KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY DÓ TRẦM (Aquilaria crassna Pierre) BẰNG NUÔI CẤY MÔ Lê Văn Thành, Nguyễn Thị Hiền, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam TÓM TẮT Kết nghiên cứu nhân giống vơ tính Dó trầm cơng nghệ mơ hom cho thấy biện pháp kỹ thuật có triển vọng Trong nghiên cứu nuôi cấy mô: a) môi trường tối ưu cho giai đoạn nhân nhanh chồi in vitro mơi trường MTBS có bổ sung tổ hợp (0,2 mg/l BAP + 0,25 mg/l kinetin + 0,25 mg/l adenin), hệ số nhân đạt 14,6 chồi; b) mơi trường thích hợp giai đoạn tạo rễ in vitro môi trường: 3/4 WPM + 0,1 mg/l BAP, bổ sung thêm 0,25 mg/l IBA + 0,25 mg/l NAA, tỷ lệ rễ đạt 60,2%; c) Điều kiện hoá in vitro vườn ươm chọn sau: đưa ngồi phịng thí nghiệm –7 ngày, trước trồng vào bầu đất trộn xơ dừa theo tỷ lệ : 1, cần huấn luyện bể cát giâm khoảng tuần cho phát sinh rễ mới, tỷ lệ sống đạt 54,3% Trong nghiên cứu công nghệ mô – hom kết hợp, thực nghiệm bước đầu cho thấy khả rễ Dó trầm in vitro phương pháp giâm hom cao so với quy trình rễ ni cấy mơ, tỷ lệ hom rễ thành đạt 67,3% Từ khố: Ni cấy mơ, giâm hom, Dó trầm ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Dó trầm (Aquilaria crassna Pierre.) cịn có tên gọi Dó bầu, Dó, Trầm hương, Tóc Những năm gần đây, Dó trầm gây trồng nhiều số tỉnh thuộc Bắc Trung Bộ Nam Trung Bộ tỉnh Hà Tĩnh, Quảng Nam, Mục đích việc trồng Dó trầm để tạo tinh dầu trầm hương Các sản phẩm người biết tới từ xa xưa có nhiều cơng dụng: Trong y học cổ truyền dùng làm thuốc chữa trị chứng bệnh đau ngực, hen suyễn, khó thở, cảm hàn, đau bụng, lợi tiểu, trợ tim, thấp khớp, Trong công nghiệp mỹ phẩm dùng làm chất định hương, chế biến loại dầu thơm, nước hoa cao cấp, Trong tín ngưỡng dùng làm hương nhang nến đốt dịp lễ Tết, dùng hoả táng ướp xác người cố, người theo Đạo Hồi dùng tinh dầu trầm xịt lên người vào ngày lễ hội Tuy nhiên, trồng rừng hầu hết địa phương sử dụng nguồn giống Dó trầm khơng tuyển chọn, giống trồng gieo ươm từ hạt khơng chọn lọc Do đó, sinh trưởng Dó trầm suất chất lượng tinh dầu trầm đạt chưa cao Vì vậy, nghiên cứu cải thiện giống Dó trầm đáp ứng mục đích tạo nguồn giống cho suất chất lượng tinh dầu cao biện pháp chọn trội nhân giống nuôi cấy mô cần thiết Biện pháp cung cấp nguồn giống bảo đảm chất lượng di truyền lấy từ trội, tạo giống có suất, chất lượng cao, cho thu hoạch nhanh hơn, đáp ứng nhu cầu cải thiện giống sản xuất mà tăng nhanh hệ số nhân giống VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu: chồi đỉnh sinh trưởng, chồi nách Dó trầm 10 năm tuổi Môi trường sử dụng nuôi cấy: môi trường MS (Murashige Skoog, 1962); môi trường WPM (McCown Lloyed, 1981); môi trường bổ sung (MTBS) kết hợp MS WPM gồm có: thành phần