1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM SEMINAR CÔNG NGHỆ ENZYME ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYME TRONG PHÂN TÍCH HÓA HỌC GVHD TS ĐỖ VIỆT HÀ Nhóm sinh viên thực hiện Nhóm 11 Bùi Xuân Mỹ Duyên 18139033 Nguyễn Thị Duyên 18139036 Nguyễn Minh Luân 18139089 Nguyễn Thị Kim Ngân 18139105 Nguyễn Thị Mỹ Xuyên 18139230 Tháng 12 năm 2021 2 MỤC LỤC I GIỚI THIỆU VỀ ENZYME 3 II ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG PHÂN TÍCH HÓA HỌC 3 1 Việc sử dụng enzyme để phân tích, định l.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM SEMINAR CÔNG NGHỆ ENZYME ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYME TRONG PHÂN TÍCH HĨA HỌC GVHD: TS ĐỖ VIỆT HÀ Nhóm sinh viên thực hiện: Nhóm 11 Bùi Xuân Mỹ Duyên 18139033 Nguyễn Thị Duyên 18139036 Nguyễn Minh Luân 18139089 Nguyễn Thị Kim Ngân 18139105 Nguyễn Thị Mỹ Xuyên 18139230 Tháng 12 năm 2021 MỤC LỤC I GIỚI THIỆU VỀ ENZYME ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG PHÂN TÍCH HĨA HỌC II Việc sử dụng enzyme để phân tích, định lượng chất 1.1 Cảm biến sinh học dựa enzyme 1.1.1 Cảm biến sinh học dựa vi chất lỏng liên tục 1.1.2 Cảm biến sinh học dựa vi lỏng giọt 1.1.3 Hiệu cảm biến sinh học từ enzyme 1.2 1.2.1 Luciferase với tư cách gene reporter thể sống 1.2.2 Luciferase ứng dụng thực nghiệm Một số enzyme để định lượng chất 1.3 III Hệ thống phát quang sinh học từ Luciferase 1.3.1 Malate dehydrogenase (MDH) 1.3.2 Isocitrate dehydrogenase (IDH) 10 1.3.3 Enzyme Alcohol dehydrogenase (ADH) 11 1.3.4 Enzyme Urease 12 1.3.5 Sulfite oxidase 13 Điện cực có enzyme cố định 14 2.1 Nguyên tắc cấu tạo hoạt động 14 2.2 Một số ví dụ về ứng dụng điện cực enzyme để phân tích chất: 14 KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN 15 BẢNG TỔNG HỢP CÁC ENZYME 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO 18 I GIỚI THIỆU VỀ ENZYME Enzyme có chất protein nên có tất thuộc tính lý hóa protein Đa số enzyme có dạng hình cầu khơng qua màng bán thấm có kích thước lớn Tan nước dung môi hữu phân cực khác, không tan ete dung môi không phân cực Không bền tác dụng nhiệt độ, nhiệt độ cao enzyme bị biến tính Mơt trường acid hay base làm enzyme khả hoạt động Enzyme có tính lưỡng tính: tùy pH mơi trường mà tồn dạng: cation, anion hay trung hòa điện Enzyme chia làm hai nhóm: enzym cấu tử (chỉ chứa protein) pepsin, amylase… enzyme hai cấu tử (trong phân tử cịn có nhóm khơng phải protein) Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần: + Apoenzyme: phần protein (nâng cao lực xúc tác enzyme, định tính đặc hiệu) + Coenzyme: phần protein (trực tiếp tham gia vào phản ứng enzyme), chất hợp chất hữu phức tạp II ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG PHÂN TÍCH HĨA HỌC Enzyme ứng dụng hóa học enzyme có cảm ứng cao nhiệt độ, pH thay đổi khác môi trường Rất hữu ích thuận tiện độ đặc hiệu cao độ nhạy chúng Trong hóa phân tích để định tính định lượng lượng số chất Khi sử dụng enzyme để định lượng chất thường tiến hành theo cách: Một là, dùng enzyme có tác dụng phân giải riêng chất ấy, sau dùng phương pháp phân tích thơng thường để định lượng chất sau phản ứng, từ suy lượng có nguyên liệu cần nghiên cứu Hai là, chất cần phân tích có tác dụng kiềm hãm, kích thích, đặc hiệu enzyme đấy, ta định lượng cách xác định mức độ ảnh hưởng chúng đến hoạt độ enzyme, đối chiếu với bảng đồ thị chuẩn, để suy lượng chất cần phân tích Ví dụ dùng enzyme phosphatase để định lượng ion fluo fluo có tác dụng kìm hãm