MỞ ĐẦU Trong hơn 70 năm qua kể từ khi được phát minh, kháng sinh đã đóng vai trò quan trọng hàng đầu trong nền y học hiện đại góp phần to lớn vào công tác điều trị và khống chế bệnh nhiễm trùng, làm giảm tỷ lệ tử vong và nâng cao tuổi thọ cho con người. Tuy nhiên do việc sử dụng kháng sinh rộng rãi trong điều trị nhất là các kháng sinh mới đã nhanh chóng làm gia tăng sự kháng thuốc của vi khuẩn. Tình trạng kháng khuốc của vi khuẩn đã được tổ chức Y tế thế giới coi là một vấn đề quan trọng tác động đến sức khỏe của con người và được xếp vào một trong năm vấn đề quan trọng hàng đầu của các bệnh nhiễm trùng cần được giám sát một cách chặt chẽ (Weinberg J, 1999). Hiện nay, nhiễm trùng bệnh viện được coi là một trong những yếu tố quan trọng liên quan đến tính kháng kháng sinh của vi khuẩn trên toàn cầu. Trong 2 thập kỷ vừa qua, các nhóm kháng sinh thế hệ mới phổ rộng hơn như fluoroquinolone, cephalosporin thế hệ I, II và III (extendedspectrumlactamase ESBL) được sử dụng điều trị các chủng kháng đa kháng sinh có ý nghĩa quan trọng trong công tác điều trị. Tuy nhiên, do sử dụng kháng sinh nhiều và kéo dài đã dẫn đến tình trạng gia tăng các chủng vi khuẩn kháng đa kháng sinh thế hệ mới phổ rộng ở nhiều nước trên thế giới (Harish, 2007). Năm 2003 kết quả nghiên cứu ở Mỹ cho thấy: 5,8% E. coli, 31,9% K. pneumoniae và 31,1% các chủng Enterobacter đã kháng kháng sinh thế hệ mới phổ rộng như Cephalosporin thế hệ III. Do vậy, nhóm carbapenem hiện nay được sử dụng là thuốc đầu tay trong các bệnh viện để điều trị các trường hợp nhiễm trùng nặng với các chủng vi khuẩn kháng các kháng sinh phổ rộng (ESBL). Thực trạng sử dụng và lạm dụng kháng sinh đã gây ra áp lực chọn lọc cho vi khuẩn kháng lại các kháng sinh nhóm carbapenem. Tại Anh năm 2009 đã cảnh báo số chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem như E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa đang gia tăng ở bệnh nhân nằm điều trị tại các bệnh viện. Báo cáo tại Việt Nam về nhiễm khuẩn bệnh viện cũng cho thấy tỷ lệ nhiễm K. pneumoniae đạt tỷ lệ cao nhất là 18,3% (Đoàn Mai Phương, 2010). Đây là một trong những vấn đề hiện nay đang được tổ chức Y tế Thế giới, các quốc gia và nhiều nhà khoa học quan tâm hàng đầu. Các bệnh nhân bị nhiễm trùng bởi các vi khuẩn kháng carbapenem sẽ làm tăng nguy cơ thất bại trong điều trị, tăng chi phí, kéo dài thời gian điều trị và nguy cơ tử vong cao cho bệnh nhân. Thêm vào đó những bệnh nhân bị nhiễm các chủng kháng carbapenem khi trở về cộng đồng sẽ là nguồn lây lan các chủng vi khuẩn kháng thuốc trong cộng đồng. Với tình trạng kháng kháng sinh mạnh mẽ của các vi khuẩn như hiện nay sẽ dẫn tới tình trạng không có kháng sinh điều trị hiệu quả các vi khuẩn này trong 510 năm tới. Đây là mối lo ngại toàn cầu cần được nghiên cứu nhằm hiểu rõ thực trạng để đưa ra giải pháp hợp lý và hiệu quả hạn chế tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Tại Việt Nam các nghiên cứu trước đây về tình hình kháng thuốc đã cung cấp nhiều thông tin quan trọng giúp cho công tác điều trị, phòng chống dịch và quản lý sử dụng kháng sinh. Mặc dù Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem nguyên nhân hàng đầu trong nhiễm khuẩn bệnh viện, cho đến nay chưa có một nghiên cứu nào về dịch tễ học phân tử được thực hiện trên các chủng tại Việt Nam. Để tìm hiểu về tỷ lệ các chủng mang gen kháng kháng sinh tại các bệnh viện trên địa bàn Hà Nội, cũng như đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng phân lập được, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Một số đặc tính sinh học phân tử chủng Klebsiella pneumoniae mang gen KPC kháng carbapenem phân lập tại một số bệnh viện tại Hà Nội trong giai đoạn 20102013” với ba mục tiêu cụ thể sau:
Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Ký hiệu Viết đầy đủ tiếng Anh Viết giải nghĩa tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic Acid Phân tử axit nucleic AM Ampicillin Kháng sinh Ampicillin AMC Amoxicillin + clavunalate Kháng sinh Amoxicillin + clavunalate ATCC American Type Culture Collection Bộ sưu tập chủng chuẩn Mỹ ATM Aztreonam Kháng sinh Aztreonam bp Base pair Đơn vị đo trọng lượng phân tử DNA CAZ Ceftazidime Kháng sinh Ceftazidime CDC Centre for Disease for Control and Prevention Trung tâm kiểm soát phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ CEF Cefixime Kháng sinh Cefixime CF Cephalothin Kháng sinh Cephalothin CIP Ciprofloxacin Kháng sinh Ciprofloxacin CLSI Clinical laboratory standards institute Viện chuẩn thức Lâm sàng phòng xét nghiệm CRKP Carbapenem resitant K pneumoniae K pneumoniae kháng carbapenem CRO Ceftriaxone Kháng sinh Ceftriaxone CTX Cefotaxim Kháng sinh Cefotaxim CTX Cefotaxime Kháng sinh Cefotaxime Ký hiệu Viết đầy đủ tiếng Anh Viết giải nghĩa tiếng Việt CTX-M Cefotaximase Enzym ly giải kháng sinh cefotaxim CXM Cefuroxim Kháng sinh Cefuroxim ESBL Extended-spectrum betalactamase Enzym beta-lactamase kháng kháng sinh phổ rộng FEP Cefepime Kháng sinh Cefepime gapA Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase Gen mã hóa enzyme Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GM Gentamicin Kháng sinh Gentamicin ICE Intergrative conjugative element Yếu tố tiếp hợp hòa nhập infB translation initiation factor Gen mã hóa yếu tố khởi đầu dịch mã IPM Imipenem Kháng sinh Imipenem K pneumoniae Klebsiella pneumoniae Tên viết tắt vi khuẩn Klebsiella pneumoniae KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase Enzym kháng carbapenem phát chủng Klebsiella pneumoniae LB Luria-Bertani LB Luria-Bertani Tên môi trường nuôi cấy vi khuẩn MBLs Metallo-beta-lactamase Enzym kháng kháng sinh nhóm beta lactam mdh malate dehydrogenase Gen mã hóa malate dehydrogenase MEM Meropenem Kháng sinh Meropenem Ký hiệu Viết đầy đủ tiếng Anh Viết giải nghĩa tiếng Việt MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MLST Multi locus sequence type Phân loại dựa đa điểm trình tự gen NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia NDM-1 New Delhi metallobetalactamase-1 New Delhi metallo-betalactamase-1 kháng carbapenem OXA Oxacillinase Enzym oxacillinase ly giải carbapenem PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi PFGE Pulse field gel electrophoresis Điện di trường xung pgi phosphoglucose isomerase Gen mã hóa phosphoglucose isomerase phoE phosphorine E Gen mã hóa phosphorine E rpoB beta subunit of RNA polymerase Tiểu đơn vị B chuỗi ARN thông tin SHV Sulfhydryl variable Enzym sulfhydryl ly giải kháng sinh phổ rộng SMA Sodium mercapto acetic acid Muối mercapto acetic acid SME Serratia marcescens enzyme Enzym Serratia marcescens ly giải carbapenem ST Sequence type Kiểu trình tự SXT Trimethoprim sulphamethoxazole Kháng sinh Trimethoprim sulphamethoxazole Ký hiệu Viết đầy đủ tiếng Anh Viết giải nghĩa tiếng Việt TEM A β-lactamase named after a Greek patient Temoneira Tên enzym beta-lactamase đặt theo tên bệnh nhân người Hy Lạp ton B periplasmic energy transducer Gen mã hóa chuyển đổi lượng chu chất VIM Verona integron-encoded metallo-β-lactamase Tiểu thể Verona mang gen mã hóa enzyme metallo-βlactamase Danh mục bảng Bảng Tên Bảng Trang 1.1 Kháng sinh carbapenem phổ tác dụng 1.2 Phân loại, biến thể Carbapenemase họ Enterobacteriaceae 20 2.1 Các cặp mồi đặc hiệu phát gen mã hóa beta lactamase 42 2.2 Các cặp mồi dùng cho phân tích MLST 45 3.1 Phân bố chủng vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem ba bệnh viện theo năm 49 3.2 Phân bố chủng K pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem 51 3.3 Phân bố ca bệnh nhiễm khuẩn bệnh viện vi khuẩn sinh KPC theo nhóm tuổi 54 3.4 Phân bố ca bệnh nhiễm khuẩn bệnh viện vi khuẩn sinh KPC theo khoa chuyên môn bệnh viện 54 3.5 Kết kháng sinh đồ K pneumoniae mang blaKPC kháng carbapenem bệnh viện 56 3.6 Kết MIC bệnh viện Xanh pôn 59 3.7 Kết MIC bệnh viện Thanh Nhàn 60 3.8 Kết MIC bệnh viện Việt Đức 61 3.9 Phân bố gen ESBLs chủng vi khuẩn K.pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem 65 3.10 Phân bố genotype chủng K pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem phân lập ba bệnh viện 69 3.11 Kết MLST chủng K pneumoniea mang gen blaKPC kháng carbapenem phân lập ba bệnh viện 75 3.12 Tỷ lệ truyền plasmid mang gen blaKPC từ chủng K pneumoniae kháng carbapenem sang chủng E coli J53 80 Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình Tên Hình Trang 1.1 Cấu trúc phân tử carbapenem 1.2 Tỷ lệ phân bố chủng Klebsiella pneumoniae sinh enzyme carbapenemase 10 1.3 Tỷ lệ đề kháng Klebsiella spp với số kháng sinh thường dùng điều trị 16 1.4 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm 19 1.5 Sự khác biến thể blaKPC 22 1.6 Cây tiến hóa biến thể blaKPC 23 1.7 Các đồng phân Tn4401 24 2.1 Tóm tắt quy trình nghiên cứu 38 3.1 Phân bố Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem bệnh viện 48 3.2 Kết đại diện phát Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC 52 3.3 Số lượng chủng K pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem 52 3.4 Phân bố ca bệnh nhiễm khuẩn bệnh viện vi khuẩn sinh KPC theo năm 53 3.5 Phân bố ca bệnh nhiễm khuẩn bệnh viện vi khuẩn sinh KPC theo loại bệnh phẩm,m 55 3.6 Trình tự đại diện chủng K pneumoniae kháng carbapenemase mang gen blaKPC phân xlập bệnh viện Xanh pôn 62 3.7 Trình tự đại diện chủng K pneumoniae kháng carbapenemase mang gen blaKPC phân lập bệnh viện Thanh Nhàn 63 3.8 Trình tự đại diện chủng K pneumoniae kháng carbapenemase mang gen blaKPC phân lập bệnh viện Việt Đức 63 3.9 So sánh trình tự gen blaKPC K pneumoniae kháng carbapenem nghiên cứu với trình tự chuẩn ngân hàng gen 64 Hình Tên Hình Trang 3.10 Kết phát ESBLs đại diện số chủng K pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem 65 3.11 Kết điện di trường xung đại diện số chủng K pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem phân lập ba bệnh viện từ năm 2010 đến năm 2014 67 3.12 Cây phả hệ 75 chủng K pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem phân lập ba bệnh viện từ năm 2010 đến năm 2014 68 3.13 Ảnh điện di kết PCR gen giữ nhà K pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenemase 70 3.14 Trình tự gen gapA 71 3.15 Trình tự gen infB 71 3.16 Trình tự gen mdh 72 3.17 Trình tự gen pgi 72 3.18 Trình tự gen phoE 73 3.19 Trình tự gen rpoB 73 3.20 Trình tự gen tonB 74 3.21 Kết PFGE sau cắt enzyme S1 số chủng K pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem phân lập phân lập ba bệnh viện từ năm 2010 đến năm 2014 77 3.22 Kết Southern blot phát gen blaKPC số chủng K pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem phân lập phân lập ba bệnh viện từ năm 2010 đến năm 2014 78 3.23 Hình ảnh khuẩn lạc E coli J53 sau tiếp hợp plasmid môi trường thạch Macconkey có chứa Meropenem NaN3 79 3.24 Hình ảnh PCR kiểm tra chủng vi khuẩn E coli J53 mọc mơi trường thạch Macconkey có chứa Meropenem NaN3 79 MỞ ĐẦU Trong 70 năm qua kể từ phát minh, kháng sinh đóng vai trò quan trọng hàng đầu y học đại góp phần to lớn vào cơng tác điều trị khống chế bệnh nhiễm trùng, làm giảm tỷ lệ tử vong nâng cao tuổi thọ cho người Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh rộng