Tóm tắt những kết quả mới của luận án: 1. Về thực vật học Luận án là tài liệu đầu tiên mô tả chi tiết đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi phẫu thân, rễ, lá và bột dược liệu loài Tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.). 2. Về hóa học Từ phần trên mặt đất loài Balanophora laxiflora Hemsl. đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 27 hợp chất, trong đó: 5 hợp chất mới, bao gồm 3 lignan ((8S,8ʹS)secoisolariciresinol9ʹOβᴅ glucopyranosid, balanophorosid B, balanophoron), 1 phenyl propanoid (balanophoroside A) và 1 iridoid (balanolaxin) 10 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Balanophora: salicifoliol, (8S,7ʹR,8ʹS)isolariciresinol 9Oβᴅglucopyranosid, Trans–p–coumaryl aldehyd, 6 Ogalloyl1OEcaffeoylβᴅglucopyranose, deacetyl asperulosidic acid, (21β)22 hydroxyhopan3on, (21α)22hydroxyhopan3on, phydroxybenzaldehyd, piceol (phydroxy acetophenon) và 1O(3methylbutyl)6Oβᴅxylopyranosyl (1→6)βᴅ glucopyranose 2 4 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài Balanophora laxiflora Hemsl. (8R,8ʹR)secoisolariciresinol4Oβᴅglucopyranosid, (8R,7′S,8′R)lariciresinol4ʹ Oβᴅglucopyranosid, coniferyl aldehyd βᴅglucopyranosid và 4Ogalloyl1OEcaffeoylβᴅglucopyranose. 3. Về tác dụng sinh học Luận án là công bố đầu tiên về tác dụng chống viêm của loài Tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.). Luận án là công bố đầu tiên về: Tác dụng chống viêm tiềm năng của hợp chất (21α)22hydroxyhopan3on từ phần trên mặt đất của Tỏa dương và nghiên cứu về cơ chế phân tử của hợp chất này. Tác dụng chống viêm in vivo của cao toàn phần, phân đoạn ethyl acetat và hợp chất (21α)22hydroxyhopan3on trên mô hình gây phù chân chuột bằng carragenan và gây u hạt bằng amiant. Tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao toàn phần, phân đoạn ethyl acetat và hợp chất (21α)22hydroxyhopan3on trên mô hình dọn gốc tự do DPPH và superoxide.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU NGUYỄN THỊ HỒNG ANH NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA LOÀI TỎA DƯƠNG (BALANOPHORA LAXIFLORA HEMSL.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆU DƯỢC LIỆU NGUYỄN THỊ HỒNG ANH NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA LOÀI TỎA DƯƠNG (BALANOPHORA LAXIFLORA HEMSL.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 9720206 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đỗ Thị Hà PGS.TS Nguyễn Thùy Dương HÀ NỘI, 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học PGS.TS Đỗ Thị Hà PGS.TS Nguyễn Thùy Dương Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm kết Tác giả luận án Nguyễn Thị Hồng Anh LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận án này, tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu Thầy Cô giáo, nhà khoa học bạn bè, đồng nghiệp gia đình Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đỗ Thị Hà PGS.TS Nguyễn Thùy Dương, người thầy tận tình hỗ trợ, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn tới TS Bùi Hữu Tài - Phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tơi nhiều q trình thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TSKH Nguyễn Minh Khởi - Viện trưởng Viện Dược liệu động viên tinh thần tạo điều kiện thuận lợi để hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cám ơn đồng nghiệp Khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu, Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu, Bộ môn Dược lực - Trường Đại học Dược Hà Nội Phòng ban Viện Dược liệu giúp đỡ, tạo điều kiện giúp tơi hồn thành cơng trình Luận án hỗ trợ phần kinh phí từ đề tài cấp Viện Dược liệu “Nghiên cứu thành phần hóa học Tỏa dương thu hái Việt Nam” đề tài cấp Quốc gia “Nghiên cứu thành phần hóa học mợt sớ hoạt tính sinh học chi Dó đất (Balanophora) Việt Nam, mã sớ 104.01-2015.75”, đó, tơi xin gửi lời cảm ơn tới Viện Dược liệu Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ quốc gia (NAFOSTED) tạo điều kiện để thực luận án Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho suốt q trình nghiên cứu, học tập hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn! NCS Nguyễn Thị Hồng Anh MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CÁM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI DÓ ĐẤT (BALANOPHORA) 1.1.1 Thực vật học chi Dó đất (Balanophora) 1.1.2 Thành phần hóa học số lồi thuộc chi Dó đất 1.1.3 Công dụng tác dụng sinh học số loài thuộc chi Balanophora 15 1.2 TỔNG QUAN VỀ LOÀI TỎA DƯƠNG (Balanophora laxiflora Hemsl.) 22 1.2.1 Thực vật .22 1.2.2 Thành phần hóa học lồi Tỏa dương (Balanophora laxiflora) 23 1.2.3 Tác dụng sinh học loài Tỏa dương (Balanophora laxiflora) 29 1.3 TỔNG QUAN VỀ VIÊM 33 1.3.1 Khái niệm 33 1.3.2 Các chất trung gian hóa học phản ứng viêm 34 1.3.3 Vai trò ROS MAPK phản ứng viêm 36 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .42 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 42 2.1.2 Động vật thí nghiệm 43 2.1.3 Thuốc thử, hóa chất, dung mơi 43 2.1.4 Máy móc, thiết bị 44 2.2 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 45 2.3 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 46 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .46 2.4.