enzyme Phương pháp có độ nhạy cao, xác định lượng fluo bé Có thể xác định chất đặc biệt với hàm lượng thấp bị lẫn với chất tương tự mặt hóa học Cho phép định lượng vật liệu thô chất không bền điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, kiểm sốt Có thể sử dụng enzyme để định lượng chất, chất hoạt hóa, chất kiềm hãm Enzyme sử dụng nghiên cứu cấu trúc hóa học như: dùng enzyme protease để nghiên cứu cấu trúc protein, dùng enzyme endonuclease để nghiên cứu cấu trúc nucleic acid,… Ngồi ra, enzyme cịn dùng làm thuốc thử hóa phân tích Việc sử dụng enzyme để phân tích, định lượng chất 1.1 Cảm biến sinh học dựa enzyme Enzyme protein có khả xúc tác phản ứng hóa học với tốc độ tăng từ 105 đến 1017 lớn so với phản ứng không xúc tác (Hilvert, 2000) Các enzyme hoạt động cảm biến sinh học thường xúc tác phản ứng oxy hóa-khử Hiệu enzyme theo dõi nhiều phương pháp điện hóa khác nhau, điều làm cho chúng trở thành cảm biến sinh học lý tưởng Ví dụ, glucose oxidase, cảm biến sinh học sử dụng rộng rãi nhất, enzyme oxidoreductase chuyển điện tử từ glucose thành oxy phân tử Cảm biến sinh học glucose, Clark Jr and Lyons (1962) mô tả lần vào năm 1962, sử dụng enzyme glucose oxidase cố định để xác định nồng độ glucose thể Một ưu điểm việc sử dụng enzyme làm yếu tố nhận biết sinh học cơng nghệ cảm biến sinh học chúng có tính chọn lọc cao chất cụ thể lớp chất Ưu điểm thứ hai q trình chu chuyển xúc tác, enzyme tạo ion, proton, nhiệt, ánh sáng / điện tử, tất thông số đo (Subrahmanyam et al., 2002) 1.1.1 Cảm biến sinh học dựa vi chất lỏng liên tục Trong hai thập kỷ qua, hệ thống vi lỏng liên tục cải thiện Sự tiến to lớn nghiên cứu vi chất lỏng tăng cường nghiên cứu hệ thống sinh học từ phân tử đến sinh vật đa bào nhỏ Các thiết bị phân tích dựa enzyme bổ sung thêm khả tuyệt vời so với phương pháp thông thường phát hàm lượng nhỏ chất cần phân tích Do đó, cảm biến sinh học dựa enzyme dẫn đến giảm tiêu thụ thuốc thử, lượng, chất thải hơn, giảm chi phí tích hợp q trình hóa học sinh học tảng (Liu et al., 2010) Gần đây, cảm biến sinh học dựa vi lỏng liên tục sử dụng rộng rãi ứng dụng độc đáo khác như: hóa học sinh học hệ thống (Breslauer et al., 2006; Sato et al., 2008); sàng lọc sinh học phát thuốc (Hong et al., 2009); chuẩn đoán lâm sàng (Sato et al., 2008); thiết bị chăm sóc ứng dụng môi trường y sinh (Hong et al., 2009) Trong phần bên dưới, ví dụ cảm biến sinh học dựa vi lỏng liên tục sử dụng yếu tố nhận dạng sinh học khác minh họa Hình: Sơ đồ cảm biến sinh học dựa vi chất lỏng nanocompozit có chức lưỡng enzyme phát triển để phát cholesterol (Ali et al., 2013) Ví dụ, cảm biến sinh học dựa vi chất lỏng nanocompozit có chức lưỡng enzyme phát triển để phát cholesterol (Ali et al., 2013) Trong cơng trình này, ơng Ali cơng tích hợp thành cơng hai loại enzyme là cholesterol oxidase (ChOx) cholesterol esterase (ChEt) lên hạt nano niken oxit (nNiO) Sau đó, họ gắn chúng lên ống nano cacbon nhiều thành (MWCNTs) Tiếp đến, kết hợp với thiết bị phân tích quang phổ; quang điện tử tia X kỹ thuật hiển vi điện tử quét Con chip chế tạo sử dụng để đo thay đổi chronoamperometry có nồng độ cholesterol oleate khác (0,25 – 12,93 mM) Kết cho thấy mối quan hệ tuyến tính thay đổi chronoamperometric nồng độ cholesterol oleate Hệ thống tích hợp mang lại khả tái tạo cao, độ chọn lọc độ nhạy tuyệt vời 2.2mA/mM/cm2 - 1.1.2 Cảm biến sinh học dựa vi lỏng giọt Chất vi lỏng dựa giọt hệ thống quan trọng tích hợp với cơng nghệ cảm biến sinh