rãi điều trị kháng sinh nhanh chóng làm gia tăng kháng thuốc vi khuẩn Tình trạng kháng khuốc vi khuẩn tổ chức Y tế giới coi vấn đề quan trọng tác động đến sức khỏe người xếp vào năm vấn đề quan trọng hàng đầu bệnh nhiễm trùng cần giám sát cách chặt chẽ (Weinberg J, 1999) Hiện nay, nhiễm trùng bệnh viện coi yếu tố quan trọng liên quan đến tính kháng kháng sinh vi khuẩn toàn cầu Trong thập kỷ vừa qua, nhóm kháng sinh hệ phổ rộng fluoroquinolone, cephalosporin hệ I, II III (extended-spectrum-β-lactamase - ESBL) sử dụng điều trị chủng kháng đa kháng sinh có ý nghĩa quan trọng công tác điều trị Tuy nhiên, sử dụng kháng sinh nhiều kéo dài dẫn đến tình trạng gia tăng chủng vi khuẩn kháng đa kháng sinh hệ phổ rộng nhiều nước giới (Harish, 2007) Năm 2003 kết nghiên cứu Mỹ cho thấy: 5,8% E coli, 31,9% K pneumoniae 31,1% chủng Enterobacter kháng kháng sinh hệ phổ rộng Cephalosporin hệ III Do vậy, nhóm carbapenem sử dụng thuốc đầu tay bệnh viện để điều trị trường hợp nhiễm trùng nặng với chủng vi khuẩn kháng kháng sinh phổ rộng (ESBL) Thực trạng sử dụng lạm dụng kháng sinh gây áp lực chọn lọc cho vi khuẩn kháng lại kháng sinh nhóm carbapenem Tại Anh năm 2009 cảnh báo số chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem E coli, Klebsiella pneumoniae, 10 Pseudomonas aeruginosa gia tăng bệnh nhân nằm điều trị bệnh viện Báo cáo Việt Nam nhiễm khuẩn bệnh viện cho thấy tỷ lệ nhiễm K pneumoniae đạt tỷ lệ cao 18,3% (Đoàn Mai Phương, 2010) Đây vấn đề tổ chức Y tế Thế giới, quốc gia nhiều nhà khoa học quan tâm hàng đầu Các bệnh nhân bị nhiễm trùng vi khuẩn kháng carbapenem làm tăng nguy thất bại điều trị, tăng chi phí, kéo dài thời gian điều trị nguy tử vong cao cho bệnh nhân Thêm vào bệnh nhân bị nhiễm chủng kháng carbapenem trở cộng đồng nguồn lây lan chủng vi khuẩn kháng thuốc cộng đồng Với tình trạng kháng kháng sinh mạnh mẽ vi khuẩn dẫn tới tình trạng khơng có kháng sinh điều trị hiệu vi khuẩn 5-10 năm tới Đây mối lo ngại toàn cầu cần nghiên cứu nhằm hiểu rõ thực trạng để đưa giải pháp hợp lý hiệu hạn chế tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn Tại Việt Nam nghiên cứu trước tình hình kháng thuốc cung cấp nhiều thông tin quan trọng giúp cho công tác điều trị, phòng chống dịch quản lý sử dụng kháng sinh Mặc dù Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem nguyên nhân hàng đầu nhiễm khuẩn bệnh viện, chưa có nghiên cứu dịch tễ học phân tử thực chủng Việt Nam Để tìm hiểu tỷ lệ chủng mang gen kháng kháng sinh bệnh viện địa bàn Hà Nội, đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng phân lập được, chúng tơi tiến hành nghiên cứu: “Một số đặc tính sinh học phân tử chủng Klebsiella pneumoniae mang gen KPC kháng carbapenem phân lập số bệnh viện Hà Nội giai đoạn 2010-2013” với ba mục tiêu cụ thể sau: 130 117 130 Robledo IE, A E., Vázquez GJ (2011) Detection of the KPC gene in Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Acinetobacter baumannii during a PCR-based nosocomial surveillance study in Puerto Rico Antimicrob Agents Chemother 55(6): 2968-2970 118 Robledo IE, V G., Moland EE (2011) Dissemination and molecular epidemiology of KPC-producing Klebsiella pneumoniae collected in Puerto Rico Medical Center Hospitals during a 1-year period Epidemiol Res Intl.: 1-8 119 Rossolini, G M., M M D'Andrea and C Mugnaioli (2008) The spread of CTX-Mtype extended-spectrum beta-lactamases Clin Microbiol Infect 14 Suppl 1: 33-41 120 Samuelsen, O., U Naseer, S Tofteland, D H Skutlaberg, A Onken, R Hjetland, A Sundsfjord and C G Giske (2009) Emergence of clonally related Klebsiella pneumoniae isolates of sequence type 258 producing plasmid-mediated KPC carbapenemase in Norway and Sweden J Antimicrob