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật .46 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu hóa học .47 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý 48 2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 56 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THỰC VẬT HỌC 57 3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 57 3.1.2 Đặc điểm vi học 59 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 63 3.2.1 Định tính nhóm hợp chất hữu 63 3.2.2 Chiết xuất phân lập hợp chất 64 3.2.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ Tỏa dương 70 3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA TỎA DƯƠNG 105 3.3.1 Kết đánh giá tác dụng chống viêm in vitro Tỏa dương 105 3.3.2 Kết đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro Tỏa dương 112 3.3.3 Kết đánh giá tác dụng chống viêm in vivo Tỏa dương 113 CHƯƠNG BÀN LUẬN 118 4.1 VỀ THỰC VẬT 118 4.2 VỀ HÓA HỌC 119 4.3 VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC .130 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 141 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN PHỤ LỤC Tên viết tắt DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT Tên viết đầy đủ A.a Acid acetic Ace Aceton AP-1 Activator protein 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) Caff (E)-Caffeoyl Cin Cinnamoyl COSY Correlation Spectroscopy COX-2 Cyclooxygenase-2 CTCT Cơng thức cấu tạo CTHH Cấu trúc hóa học Cour p-Coumaroyl DCM Dichloromethan DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Dex Dexamethason DMEM Mơi trường dùng cho nhiều dịng tế bào khác (Dulbecco's Modified Eagle Medium) DMSO Dimethyl sulfoxid DPI Diphenyliodonium DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl EC50 Nồng độ có hiệu 50% (Effective Concentration 50%) EI-MS Phổ khối ion hóa điện tử (Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry) ESI-MS Phổ khối ion hóa phun mù điện tử (Electro Spray Ionisation-Mass Spectrometry) EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol FBS Huyết thai bò (Fetal Bovine Serum) Gal Galloyl GAPDH Glyceraldehyd-3-Phosphate Dehydrogenase Glc Glucopyranosyl HepG2 Dòng tế bào ung thư gan người (Human hepatocellular carcinoma cell line) Hx n-Hexan HL-60 Dòng tế bào ung thư máu (Human leukemia cell line) HMBC H-NMR HSQC HPLC HR-ESI-MS Phổ tương quan dị nhân đa liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) Phổ tương tác dị nhân lượng tử đơn (Heteronuclear Single Quantum Coherence) Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Chromatography) Phổ khối ion hóa phun mù điện tử phân giải cao (High Resolution-Electron Spray Ionization-Mass Spectrometry) IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) IFN-β Interferon beta IL Interleukin iNOS Inducible Nitric Oxide Synthase IR Hồng ngoại (Infrared) KLPT Khối lượng phân tử LC-MS Liquyd Sắc ký lỏng kết hợp với phổ khối (Liquyd Chromatography–Mass Spectrometry) LPS Lipopolysaccharid m Khối lượng chất thu MAPK Mitogen-activated protein kinase MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú (Human breast adenocarcinoma cell line) MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration) MTPA MTS Acid α-methoxy-α-(trifluoromethyl)phenylacetic 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4sulfophenyl)-2H-tetrazolium m/z Tỉ lệ khối lượng/điện tích (Mass to charge ratio) n-BuOH n-Butanol NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate NF-κB Yếu tố nhân kappa B (Nuclear Factor-kappa B) NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) NO Nitric oxid NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy NOS Nitric Oxid Synthase NOX NADPH oxidase NXB Nhà xuất OVASHO Tế bào ung thư buồng trứng ppm Phần triệu ROS Các gốc oxy hóa hoạt động (Reactive Oxygen Species) SOD Superoxid Dismutase STT Số thứ tự TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TLTK Tài liệu tham khảo TNF-α Yếu tố hoại tử khối u alpha (Tumor Necrosis Factor-alpha) TT Thuốc thử UV Tử ngoại (Ultra Violet) DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Cấu trúc hợp chất tannin phân lập từ lồi B laxiflora………………… 24 Hình 1.2 Cấu trúc phenylpropanoid đơn giản phân lập từ loài B laxiflora … 25 Hình 1.3 Cấu trúc hợp chất lignan phân lập từ lồi B laxiflora………………… 26 Hình 1.4 Cấu trúc hợp chất coumarin phân lập từ loài B laxiflora……………………26 Hình 1.5 Cấu trúc hợp chất flavonoid phân lập từ lồi B laxiflora…………… 27 Hình 1.6 Cấu trúc hợp chất terpenoid phân lập từ lồi B laxiflora……………….28 Hình 1.7 Cấu trúc hợp chất steroid phân lập từ lồi B laxiflora ………………….28 Hình 1.8 Cấu trúc hợp chất khác phân lập từ loài B laxiflora ………………… 28 Hình 1.9 Viêm gốc oxy hóa hoạt động (ROS)……………………………… 37 Hình 2.1 Tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.) 