học Gần đây, vi lỏng dựa giọt sử dụng rộng rãi tảng cho nhiều ứng dụng bao gồm môi trường, y sinh, an ninh quốc phịng với tính di động tốt lượng thấp Trong phần sau đây, ví dụ cảm biến sinh học dựa vi chất lỏng dạng giọt sử dụng yếu tố nhận dạng sinh học khác minh họa Hình: Sơ đồ (A) cảm biến sinh học điện hóa dựa giọt để theo dõi lượng đường cách sử dụng men glucose oxidase; (B) cảm biến điện hóa dựa giọt; (C) theo dõi glucose giọt (C) (Gu et al., 2014) Một ví dụ cảm biến điện hóa vi lỏng dựa giọt sử dụng vi điện cực đen Pt enzyme để phát glucose chứng minh (Gu et al., 2014) Phổ trở kháng điện hóa (EIS) đo vôn theo chu kỳ (CV) sử dụng để đo thay đổi dịng điện hóa q trình oxy hóa β- d -glucose, tạo sản phẩm phụ H2O2 Hệ thống cảm biến sinh học điện hóa dựa vi lỏng tích hợp cung cấp cảm biến glucose có độ nhạy cao chi phí thấp với phản ứng tuyến tính lên đến 43,5 mM 1.1.3 Hiệu cảm biến sinh học từ enzyme Các phương pháp tiêu chuẩn để xác định phát mục tiêu cụ thể tốn kém, tốn thời gian thiếu tính di động Sự tích hợp microfluidics cảm biến sinh học cung cấp công cụ mạnh mẽ để thay công cụ truyền thống cồng kềnh với khả hợp thành phần hóa học sinh học thành tảng Cảm biến sinh học coi cơng cụ phân tích mạnh mẽ có khả hữu ích cho nhiều ứng dụng khác nhau, từ phát thuốc, chẩn đốn y tế, an tồn thực phẩm, giám sát nông nghiệp môi trường, an ninh quốc phòng (Lindholm-Sethson et al., 2003) Cảm biến sinh học định nghĩa thiết bị phân tích (LindholmSethson et al., 2003; Subrahmanyam et al., 2002) kết hợp yếu tố nhận dạng nhạy cảm sinh học (Mohanty and Kougianos, 2006) cố định đầu dò hóa lý kết nối với máy dị để xác định diện nhiều chất phân tích cụ thể (Rasooly and Jacobson, 2006), nồng độ động học chúng mẫu Tính đặc hiệu tính chọn lọc cảm biến sinh học chủ yếu dựa đặc tính lực yếu tố nhận dạng sinh học Tín hiệu bắt nguồn từ tương tác chất cần phân tích yếu tố nhận biết sinh học sau chuyển đổi chuyển đổi thành số quang học điện (Turner, 2013) Mặt khác, công nghệ microfluidics cung cấp khả tuyệt vời để thực phân tích hoạt động phức tạp bao gồm sinh học hóa học hệ thống (Breslauer et al., 2006; Sato et al., 2008), sàng lọc sinh học khám phá thuốc (Fan et al., 2008) , chẩn đoán lâm sàng (Sato et al., 2008), phát chất độc khác (García-Alonso et al., 2009), thiết bị ứng dụng y sinh, môi trường nước phát triển phát triển (Yu et al., 2013) 1.2 Hệ thống phát quang sinh học từ Luciferase Luciferase loại enzyme tạo ánh sáng oxy hóa chất chúng Được tìm thấy tự nhiên đom đóm, vi sinh vật biển cạn phát sáng là: Gaussia princeps, Renilla reniformis, Click beetle luciferase 1.2.1 Luciferase với tư cách gene reporter thể sống Hình ảnh bước tạo ảnh phát quang sinh học thể sống (Doyle et al., 2004) Đầu tiên hình a: tế bào, tác nhân lây nhiễm gen đánh dấu enzyme luciferase Tiếp theo hình b: tế bào gen đánh dấu cấy vào sinh vật sống (ở chuột) Tiếp theo hình c: Chuột chụp ảnh máy ảnh có cảm biến (Charge Coupled Device) Cảm biến có tác dụng dùng để chuyển đổi hình ảnh quang học sang tín hiệu điện tử Cuối d: Dữ liệu thu được truyền qua phần mềm hình ảnh Để tiến hành nghiên cứu 1.2.2 Luciferase ứng dụng thực nghiệm Tế bào beta từ nguồn gốc acinar có khả ngăn chặn tình trạng tăng đường huyết cấy ghép động vật mắc bệnh tiểu đường Baeyens cộng 2009 tích hợp luciferase vào tế bào beta từ nguồn gốc acinar cấy vào thể chuột Việc làm giúp họ theo dõi tế bào sau cấy ghép chuột mắc bệnh tiểu đường để quan sát phục hồi đường