Chemother 63(4): 654-658 121 Satlin, M J., L Chen, G Patel, A Gomez-Simmonds, G Weston, A C Kim, S K Seo, M E Rosenthal, S J Sperber, S G Jenkins, C L Hamula, A C Uhlemann, M H Levi, B C Fries, Y W Tang, S Juretschko, A D Rojtman, T Hong, B Mathema, M R Jacobs, T J Walsh, R A Bonomo and B N Kreiswirth (2017) Bacteremia due to Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE): A Multicenter Clinical and Molecular Epidemiologic Analysis in the Nation's Epicenter for CRE Antimicrob Agents Chemother 122 Sheng, J F., J J Li, S Tu, Z K Sheng, S Bi, M H Zhu, X M Shen and L J Li (2012) blaKPC and rmtB on a single plasmid in Enterobacter amnigenus and Klebsiella pneumoniae isolates from the same patient Eur J Clin Microbiol Infect Dis 31(7): 1585-1591 123 Sheng JF, L J., Tu S, et al (2012) blaKPC and rmtB on a single plasmid in Enterobacter amnigenus and Klebsiella pneumoniae isolates from the same patient Eur J Clin Microbiol Infect Dis 31(7): 1585-1591 131 124 131 Sidjabat H, N G., Walsh TR, et al (2011) Carbapenem resistance in Klebsiella pneumoniae due to the New Delhi Metallo-beta-lactamase Clin Infect Dis 52(4): 481-484 125 Siguier, P., J Filee and M Chandler (2006) Insertion sequences in prokaryotic genomes Curr Opin Microbiol 9(5): 526-531 126 Smillie, C., M P Garcillan-Barcia, M V Francia, E P Rocha and F de la Cruz (2010) Mobility of plasmids Microbiol Mol Biol Rev 74(3): 434-452 127 Smith Moland, E., N D Hanson, V L Herrera, J A Black, T J Lockhart, A Hossain, J A Johnson, R V Goering and K S Thomson (2003) Plasmidmediated, carbapenem-hydrolysing beta-lactamase, KPC-2, in Klebsiella pneumoniae isolates J Antimicrob Chemother 51(3): 711-714 128 Steven, L F., Anne Y Chen, Shabbir Simjee, Marcus J Zervo (2011) Molecular Techniques for the Study of Hospital Acquired Infection Canadia, Wiley Blackwell 129 Sykes, R (2001) Penicillin: from discovery to product Bull World Health Organ 79(8): 778-779 130 Thal, L., S Donabedian, B Robinson-Dunn, J W Chow, L Dembry, D B Clewell, D Alshab and M J Zervos (1998) Molecular analysis of glycopeptide-resistant Enterococcus faecium isolates collected from Michigan hospitals over a 6-year period J Clin Microbiol 36(11): 3303-3308 131 Tijet, N., P M Sheth, O Lastovetska, C Chung, S N Patel and R G Melano (2014) Molecular characterization of Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)-producing Enterobacteriaceae in Ontario, Canada, 2008-2011 PLoS One 9(12): e116421 132 Tran, H H., S Ehsani, K Shibayama, M Matsui, S Suzuki, M B Nguyen, D N Tran, V P Tran, D L Tran, H T Nguyen, D A Dang, H S Trinh, T H Nguyen and H F Wertheim (2015) Common isolation of New Delhi metallo-betalactamase 1-producing Enterobacteriaceae in a large surgical hospital in Vietnam Eur J Clin Microbiol Infect Dis 34(6): 1247-1254 132 133 132 Trần Nhật Phương, P H V (2012) Klebsiella pneumoniae Enterobacter hormaechii sỡ hữu gen blaKPC đề kháng carbapenem Việt Nam Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh 16 (3): 604-607 134 Trần Nhật Phương, P H V., Trần Linh Thước (2015) Sự lan truyền gen đề kháng carbapenem từ Klebsiella pneumoniae sang E coli J53 phịng thí nghiệm Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, 19: 36 - 44 135 Tsakris A, P A., Themeli-Digalaki K, Voulgari E, Pittaras T, Sofianou D, et al (2009) Use of Boronic Acid Disk Tests to Detect Extended-Spectrum b-lactamases in Clinical Isolates of KPC Carbapenemase-Possessing Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 47: 3420-3426 136 Vastag, B (2012) "Superbug' stalked NIH hospital last year, killing six " The Washington Post 137 Villalon, P., S Valdezate, M J Medina-Pascual, V Rubio, A