với hiệu suất 40,78% thấp nồng độ 20 µg/mL với phần trăm khử gốc tự 15,11% (Hình 2a) Tiến hành vẽ đường biểu diễn thể phần trăm ức chế gốc tự phương trình đường chuẩn y = 0,6401x + 5,8114và có R2 = 0,9836; suy giá trị IC50 cao chiết ethanol vỏ trái lựu 69,03 µg/mL 251 100 100 y = 0,6058x + 1,5861 R² = 0,9924 80 (b) Phần trăm ức chế (%) Phần trăm ức chế (%) (a) 60 40 20 y = 0,6401x + 5,8114 R² = 0,9836 80 60 40 20 0 20 40 60 80 Nồng độ cao chiết (µg/mL) 100 120 20 40 60 80 Nồng độ cao chiết (µg/mL) 100 120 Hình Hiệu khử gốc tự cao chiết vỏ trái lựu dung môi ethanol 80o (a) acetone (b) Hiệu khử gốc tự cao chiết acetone vỏ trái lựu thực nồng độ khác (0-100 µg/mL) Phần trăm khử gốc tự cao chiết acetone đạt cao nồng độ 100 µg/mLvới hiệu 77,09% Kế đến nồng độ 80 µg/mL với hiệu suất 59,99% thấp nồng độ 20 µg/mL với phần trăm khử gốc tự 17,05% (Hình 2b) Tiến hành vẽ đường biểu diễn thể phần trăm ức chế gốc tự phương trình đường chuẩn Y = 0,6058x + 1,5861 có R2 = 0,9924; suy giá trị IC50 cao chiết acetone vỏ trái lựu 79,92 µg/mL Bảng Phƣơng trình đƣờng chuẩn, giá trị R2 IC50 loại cao chiết vỏ trái lựu vitamin C Phương trình đường chuẩn, hệ số R2 Giá trị IC50 (µg/ mL) Cao chiết nước Y = 0,4707x+3,4246; R2 = 0,9885 98,95 Cao chiết acetone Y = 0,6058x+1,5861; R2 = 0,9924 79,92 Cao chiết ethanol Y = 0,6401x+5,8114; R2 = 0,9836 69,03 Mẫu Vitamin C Y = 0,8383x+3,2718; R = 0,9948 55,73 Giá trị IC50 giá trị mà ức chế 50% gốc tự DPPH Giá trị IC50 cao chiết vỏ trái lựu vitamin C xác định trình bày Bảng Thông qua giá trị IC50 cho thấy lực khử cao chiết vỏ trái lựu ethanol 80o cao vitamin C 1,24 lần; lực khử cao chiết vỏ trái lựu acetone cao vitamin C 1,43 lần; Năng lực khử cao chiết vỏ trái lựu nước cao vitamin C 1,78 lần Điều lý giải Vitamin C sản phẩm thương mại có độ tinh cao, cao chiết vỏ trái lựu qua q trình lọc ly trích chứa nhiều tạp chất nên hiệu thấp Kết nghiên cứu khả kang1 oxy hóa cao chiết vỏ trái lựu cao nghiên cứu Hadjadj et al (2018) cho rằng, cao chiết vỏ trái lựu có khả kháng oxy hóa phương pháp DPPH với giá trị EC50 đạt 4,64 µg/mL tiến hành trích ly vỏ trái lựu ethanol 70% Hơn nữa, nghiên cứu Abderrezak Chibane (2019) cho rằng, cao chiết vỏ trái lựu có khả kháng oxy hóa phương pháp DPPH với giá trị IC50 đạt 76,75 µg/mL; 85,37 µg/mL; 160,01 µg/mL 183,71 µg/mL 252 tiến hành trích ly vỏ trái lựu dung môi khác ethanol; hỗn hợp methnol nước (50: 50, v/v); acetone nước Cao chiết vỏ trái lựu có khả kháng oxy hóa phương pháp DPPH cao chiết có chứa hợp chất có hoạt tính sinh học flavonoid, alkaloid, tannin phenol Các nhóm hợp chất phenolic flavonoid hợp chất oxy hóa mạnh hợp chất phenolic flavonoid có khả hấp thụ trung hòa gốc tự khử phản ứng oxy hóa (Nimse Pal, 2015) KẾT LUẬN Nghiên cứu cho thấy, dịch chiết cao vỏ trái lựu có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học có khả kháng oxy hố tốt Hàm lượng phenolic, flavonoid, polysaccharide tannin cao chiết vỏ trái lựu 300,33 mg gallic acid/g; 73,72 mg quercetin/g cao khô ; 77,18 mg GE/g cao khô 115,78 mg tannic acid/g cao khô sử dụng dung môi chiết xuất ethanol 80o Cao chiết vỏ trái lựu có khả kháng oxy hóa phương pháp DPPH với giá trị IC50 nước, ethanol, acetone 98,95 µg/mg; 69,03 µg/mg; 79,92 µg/mg Nghiên cứu trích ly tinh hoạt chất vỏ lựu nghiên cứu đánh giá khả kháng viêm, bảo vệ gan đái tháo đường mơ hình in vitro in vivo Lời cảm ơn Xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang Sở Khoa học Công nghệ An Giang tạo điều kiện hỗ trợ để thực nghiên cứu Tài liệu tham khảo Abderrezak, K, and Hayat A.C (2019) Comparison of five solvents in the extraction of phenolic antioxidants from pomegranate (Punica granatum