huyết vật 36 ngày Đặt biệt, họ luciferase khơng có ảnh hưởng tiêu cực đến tế bào 1.3 Một số enzyme để định lượng chất 1.3.1 Malate dehydrogenase (MDH) Người ta dùng enzyme malate dehydrogenase 𝑁𝐴𝐷 + để xác định malicacid (có nhiều nho, rau, quả) - Nguồn gốc: Enzyme xuất nhiều sinh vật bao gồm mô động vật thực vật vi sinh vật Là thành phần chu trình axit xitric, tìm thấy với lượng lớn ti thể phân tử - Cấu trúc: Malate dehydrogenase enzyme đa phân tử bao gồm tiểu đơn vị giống hệt thường xếp dạng dimer tetramer Trọng lượng phân tử tiểu đơn vị khoảng 30–40 kDa Mỗi tiểu đơn vị thực phản ứng xúc tác cách độc lập Cấu trúc thứ cấp đơn vị chứa đường trục song song beta bao bọc vòng xoắn alpha lớn Đối diện với phối tử liên kết natri, vòng xoắn alpha hướng điểm chung, ba vòng bên xương sống beta Các vòng xoắn alpha tạo thành rãnh nhỏ để đồng yếu tố 𝑁𝐴𝐷 + gắn vào gần beta Cấu trúc gần giống với phân loại alpha/beta xen kẽ Đối với cấu trúc 3D, enzyme tạo thành loại kẽ hở để chất liên kết Hình Cấu trúc enzyme Malate dehydrogenase (MDH) - Cơ chế: MDH xúc tác thuận nghịch q trình oxy hóa L-malate thành oxaloacetate cách sử dụng 𝑁𝐴𝐷 + làm chất điện tử 𝑁𝐴𝐷 + nhận ion hydride bị khử thành NADH L-malate + 𝑁𝐴𝐷 + MDH Oxaloacetate + NADH + 𝐻 + Trong trình chuyển đổi malate thành oxaloacetate, thay đổi cấu trúc quan trọng xảy liên kết chất “vịng lặp” lật để chặn vị trí hoạt động khỏi dung môi Khi điều xảy ra, chất cặn khác vị trí hoạt động đưa đến gần chất phép chuyển đổi Arg102 Arg109 tham gia vào q trình lật vịng bất biến Sau lật vịng, phức hợp malate ổn định thông qua liên kết hydro trước chấp nhận chuyển proton từ NAD để tạo thành oxaloacetate 1.3.2 Isocitrate dehydrogenase (IDH) Người ta sử dụng enzyme isocitrate dehydrogenase để xác định isocitric acid - Nguồn gốc: Vi khuẩn Escherichia coli - Cấu trúc: Isocitrate dehydrogenase phân loại cấu trúc alpha beta Thành phần thứ cấp chủ yếu bao gồm xoắn alpha beta xếp thành cấu trúc bánh sandwich alpha beta alpha ba lớp Toàn protein bao gồm hai cấu trúc bánh sandwich cạnh quay hướng ngược Sau đó, điều làm cho hai vị trí hoạt động protein đối mặt với Trong isocitrate dehydrogenase người có tiểu đơn vị Hình Cấu trúc enzyme Isocitrate dehydrogenase (IDH) - Cơ chế: IDH phân tử phụ thuộc NADP xúc tác q trình khử carboxyl oxy hóa isocitrate để tạo α-Oxoglutarate CO2 với việc sản xuất đồng thời NADPH Bằng cách sử dụng cation kim loại hóa trị hai (Mg2+ Mn2+) chu trình axit tricacboxylic D-isocitrate + NADP+ 10 IDH 𝛼-Oxoglutarate + NADPH + CO2 + H+ 1.3.3 Enzyme Alcohol dehydrogenase (ADH) Hình Cấu trúc enzyme ADH Nguồn gốc: Ở động vật có vú, chúng có nhiều gan diện mức độ khác mô khác Nấm men (Saccharomyces) - Cấu trúc: Alcohol dehydrogenase chất homodimer Mỗi monome có 374 đvC với khối lượng phân tử 74000 dalton Có hai miền: Miền liên kết NAD+ bao gồm beta trung tâm gồm sợi bao quanh vòng xoắn alpha NAD + liên kết với đầu cuối C bảng beta Miền xúc tác có cấu trúc alpha / beta Giao diện miền tạo thành khe hở chứa vị trí xúc tác hoạt động Có hai cation 𝑍𝑛2+ monome, vị trí xúc tác bắt buộc xúc tác Chất rượu liên kết bên khe hở nơi có cation 𝑍𝑛2+ , vịng nicotinamide NAD+ tìm đường hướng vào khe hở Dimer hình thành với hai miền liên kết NAD+ đóng gói với cho trang beta trung tâm chúng kết hợp với để tạo thành trang beta 12 sợi Các miền xúc tác nằm hai đầu đối diện - Vai trò: Dùng để định lượng ethanol máu Ngồi phương pháp bình thường, người ta cịn dùng enzyme ADH để xác