Vindel and J A SaezNieto (2011) Clonal diversity of nosocomial epidemic Acinetobacter baumannii strains isolated in Spain J Clin Microbiol 49(3): 875-882 138 Villegas MV, L K., Correa A, et al (2006) First detection of the plasmidmediated class A carbapenemase KPC-2 in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae from South America Antimicrob Agents Chemother 50(8): 2880-2882 139 Vimont, S., B Mnif, C Fevre and S Brisse (2008) Comparison of PFGE and multilocus sequence typing for analysis of Klebsiella pneumoniae isolates J Med Microbiol 57(Pt 10): 1308-1310 140 Vubil, D., R Figueiredo, T Reis, C Canha, L Boaventura and D A S GJ (2017) Outbreak of KPC-3-producing ST15 and ST348 Klebsiella pneumoniae in a Portuguese hospital Epidemiol Infect 145(3): 595-599 141 Wang, D., J Chen, L Yang, Y Mou and Y Yang (2014) Phenotypic and enzymatic comparative analysis of the KPC variants, KPC-2 and its recently discovered variant KPC-15 PLoS One 9(10): e111491 133 142 133 Wang D, H W., Chen J, Mou Y, Yang L, Yang L, Sun X, Chen M (2014) Characterization of the blaKPC-2 and blaKPC-3 genes and the novel blaKPC-15 gene in Klebsiella pneumoniae J Med Microbiol 63(7): 981-987 143 Wang, G., T Huang, P K Surendraiah, K Wang, R Komal, J Zhuge, C R Chern, A A Kryszuk, C King and G P Wormser (2013) CTX-M beta-lactamaseproducing Klebsiella pneumoniae in suburban New York City, New York, USA Emerg Infect Dis 19(11): 1803-1810 144 Warnes, S L., C J Highmore and C W Keevil (2012) Horizontal transfer of antibiotic resistance genes on abiotic touch surfaces: implications for public health MBio 3(6) 145 Weinberg J, G O., Newton L (1999) Establishing priorities for European collaboration in communicable disease surveillance Eur J Public Health 9: 236240 146 Williams, J D (1987) Classification of cephalosporins Drugs 34 Suppl 2: 15-22 147 Woodford, N., J F Turton and D M Livermore (2011) Multiresistant Gramnegative bacteria: the role of high-risk clones in the dissemination of antibiotic resistance FEMS Microbiol Rev 35(5): 736-755 148 Woodford N, Z J., Warner M, et al (2008) Arrival of Klebsiella pneumoniae producing KPC carbapenemase in the United Kingdom J Antimicrob Chemother 62(6): 1261-1264 149 Wozniak, R A W., M K (2010) Integrative and conjugative elements: mosaic mobile genetic elements enabling dynamic lateral gene flow Nat Rev Microbiol 8(8): 552-563 150 Wright, G D (1999) Aminoglycoside-modifying enzymes Curr Opin Microbiol 2(5): 499-503 151 Wright, G D (2005) Bacterial resistance to antibiotics: enzymatic degradation and modification Adv Drug Deliv Rev 57(10): 1451-1470 152 Yang, J., L Ye, L Guo, Q Zhao, R Chen, Y Luo, Y Chen, S Tian, J Zhao, D Shen and L Han (2013) A nosocomial outbreak of KPC-2-producing Klebsiella 134 134 pneumoniae in a Chinese hospital: dissemination of ST11 and emergence of ST37, ST392 and ST395 Clin Microbiol Infect 19(11): E509-515 153 Yigit H, Q A., Anderson GJ, et al (2008) Author’s correction- Novel carbapenemhydrolyzing beta-lactamase, KPC-1, from a carbapenemresistant strain of Klebsiella pneumoniae Antimicrob Agents Chemother 52(2) 154 Yigit, H., A M Queenan, G J Anderson, A Domenech-Sanchez, J W Biddle, C D Steward, S Alberti, K Bush and F C Tenover (2001) Novel carbapenemhydrolyzing beta-lactamase, KPC-1, from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae Antimicrob Agents Chemother 45(4): 1151-1161 155 Ying-Tsong Chen, J.