đa lượng mơi trường MS + thành phần vi lượng môi trường WPM + Sắt Vitamin (thành phần giống hai môi trường MS WPM) Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Nuôi trồng Khai thác đặc sản rừng, Trung tâm Nghiên cứu Lâm đặc sản, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Các giai đoạn nghiên cứu tiến hành từ chọn mẫu khử trùng đến giai đoạn giống xuất vườn Phƣơng pháp nghiên cứu Các bước nghiên cứu tiến hành theo sơ đồ sau: Chọn mẫu Cho bầu đất Tạo nhân nhanh chồi Khử trùng mẫu nuôi cấy Huấn luyện in vitro Tạo rễ in vitro Giâm hom chồi in vitro Chồi in vitro - Chọn mẫu: Hom thân cành non tuyển chọn từ chồi đỉnh sinh trưởng chồi nách Dó trầm sinh trưởng, phát triển tốt bệnh trội 10 năm tuổi Mẫu cắt dài từ 7cm đến 10cm Chọn mẫu vào mùa khô - Khử trùng mẫu nuôi cấy: Mẫu đem khử trùng dài khoảng - 4cm (2 – đốt thân), cắt bỏ lá, chừa 11,5cm từ cuống Rửa mẫu sạch, để nước Khử trùng sơ cồn 70 o phút rửa lại nước cất vô trùng lần Tiếp theo, khử trùng mẫu HgCl2 14 phút Rửa lại mẫu lần nước vô trùng Cắt bỏ phần mô chết, cấy vào môi trường nuôi cấy chuẩn bị sẵn ống nghiệm (Chú ý: thao tác làm box cấy vô trùng) Bố trí thí nghiệm: cấy mẫu/ ống nghiệm, lặp lại lần, 20 ống nghiệm/1 lần lặp, thí nghiệm bố trí phịng để ngẫu nhiên - Tạo nhân nhanh chồi: Tiến hành nghiên cứu tổ hợp chất BAP, kinetin adenin bổ sung vào MTBS + đường (30 g/l) nước dừa (10% v/v) tiến hành thí nghiệm theo cơng thức sau: CT 1: MTBS + 0,25 mg/l BAP; CT 2: MTBS + 0,25 mg/l BAP + 0,25 mg/l kinetin; CT 3: MTBS + 0,25 mg/l BAP + 0,25 mg/l adenin; CT 4: MTBS + 0,25 mg/l BAP + 0,25 mg/l kinetin + 0,25 mg/l adenin, lặp lại lần/thí nghiệm [Thí nghiệm 1] - Tạo rễ in vitro: giai đoạn chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh chồi sang môi trường tạo rễ để có hồn chỉnh + Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần môi trường đến trình tạo rễ chồi in vitro, tiến hành thí nghiệm cơng thức [1/2 MS, 1/2 WPM, 1/2 MTBS, 3/4 MS, 3/4 WPM, 3/4MTBS, MS, WPM, MTBS], lặp lại lần với 10 mẫu/CT/lặp [Thí nghiệm 2] + Cấy chồi in vitro môi trường chọc lọc thí nghiệm 3/4 WPM bổ sung 0,1 mg/l BAP chất thuộc nhóm Auxin (gồm IAA, ABA NAA nồng độ 0,1; 0,5 mg/l), lặp lại lần với 10 mẫu/CT/lặp [Thí nghiệm 3] + Cấy chồi in vitro môi trường chọn lọc thí nghiệm 3/4 WPM bổ sung 0,1 mg/l BAP bổ sung tổ hợp nhóm auxin là: 0,25mg/l IAA + 0,25mg/l IBA; 0,25mg/l IBA + 0,25mg/l NAA; 0,25mg/l IAA + 0,25mg/l NAA Thí nghiệm lặp lại lần, 10 mẫu/CT/lặp [Thí nghiệm 4] - Đưa in vitro bầu đất: nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống in vitro, đề tài sử dụng phương pháp: PP1- trồng in vitro trực tiếp vào bầu đất với thành phần đất: xơ dừa (3:1) PP2- trồng bể cát