định ethanol - Cơ chế: Oxy hóa ethanol thành acetaldehyde, chuyển đổi NAD+ thành dạng khử NADH Phản ứng xảy sau: Ethanol + NAD+ 11 ADH Acetaldehyde + NADH + H+ 1.3.4 Enzyme Urease Hình Cấu trúc enzyme Urease - Nguồn gốc: Urease tìm thấy nhiều vi khuẩn, nấm, tảo, thực vật, số động vật không xương sống, cịn tồn đất Chẳng hạn Urease có Vi khuẩn Helicobacter pylori, vi khuẩn Bacillus pasteri, vi khuẩn Kebsiella aerogenes; đậu nành, đậu rựa - Cấu trúc: Urease thực vật tạo thành từ polypeptite chuỗi đơn trái ngược với urease vi khuẩn, bao gồm hai ba polypeptite ký hiệu alpha, beta gamma Vị trí hoạt động urease thực vật tương tự urease vi khuẩn, bao gồm trung tâm với ion Niken, cách khoảng cách 3,7 Å - Vai trò: Người ta dùng enzyme urease để định lượng urea máu nước tiểu - Cơ chế: Xúc tác trình thủy phân urea thành amoniac carbon dioxide, thủy phân liên kết C-N Phản ứng xảy sau: Urease (𝑁𝐻2 )2 𝐶𝑂 + H2 O α-oxoglutarate + NADH + NH4+ 2NH3 + CO2 GLDH L-glutamate + NAD+ + H2O Sau đó, amoniac tác dụng với α-oxoglutarate NADH tác dụng enzyme Glutamate dehydrogenase (GLDH) tạo NAD+ Sự giảm mật độ quang NADH theo thời gian tỉ lệ với nồng độ urea mẫu bệnh phẩm bước sóng 340 nm 12 1.3.5 Sulfite oxidase Hình Cấu trúc enzyme Sulfite oxidase - Nguồn gốc: Enzyme có ty thể tất sinh vật nhân thực - Cấu trúc: Là homodimer, sulfite oxidase chứa hai tiểu đơn vị giống hệt với miền đầu cuối N miền đầu cuối C Hai miền nối với mười axit amin tạo thành mạch vòng - Vai trò: Sufite xác định enzyme năm 1983 Enzyme ứng dụng để định lượng sulfite thực phẩm sulfite oxidase - Cơ chế: Oxy hóa sulfite thành sulfate với có mặt sulfite oxidase để giải phóng hydro peroxit thời điểm SO32- + O2 + H2O H2O2 + NADH + H+ Sulfite oxidase NADH-peroxidase SO42- + H2O2 H2O + NAD+ Khử hydro peroxit chuyển NADH thành NAD+ với có mặt NADH-peroxidase Việc chuyển đổi NADH thành NAD+ xác định quang phổ tỷ lệ với nồng độ sulfite 13 Điện cực có enzyme cố định Các enzyme cố định ln có đóng góp quan trọng phân tích Một ví dụ điển hình điện cực có mang enzyme cố định, điện cực cho phép kiểm tra liên tục hàm lượng nhỏ chất 2.1 Nguyên tắc cấu tạo hoạt động Thành phần cấu tạo sinh học điện cực enzyme, cố định bề mặt điện cực, đáp ứng với nồng độ chất, sản phẩm phản ứng enzyme xúc tác Enzyme lớp gel (enzyme khơng tan giữ gel) mỏng bao xung quanh cảm biến điện hóa tiếp xúc với cảm biến nhờ màng thấm chọn lọc Cơ chất qua lớp gel hay màng chọn lọc, tiếp xúc với enzyme chuyển hóa thành sản phẩm Ví dụ: phản ứng oxi hóa-khử chất oxidoreductase xúc tác, điện tử phản ứng vận chuyển từ chất phản ứng đến điện cực, tạo tín hiệu điện Tín hiệu điện phát cách đo dòng điện (amperometric biosensor), đo điện (potentiometric biosensor) 2.2 Một số ví dụ về ứng dụng điện cực enzyme để phân tích chất: Điện cực enzyme dùng để xác định nồng độ nhiều chất khác như: glucose, số acid hữu (acid acetic, acid pyruvic, acid lactic, acid fomic,…) amino acid, lipid, penicillin, alcohol, … số biosensor ứng dụng lâm sàng, glucose biosensor ứng dụng rộng rãi để xác định glucose máu Ví dụ: Điện cực urea Hình Điện cực urea có mang enzyme urease cố định lớp gel gắn kèm với điện cực thủy tinh 14 Trong điện cực urea, urease cố định phân hủy urea thành ion mà mà dị nhờ kỹ thuật điện hóa học chuẩn III KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN - Các lĩnh vực ứng dụng công nghệ enzyme ngày trở nên rộng rãi hàng năm - Do thay đổi đáng kể đặc tính enzyme cách tiến hóa có định