-C L., Chang-Phone Fung, Po-Liang Lu, Yin-Ching Chuang, Tsu-LanWu and a L K Siu (2014) KPC-2-encoding plasmids from Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Taiwan J Antimicrob Chemother 69: 628-631 156 Yong, D., M A Toleman, C G Giske, H S Cho, K Sundman, K Lee and T R Walsh (2009) Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene, bla(NDM-1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India Antimicrob Agents Chemother 53(12): 5046-5054 157 Zagorianou A, S E., Iosifidis E, et al (2012) Microbiological and molecular characteristics of carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae endemic in a tertiary Greek hospital during 2004-2010 Euro Surveill 17(7): pii:20088 PHẦN PHỤ LỤC PHỤ LỤC QUY TRÌNH CHẠY PFGE VÀ SOUTHERN BLOT Ngày 1: Cho PFGE: Cấy chủng vi khuẩn mang gen blaKPC vào đĩa thạch Muller-hinton có chứa 2µg/ml imipenem Ủ 370C 24 Lấy 4-5 khuẩn lạc đĩa thạch Muller-Hinton trộn vào 200µl dung dịch đệm TE Nhỏ 200µl dung dịch thạch Seakem gold 1%, trộn Nhỏ hỗn dịch vào khuôn tạo gel để tao plug đợi thạch đơng Chuyển plug sang tube 2ml có chứa 2ml dụng dịch lysis buffer (1mg/ml protein K, 1% N-laurorylsarcosin 0.5M EDTA pH 8.0) Ủ qua đêm tube 550C bể ủ nhiệt, lắc nhẹ nhàng Cho Southern blot: Cấy chủng vi khuẩn mang gen blaKPC vào đĩa thạch Muller-hinton có chứa 2µg/ml imipenem Ủ 370C 24 Lấy khuẩn lạc đĩa thạch Muller-Hinton cấy vào 5ml môi trường canh thang LB ủ qua đêm có chứa 1µg IMP/ml Lấy 50µl dịch ni cấy qua đêm cho vào 5ml canh thang LB lắc 37 0C trong Ly tâm 2100 vòng/10phút loại dịch Rửa cặn tế bào 1ml dung dịch TE Hoàn nguyên cặn tế bào vi khuẩn 500µl dung dịch đệm TE Nhỏ 500µl dung dịch thạch Seakem gold 1%, trộn Nhỏ hỗn dịch vào khuôn tạo gel để tao plug đợi thạch đơng Chuyển plugs sang tube 2ml có chứa 2ml dụng dịch lysis buffer 10 (1mg/ml protein K, 1% N-lauroylsarcosin 0.5M EDTA pH 8.0) Ủ qua đêm tube 550C bể ủ nhiệt, lắc nhẹ nhàng Ngày 2: 135 Cắt miếng thạch có chiều dày khoảng 2mm từ miếng plug Cho miếng thạch cắt vào 2ml microtube Rửa miếng thạch 1ml nước siêu (đã ủ ấm 55 0C) 10-15 phút x lần Rửa miếng thạch 1ml dung dịch TE (đã ủ ấm 55 0C) 10-15 phút x lần Rửa miếng thạch 200µl dung dich đệm emzyme S1, ủ ấm 37 0C 10-15 phút Reagent µl/Plug Slide 12 Plug slide H2O 180 2160 10X S1 buffer 20 240 Total Volume 200 2400 Rửa miếng thạch chủng S braenderup 200µl dung dich đệm emzyme XbaI, ủ ấm 370C 10-15 phút Reagent µl/Plug Slide Plug slide H2O 180 360 10X XbaI buffer 20 40 Total Volume 200 400 Loại bỏ dung dịch đệm enzyme S1 XbaI pipet Cắt loại bỏ ADN nhiễm sắc thể vi khuẩn enzyme S1 nồng độ 20UI/200µl dung dịch đệm emzyme S1, ủ 370C vòng 1-2 Reagent µl/Plug Slide 12 Plug slide H2O 177 2124 10X Buffer 20 240 136 BSA 10mg/ml 24 S1 Enzyme (Promega) 12 200 2400 Total Volume Loại bỏ hỗn dịch enzyme rửa miếng plug lần sau cắt dung 10 dịch TE 1X lạnh (trong vòng 20-30 phút) Chủng S braenderup rửa đệm cắt enzyme XbaI, 40UI/phản ứng cắt 370C 6-8 Reagent µl/Plug Slide Plug slide H2 O 172 344 10X Buffer 20 40 BSA 10mg/ml 200 12 400 XbaI Enzyme (10U/µl) Total Volume 11 Chuẩn bị thạch điện di 1%: Cân 0.5 g thạch Seakem gold cho vào 50ml dung dịch đệm TBE 0,5X chai có nắp xốy, đun sơi microwave cho 12 thạch tan hoàn toàn Giữ chai thạch water-bath nhiệt độ 55-600C Rửa miếng thạch sau cắt enzyme 13 Loại bỏ toàn hỗn hợp cắt enzyme pipeting: Rửa miếng thạch dung dịch TE làm lạnh 30 phút X lần ngâm 14 15 16 17 miếng thạch 200µl TBE 0,5X Đặt miếng thạch vào đầu lược theo bước sau Đặt miếng thạch S braenderup vào đậu lược vị trí 1, 5, 10 15 đặt các thạch mẫu thí nghiệm vào vị trí lược cịn lại Thấm dung dịch đệm thừa giấy thấm Để khô tự nhiên nhiệt độ phòng 18 19 20 phút Đặt lược vào khuôn đổ thạch Đổ thạch vào khuôn đợi thạch đông Làm lạnh hệ thống điện di (140C), bật nguồn điện hệ thống bơm (đặt chế độ ≈70 để chạy tốc độ lít/1 phút) 137 21 22 23 Tháo lược sau thạch đơng hồn tồn (khoảng 30-40 phút sau đổ thạch Sử dụng