42 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu loài Tỏa dương B laxiflora .46 Hình 2.3 Quy trình thử nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây phù bàn chân chuột carrageenan 54 Hình 2.4 Quy trình thử nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm mạn mơ hình gây u hạt 55 Hình 3.1 Hình thái cụm hoa đực 58 Hình 3.2 Hình thái cụm hoa 59 Hình 3.3 Vi phẫu thân khí sinh 60 Hình 3.4 Cấu tạo vi phẫu thân rễ, bó mạch 61 Hình 3.5 Cấu tạo vi phẫu 61 Hình 3.6 Cấu tạo vi phẫu rễ Tỏa dương .62 Hình 3.7 Đặc điểm bột dược liệu 63 Hình 3.8 Quy trình chiết xuất phân lập hợp chất từ Tỏa dương 69 Hình 3.9 Cấu trúc hóa học hợp chất BL1 70 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL2…………72 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL3 74 Hình 3.12 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL4 75 Hình 3.13 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL5 77 Hình 3.14 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC hợp chất BL6 79 PHỤ LỤC 24: DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT BL23 Cấu trúc hợp chất BL23 Phụ lục 24.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL23 Phụ lục 24.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL23 Phụ lục 24.3 Phổ DEPT hợp chất BL23 Phụ lục 24.4 Phổ ESI-MS hợp chất BL23 Phụ lục 24.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL23 Phụ lục 24.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL23 Phụ lục 24.3 Phổ DEPT hợp chất BL23 + Pic ion giả phân tử m/z: 465,0 [M+Na] (C30H50ONa) Phụ lục 24.4 Phổ ESI-MS hợp chất BL23 PHỤ LỤC 25: DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT BL24 Cấu trúc hợp chất BL24 Phụ lục 25.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL24 Phụ lục 25.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL24 Phụ lục 25.3 Phổ ESI-MS hợp chất BL24 Phụ lục 25.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL24 Phụ lục 25.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL24 + Pic ion giả phân tử m/z: 123,05 [M+H] (C30H51O) Inten.(x10,000,000) 123.05 164.15194.15 1.75 153.15 1.50 1.25 1.00 0.75 105.05 338.50 0.50 0.25 288.40 218.20 391.45 454.45 0.00 50 100 150 200 250 300 350 400 Phụ lục 25.3 Phổ ESI-MS hợp chất BL24 450 m/z PHỤ LỤC 26: DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT BL25 Cấu trúc hợp chất BL25 Phụ lục 26.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL25 Phụ lục 26.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL25 Phụ lục 26.3 Phổ ESI-MS hợp chất BL25 Phụ lục 26.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL25 Phụ lục 26.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL25 - Pic ion giả phân tử m/z: 135,1 [M-H] (C8H7O2) Inten.(x10,000,000) 2.00 135.10 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 339.25 349.25 0.50 311.20 0.25 377.30 175.05 0.00 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Phụ lục 26.3 Phổ ESI-MS hợp chất BL25 m/z PHỤ LỤC 27: DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT BL26 Cấu trúc hợp chất BL26 Phụ lục 27.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL26 Phụ lục 27.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL26 Phụ lục 27.3 Phổ DEPT hợp chất BL26 Phụ lục 27.4 Phổ ESI-MS hợp chất BL26 Phụ lục 27.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL26 Phụ lục 27.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL26 Phụ lục 27.3 Phổ DEPT hợp chất BL26 + Pic ion giả phân tử m/z: 127,5 [M+H] (C6H7O3) Phụ lục 27.4 Phổ ESI-MS hợp chất BL26 PHỤ LỤC 28: DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT BL27 Cấu trúc hợp chất BL27 Phụ lục 28.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL27 Phụ lục 28.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL27 Phụ lục 28.3 Phổ HR-ESI-MS hợp chất BL27 Phụ lục 28.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất BL27 Phụ lục 28.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất BL27 - Pic ion giả phân tử m/z: 427,1080 [M+HCOO] (C17H32O5) Phụ lục 28.3 Phổ HR-ESI-MS hợp chất BL27 ... VỀ LOÀI TỎA DƯƠNG (Balanophora laxiflora Hemsl. ) 22 1.2.1 Thực vật .22 1.2.2 Thành phần hóa học lồi Tỏa dương (Balanophora laxiflora) 23 1.2.3 Tác dụng sinh học loài Tỏa dương (Balanophora. .. học mơ tả đặc điểm hình thái đặc điểm vi học Tỏa dương Nghiên cứu thành phần hóa học Tỏa dương Đánh giá tác dụng chống viêm cao toàn phần, cao phân đoạn số hợp chất phân lập từ Tỏa dương Để thực. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆU DƯỢC LIỆU NGUYỄN THỊ HỒNG ANH NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA LOÀI TỎA DƯƠNG (BALANOPHORA LAXIFLORA HEMSL. ) LUẬN ÁN TIẾN