hướng xáo trộn gen, phương pháp hiệu để sàng lọc enzyme mơi trường Như trình bày trên, số ứng dụng đáng ý enzyme đáng ý enzyme phân tích hóa học, thực phẩm, điện cực làm rõ Hầu hết thiết bị có enzyme cố định hạt thành kênh vi lỏng, số sử dụng enzyme hòa tan để thực phản ứng hệ vi lỏng Ngoài hệ thống mơ hình với glucose oxidase, peroxidase phosphatase kiềm lĩnh vực ứng dụng vi phản ứng phân hủy protein phản ứng chuỗi polymerase phân tích tự động vật liệu di truyền proteomic Các vi phản ứng enzyme tạo điều kiện cho việc xác định đặc điểm hoạt động enzyme chức nồng độ chất cho phép sàng lọc nhanh chất xúc tác sinh học chất chúng Ứng dụng cơng nghệ enzyme phân tích lĩnh vực hứa hẹn tương lai Về mặt nghiên cứu, chúng ứng cử viên tìm cho kỹ thuật sinh học, nghiên cứu y sinh, chẩn đoán điểm chăm sóc, giám sát mơi trường nơng nghiệp Về mặt kinh tế, công nghệ enzyme mở hướng “xanh bền vững’ tiết kiệm chi phí đáng kể so với phương pháp hóa học, vật lý - Hướng phát triển enzyme tương lai: Tạo nguồn enzyme có chất lượng cao theo quy mơ cơng nghiệp Phát triển ngày nhiều enzyme giới vi sinh vật Hoàn thiện phương pháp thu nhận, tinh enzyme theo quy mô công nghiệp Mở rộng ứng dụng enzyme nhiều lĩnh vực kĩ thuật tinh vi 15 BẢNG TỔNG HỢP CÁC ENZYME TÊN ENZYME NGUỒN GỐC CƠ CHẾ VAI TRÒ Kết hợp với thiết bị Cholesterol oxidase (3β- phân tích quang Vi sinh vật: hydroxysterol oxidase) xúc phổ, quang điện tử Cholesterol Mycobacterium, tác q trình oxy hóa tia X kỹ thuật oxidase Brevibacterium, cholesterol (cholest-5-en-3β- hiển vi điện tử quét Streptomyces, Bacillus ol) thành cholestenone để đo glucose (cholest-4-en-3-one) oxidase Kết hợp với thiết bị Cholesterol esterase Cholesterol esterase ester cholesterol Thế nhóm –OH (hydroxyl) nhóm – O – alkyl gây biến đổi cholesterol phân tích quang phổ, quang điện tử tia X kỹ thuật hiển vi điện tử quét để đo glucose oxidase Kết hợp với phổ Glucose oxidase Nấm Aspergillus niger, Xúc tác q trình oxy hóa β- điện hóa (EIS) Nấm Penicillium d –glucose thành axit phổ đo vôn theo glaucum gluconic chu kỳ (CV) đo glucose máu Đom đóm, Gaussia Luciferase princeps, Renilla reniformis, Click beetle luciferase Malate dehydrogenase (MDH) 16 Xuất hầu hết sinh vật bao gồm mô động vật ,thực vật vi sinh vật Trong ti thể phân tử Cấy vào tế bào, Luciferase oxy hóa chất giúp xét nghiệm chúng tạo phát quang dựa phát quang sinh học sinh học tể sống Oxy hóa L-malate thành oxaloacetate cách sử dụng 𝑁𝐴𝐷 + làm chất điện tử 𝑁𝐴𝐷 + bị khử thành NADH Định lượng malic acid có nhiều nho, rau, Isocitrate dehydrogenase (IDH) Vi khuẩn Escherichia coli Alcohol dehydrogenase Gan động vật có vú Nấm men (Saccharomyces) Sufite oxidase NADH-peroxidase Urease Glutamate dehydrogenase 17 Ty thể sinh vật nhân thực Enterococcus faecalis Vi khuẩn (Bacillus pasteurii, Kebsiella aerogenes, Helicobacter pylori ) Thực vật (Đậu nành) Chủ yếu gan, thận tim, với hàm lượng thấp não, xương bạch cầu Oxy hóa isocitrate để tạo α-Oxoglutarate 𝐶𝑂2với việc sản xuất đồng thời NADPH Xúc tác phản ứng oxy hóa Ethanol thành Acetaldehyde, chuyển đổi NAD+ thành dạng khử NADH Oxy hóa sulfite thành sulfate giải phóng H2O2 Khử H2O2 chuyển NADH thành NAD+ Phân hủy urea thành NH4+ HCO3- Xúc tác trình thủy phân urea thành amoniac carbon dioxide Oxy hóa NADH thành NAD+ Định lượng isocitric acid nước trái Định lượng Ethanol máu Định lượng sulfite thực phẩm Tham gia trình định lượng sulfite thực phẩm Enzyme cố định điện cực urea để xác định