thạch Seakem gold1% chưa đông 55-600C để lấp kín lỗ lược Sản phẩm cắt ADN điện di điện di CHEF-DR III (Bio-Rad laboratories, Richmond, Calif) thạch horizontal 1%, hiệu điện 6V/cm 19 nhiệt độ 140C, thời gian xung từ 25 đến 60s và góc điện trường 120 độ Ngày 3: Sau điện di nhuộm dung dich ethidium bromide 30 phút Rửa thạch điện di nước 60-90 phút, thay nước rửa 20 phút/ lần Chụp ảnh gel máy chụp ảnh Gel-doc Chuyển DNA plasmid sang màng lai Hybond-N, Amersham Hóa chất: - Dung dịch depurination: HCL 0,25 M Dung dịch Biến tính: 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH Dung dịch trung hòa:1.0 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5 Dung dịch SSC 20x Tiến hành: Rửa gel 250 ml dung dịch HCL 0,25 M 30 phút (depurination solution) Rửa gel 250 ml dung dịch biến tính (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH) Rửa gel 300 ml dung dịch trung hòa (1.0 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5) Nhúng ướt miếng đệm (porous) hộp chuyển màng vào H 2O sau đặt trở lại hộp chuyển màng Cắt miếng giấy lọc màng lai kích thước miếng thạch điện di PFGE Cắt khung plastic có kích thước ngắn miếng thạch khoảng 3-10mm tất hướng Đặt Khung plastic lên miếng đệm (porous) để tạo vị trí để đặt giấy lọc, màng lai miếng thạch PFGE Nhúng ướt miếng giấy lọc số H2O vô trùng đặt lên khung plastic sau nhấc khung plastic 138 Đặt màng lai (màng lai Hybond-N, Amersham) sau nhúng ướt với H2O vô trùng lên miếng giấy lọc số sau đặt lên miếng giấy 10 11 lọc số (loại bỏ bọt khí) Đặt trở lại khung plastic lên miếng giấy lọc màng lai Đặt miếng thạch lên khung plastic (loại bỏ bọt khí) Sử dung thạch Seakem gold 1% pha TBE 1X để hàn xung quanh miếng 12 thạch đổ lên khung plastic để hàn kín chỗ dị rỉ Phủ miếng thạch PFGE dung dịch chuyển màng SSC 20X (3 M NaCl, 13 14 15 300 mM NaCitrate, pH 7.0) Đặt ấp lực hút chân không 50 mbar hút chân khơng vịng 90 phút Tắt bơm hút chân không loại bỏ miếng thạch PFGE Lấy màng lai khỏi hộp chuyển màng rửa dung dịch chuyển màng SSC 20X 10 phút sau làm khơ vịng 15 phút nhiệt độ 16 phịng thí nghiệm Màng lai sau xử lý tia cực tím (UV-cross linking) cường độ 150 mJ phút (nếu chưa sử dụng mang lai rửa H2O làm khơ khơng khí sau gói giấy bạc giữ 17 40C Hiệu xuất chuyển màng đánh giá cách nhuộm lại miếng thạch PFGE chụp lại ảnh máy chụp Gel-Doc Ngày 4: Kỹ thuật Southern-blotting Hóa chất: • Dung dịch tiền lai (prehybridization): 100ml - Hóa chất phủ màng blocking reagent (5%w/v) - NaCl (Nồng độ cuối 0.5 M) - Hybridization buffer • Dung dịch lai (hybridization): Nhỏ 60 μl Sản phẩm PCR blaKPC đánh • dấu kít ECL vào 20 ml dung dịch tiền lai (pre-hybridization) Dung dịch rửa màng: - Dung dịch rửa khơng có Urea (primary buffer): SDS g 20 x SSC 25 ml 139 Cho thêm nước vào cho đủ 1000ml , giữ 2-80C sử dụng tháng - Dung dịch rửa màng 2: 2x SSC (100ml 20x SSC 900ml H2O) Hiện màng (sử dụng Kit ECl) - Trộn dung dịch A dung dịch B với tỷ lệ 40:1 - Nhỏ dung dịch lên màng ủ nhiệt độ phòng phút - Sử dụng Hyper film để phát 140 PHỤ LỤC KẾT QUẢ PFGE 141 142 ... phân tử chủng phân lập được, tiến hành nghiên cứu: ? ?Một số đặc tính sinh học phân tử chủng Klebsiella pneumoniae mang gen KPC kháng carbapenem phân lập số bệnh viện Hà Nội giai đoạn 2010- 2013? ??... diện số chủng K pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem phân lập ba bệnh viện từ năm 2010 đến năm 2014 67 3.12 Cây phả hệ 75 chủng K pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem phân lập ba bệnh. .. sâu đặc tính sinh học chủng 24 Báo cáo sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008-2009 cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh chủng Klebsiella khác bệnh viện (Báo cáo y tế, 2010)