L.) peel The North African Journal of Food and Nutrition Research 03 (05): 140-147 Abid, M., Yaich, H., Cheikhrouhou, S., Khemakhem, I., Bouaziz, M., Attia, H., and Ayadi, M A (2017) Antioxidant properties and phenolic profile characterization by LC–MS/MS of selected Tunisian pomegranate peels Journal of Food Science and Technology, 54 (9): 2890-2901 Amarowicz, R (2007) Tannins: the new natural antioxidants? European Journal of Lipid Science and Technology, 109 (6): 549-551 Boeing, JS., Érica, O.B., Beatriz, C.S., Paula, F.M., Vitor, C.A and Jesuí, V.V (2014) Evaluation of solvent effect on the extraction of phenolic compounds and antioxidant capacities from the berries: application of principal component analysis Chemistry Central Journal (1): 48 Borochov-Neori, H., Judeinstein, S Tripler, E., Harari, M., Greenberg, A., Shomer, I and Holland, D (2009) Seasonal and cultivar variations in antioxidant and sensory quality of pomegranate (Punica granatum L.) fruit Journal of Food Composition and Analysis 22 (3): 189-195 Caiping, Z and Xiaoli, L (2013) Optimization of extraction process of crude polysaccharides from Pomegranate peel by response surface methodology Carbohydrate Polymers, 92: 1197-1202 253 Caiping, Zhu, Xichuan, Z., Linqiang, L., Xiaoxia, W and Bing, Li (2015) Response surface optimization of ultrasound-assisted polysaccharides extraction from pomegranate peel Food Chemistry, 177: 139-146 ầam, M., ỗyer, N.C and Erdoğan, F (2014) Pomegranate peel phenolics: microencapsulation, storage stability and potential ingredient for functional food development LWT-Food Science and Technology, 55 (1): 117-123 Derakhshana Zahra, Margherita Ferranted, Marzieh Tadie , Farnoosh Ansarie , Ali Heydarif, Motahreh Sadat Hosseinig, Gea Oliveri Contid, Elham Khalili Sadrabad 2018 Antioxidant activity and total phenolic content of ethanolic extract of pomegranate peels, juice and seeds Food and Chemical Toxicology, 114: 108-111 Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P and Smith, F (1956) Colorimetric method for determination of sugars and related substances Anal Chem 28:350–356 Dương Thị Phượng Liên Nguyễn Nhật Minh Phương (2014) Ảnh hưởng biện pháp xử lý nguyên liệu đến khả trích ly ổn định anthocyanin từ bắp cải tím (Brassica oleracea) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Số chuyên đề: Nông nghiệp (1): 1-7 Đỗ Tất Lợi (2014) Những Cây thuốc Vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học Farahziela, A., Che, N.M.T., Mohamad, A.M.M and Sobri, M.A (2017) Antioxidant Properties of Crude Extract, Partition Extract, and Fermented Medium of Dendrobium sabin Flower Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine; 1-9 Hadjadj, S., Benyahkem M., Lamri K., Ould El Hadj-Khelil A 2018 Potential assessment of pomegranate (Punica granatum l.) fruit peels as a source of natural antioxidants Pharmacophore, 9(4): 29-35 Han, X., Shen, T and Lou, H (2007) Dietary polyphenols and their biological significance International Journal of Molecular Sciences, 8: 950-988 Harleen, K.S., Bimlesh, K., Manoj, S and Pardeep S (2011) A Review of Phytochemistry and Pharmacology of Flavonoids Inter pharmaceuticasciencia, 1(1): 25-35 Jayaprakash, A and Sangeetha, R (2015) Phytochemical Screening of Punica granatum Linn Peel Extracts Journal of Academia and Industrial Research, (5): 160-162 Karimi, M., Sadeghi, R and Kokini, J (2017) Pomegranate as a promising opportunity in medicine and nanotechnology Trends in Food Science & Technology, 69:59-73 Kavitha, C.C.I and Indira, G (2016) Quantitative estimation of total phenolic, flavonoids, tannin and chlorophyll content