hàm lượng urea Định lượng urea máu nước tiểu Tham gia trình định lượng urea máu nước tiểu TÀI LIỆU THAM KHẢO - Ali, M.A., Srivastava, S., Solanki, P.R., Reddy, V., Agrawal, V V, Kim, C., John, R., Malhotra, B.D., 2013 Highly efficient bienzyme functionalized nanocomposite-based microfluidics biosensor platform for biomedical application Sci Rep 3, 1–9 - Baeyens, L., Bonné, S., Bos, T., Rooman, I., Peleman, C., Lahoutte, T., German, M., Heimberg, H., Bouwens, L., 2009 Notch Signaling as Gatekeeper of Rat Acinar-to-β-Cell Conversion in Vitro Gastroenterology 136, 1750-1760.e13 https://doi.org/https://doi.org/10.1053/j.gastro.2009.01.047 - Berge, B., Peseux, J., 2000 Variable focal lens controlled by an external voltage: An application of electrowetting Eur Phys J E 3, 159–163 - Breslauer, D.N., Lee, P.J., Lee, L.P., 2006 Microfluidics-based systems biology Mol Biosyst 2, 97–112 - Clark Jr, L.C., Lyons, C., 1962 Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery Ann N Y Acad Sci 102, 29–45 - Couillard-Despres, S., Finkl, R., Winner, B., Ploetz, S., Wiedermann, D., Aigner, R., Bogdahn, U., Winkler, J., Hoehn, M., Aigner, L., 2008 In vivo optical imaging of neurogenesis: watching new neurons in the intact brain Mol Imaging 7, 2008–7290 - Doyle, T.C., Burns, S.M., Contag, C.H., 2004 Technoreview: In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection Cell Microbiol 6, 303–317 - Fan, X., White, I.M., Shopova, S.I., Zhu, H., Suter, J.D., Sun, Y., 2008 Sensitive optical biosensors for unlabeled targets: A review Anal Chim Acta 620, 8–26 - García-Alonso, J., Greenway, G.M., Hardege, J.D., Haswell, S.J., 2009 A prototype microfluidic chip using fluorescent yeast for detection of toxic compounds Biosens Bioelectron 24, 1508–1511 - Gu, S., Lu, Y., Ding, Y., Li, L., Song, H., Wang, J., Wu, Q., 2014 A droplet-based microfluidic electrochemical sensor using platinum-black microelectrode and its application in high sensitive glucose sensing Biosens Bioelectron 55, 106–112 18 Hilvert, D., 2000 Critical analysis of antibody catalysis Annu Rev Biochem 69, 751–793 - Hong, J., Edel, J.B., Demello, A.J., 2009 Micro-and nanofluidic systems for high-throughput biological screening Drug Discov Today 14, 134–146 - Hsieh, C.L., Xie, Z., Liu, Z.Y., Green, J.E., Martin, W.D., Datta, M.W., Yeung, F., Pan, D., Chung, L.W.K., 2005 A luciferase transgenic mouse model: visualization of prostate development and its androgen responsiveness in live animals J Mol Endocrinol 35, 293–304 https://doi.org/10.1677/JME.1.01722 - Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T., 2014 Bioluminescence Imaging Compr Biomed Phys 4, 245–256 https://doi.org/10.1016/B978-0-444-53632-7.00418-4 - Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T., 2012 Bioluminescence imaging: looking beyond the light Trends Mol Med 18, 164–172 - Lindholm-Sethson, B., Nyström, J., Geladi, P., Koeppe, R., Nelson, A., Whitehouse, C., 2003 Are biosensor arrays in one membrane possible? A combination of multifrequency impedance measurements and chemometrics Anal Bioanal Chem 377, 478–485 - Liu, K.-K., Wu, R.-G., Chuang, Y.-J., Khoo, H.S., Huang, S.-H., Tseng, F.-G., 2010 Microfluidic systems for biosensing Sensors 10, 6623–6661 - Luka, G., Ahmadi, A., Najjaran, H., Alocilja, E., DeRosa, M., Wolthers, K., Malki, A., Aziz, H., Althani, A., Hoorfar, M., 2015 Microfluidics integrated biosensors: A leading technology towards lab-on-a-chip and sensing applications Sensors 15, 30011–30031 - Mohanty, S.P., Kougianos, E., 2006 Biosensors: A tutorial review Ieee Potentials 25, 35–40 - Rasooly, A., Jacobson, J., 2006 Development of biosensors for cancer clinical testing Biosens Bioelectron 21, 1851–1858 - Riggs, P., 2013 Fusion Protein Brenner’s Encycl Genet Second Ed 134–135 https://doi.org/10.1016/B978-0-12-374984-0.00565-9 - Sato, K., Mawatari, K., Kitamori, T., 2008 Microchip-based cell analysis and clinical diagnosis system Lab Chip 8, 1992–1998 - Srinivasan, V., Pamula, V., Pollack, M., Fair, R., 2003 A digital microfluidic biosensor for multianalyte detection, in: The Sixteenth Annual International Conference on Micro Electro Mechanical Systems, 2003 MEMS-03 Kyoto IEEE IEEE, pp 327–330 19 - Subrahmanyam, S., Piletsky, S.A., Turner, A.P.F., 2002 Application of natural receptors in sensors and assays Anal Chem 74, 3942–3951 - Thorne, N., Inglese, J., Auld, D.S., 2010 Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology Chem Biol 17, 646–657 - Turner, A.P.F., 2013 Biosensors: sense and sensibility Chem Soc Rev 42, 3184–3196 - Vergauwe, N., Witters, D., Ceyssens, F., Vermeir, S., Verbruggen, B., Puers, R., Lammertyn, J., 2011 A versatile electrowetting-based digital microfluidic platform for quantitative homogeneous and heterogeneous bio-assays J Micromechanics Microengineering 21, 54026 - Yu, Y., Chen, J., Zhou, J., 2013 Parallel-plate lab-on-a-chip based on digital microfluidics for on-chip electrochemical analysis J Micromechanics Microengineering 24, 15020 Công nghệ Enzyme, Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh năm 2012 H.J Edenberg, W.F Bosron, Alcohol Dehydrogenases, Comprehensive Toxicology, Volume 10, 2018, Pages 126-145 Nghiên cứu thu nhận urease từ đậu nành,123doc Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9519-2:2016 (EN 1988-2:1998) Thực phẩm - Xác định sulfit - Phần 2: Phương pháp enzyme Tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chun ngành Hóa sinh”, Bộ Y Tế, Năm 2014 - Molecular Dynamics Study of Helicobacter pylori Urease, Mona S Minkara, Melek N Ucisik, and Kenneth M Merz, Jr - Peroxidase(s) in Environment Protection, Neelam Bansal and Shamsher S Kanwar - Malate dehydrogenase_Wikipedia - Malate dehydrogenase_ScienceDirect - Function, kinetic properties, crystallization, and regulation of microbial malate dehydrogenase, PMC Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ - 20 Isocitrate Dehydrogenase_Wikipedia - Structure of the Monomeric Isocitrate Dehydrogenase: Evidence of a Protein Monomerization by a Domain Duplication_ScienceDirect 21 - Structure, Kinetic, and Chemical Mechanism of Isocitrate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis, PMC Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ - PGS.TS Đỗ Quý Hai , Công nghệ enzyme ứng dụng, Đại học Huế ... THIỆU VỀ ENZYME ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG PHÂN TÍCH HĨA HỌC II Việc sử dụng enzyme để phân tích, định lượng chất 1. 1 Cảm biến sinh học dựa enzyme 1. 1 .1 Cảm biến... tích Việc sử dụng enzyme để phân tích, định lượng chất 1. 1 Cảm biến sinh học dựa enzyme Enzyme protein có khả xúc tác phản ứng hóa học với tốc độ tăng từ 10 5 đến 10 17 lớn so với phản ứng không xúc... tác enzyme, định tính đặc hiệu) + Coenzyme: phần khơng phải protein (trực tiếp tham gia vào phản ứng enzyme) , chất hợp chất hữu phức tạp II ỨNG DỤNG CỦA ENZYME TRONG PHÂN TÍCH HĨA HỌC Enzyme ứng