of leaves of Strobilanthes Kunthiana (Neelakurinji) Journal of Medicinal Plants Studies (4): 282-286 Khan, H., Jawad, M., Kamal, M A., Baldi, A., Xiao, J., Nabavi, S M., and Daglia, M (2018) Evidence and prospective of plant derived flavonoids as antiplatelet agents: Strong candidates to be drugs of future Food and Chemical Toxicology In Press DOI: 10.1016/j.fct.2018.02.014 254 Mashkor, I.M.AA (2014) Total phenol, Total Flavonoids and Antioxidant Activity of Pomegranate Peel International Journal of ChemTech Research CODEN, (11): 4656-4661 Mayachiew, P and Devahastin, S (2008) Antimicrobial and antioxidant activities of Indian gooseberry and galangal extract J LWT-Food Science and Technology, 41(7): 1153-1159 Nimse, S.B and Pal, D (2015) Free radicals, natural antioxidants, and their reaction mechanisms RSC Adv., (35): 27986-28006 Nguyễn Văn Bình, Phạm Thị Phương Nguyễn Tá Lợi (2018) Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly hàm lượng polysaccharide toàn phần nấm linh chi đỏ Tạp chí khoa học Cơng nghệ, Đại học Thái ngun, 180 (04): 3-8 Patel, R.M and Natvar, J.P (2011) In vitro antioxidant activity of coumarin compounds by DPPH, Super oxide and nitric oxide free radical scavenging methods Journal of advanced pharmacy education and research 1:52-68 Pieme, C A., Kumar, S.G , Dongmo, M.S., Moukette, B.M., Boyoum, F.F., Ngogang, J.Y and Saxena, A.K (2014) Antiproliferative activity and induction of apoptosis by Annona muricata (Annonaceae) extract on human cancer cells BMC complementary and alternative medicine, 14(1): 1-10 Shahindokht, B.J.P and Doostkam, A 2019 Comparative evaluation of bioactive compounds of various cultivars of pomegranate (Punica granatum) in different world regions AIMS Agriculture and Food, 4(1): 41-55 Shekhar, T.C and Anju, G (2014) Antioxidant Activity by DPPH Radical Scavenging Method of Ageratum conyzoides Linn Leaves American Journal of Ethnomedicine, 1(4): 244-249 Tachakittirungrod, S., Okonogi, S and Chowwanapoonpohn, S (2007) Study on Antioxidant activity of certain plants in Thailand: Mechanism of antioxidant action of guava leaf extract Food Chemistry, 103: 381-388 Viện Dược liệu (2008) Kỹ thuật chiết xuất dược liệu Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Weecharangsan, W., Opanasopit, P., Sukma, M., Ngawhirunpat, T and Sotanaphun, U (2006) Antioxidative and nẻuoprotective activities of extracts from the fruit hulls Garcinia mangostana Linn Med Princ Pract, 15: 281-287 Yadav, M., S Chatterji, Gupta, S.K and Watal, G (2014) Preliminary phytochemical screening of six medicinal plants used in traditional medicine International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, (5): 539-542 Yadav, R.N.S and Agarwala, M (2011) Phytochemical Analysis of Some Medicinal Plants Journal of Phytology, 3: 10-14 Yun, L., Caiping, Z., Xichuan, Z., Yang, Z., Zhen, D and Jingru, S (2018) Optimization of enzyme assisted extraction of polysaccharides from pomegranate peel by response surface methodology and their anti-oxidant potential Chinese Herbal Medicines, 10: 416-423 255 ...KHẢO SÁT HOẠT CHẤT SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT VỎ TRÁI LỰU (Punica granatum) Nguyễn Phạm Tuấn1*, Bằng Hồng Lam2, Nguyễn... khảo sát số hợp chất có hoạt tính sinh có khả kháng oxy hố Cao chiết vỏ trái lựu chiết xuất theo phương pháp ngâm dầm với dung môi (nước, ethanol acetone) kết hợp với sóng siêu âm Khả kháng oxy. .. nghiên cứu cho thấy, vỏ trái lựu chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học có khả kháng oxy hóa nguồn nguyên liệu tiềm cho nghiên cứu ứng dụng Từ khóa: lựu, flavonoid, kháng oxy hóa, polyphenol,