phủ nilon trắng cho hệ rễ in vitro ổn định (sau khoảng tuần) in vitro phát sinh mầm rễ trồng vào bầu đất [Thí nghiệm 5] - Giâm hom chồi in vitro: đưa chồi in vitro khỏi môi trường ống nghiệm, rửa môi trường chấm vào thuốc bột giâm hom IBA, nồng độ 1500ppm, cấy vào bể cát vườn ươm, chăm sóc phương pháp giâm hom thông thường, bố trí thí nghiệm 30 mẫu/lần, lần lặp lại [Thí nghiệm 6] Mùa vụ giâm hom chồi in vitro tiến hành vào thời điểm cuối hè, đầu đông - Chuyển hom bầu đất: Khi hom giâm giá thể rễ thứ cấp, có màu vàng cấy chuyển hom bầu đất kích thước 7x12cm - Kỹ thuật chăm sóc in vitro: + Che bóng: ban đầu che bóng 50% khoảng tuần, sau giảm dần dở bỏ hồn tồn + Tưới nước: tưới dạng phun sương nhiều lần tuần đầu (3 - lần/ngày) sau đó, tưới lần/ngày (những ngày nắng nóng tưới lần/ngày vào sáng sớm chiều mát) + Bón thúc: bón thúc phân NPK 0,3% tuần lần Sau bón thúc phải tưới lại nước lã để rửa phân bám KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Tiến hành chọn lọc chồi khoẻ, ổn định môi trường nuôi cấy đưa vào môi trường dinh dưỡng bố trí theo thí nghiệm Kết thí nghiệm tạo chồi in vitro sau tuần nuôi cấy thể bảng Bảng Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến hệ số nhân chồi in vitro Công thức Hệ số nhân chồi (chồi) Số TB Chiều cao TB (mm) Trạng thái chồi TB CV% TB CV% TB CV% CT 6.0 11.79 7.4 7.40 15.0 10.54 Chồi gầy, yếu CT 12.4 5.89 10.0 7.07 16.2 15.98 Chồi gầy CT 10.8 5.17 8.6 13.26 18.4 9.87 Bình thường CT 14.6 3.75 10.6 10.76 23.6 9.75 Bình thường Bảng cho thấy, kết hợp chất thuộc nhóm Cytokinin cho hệ số nhân chồi cao Ở công thức khác nhau, trạng thái chồi in vitro gần giống hình thái khả sinh trưởng, phát triển Kết cho thấy, hệ số nhân chồi cao CT 4, chồi phát triển đồng đều, thân mập, có khả nảy chồi tiếp (nếu tiếp tục cấy chuyển sang môi trường để tạo hệ số nhân tiếp theo) Môi trường tối ưu cho giai đoạn nhân nhanh chồi in vitro môi trường MTBS + đường (30 g/l) nước dừa (10% v/v) có bổ sung tổ hợp (0,2 mg/l BAP + 0,25 mg/l kinetin + 0,25 mg/l adenin) Với môi trường này, hệ số nhân đạt 14,6 chồi; chồi cao, khoẻ, phát triển tốt Tiếp tục tuyển chọn chồi khỏe, sinh trưởng phát triển tốt, có 10 – 12 thật tách riêng, cấy vào môi trường không bổ sung tổ hợp chất sinh trưởng Khi tiến hành thực nghiệm với mơi trường rễ Dó trầm in vitro, đề tài chuyển chồi môi trường rễ khác nhau; kết rễ không cao Để Dó trầm in vitro rễ tốt trước chuyển vào mơi trường rễ, chồi in vitro phải phát triển mạnh chiều cao thân Thực nghiệm nghiên cứu cho thấy: có chồi khoẻ mạnh, thân phát triển tốt có khả phát sinh mầm rễ Từ đó, đề tài nghiên cứu theo hai hướng: 1) rễ trực tiếp phịng thí nghiệm (tiếp tục phương pháp nuôi cấy mô); 2) giâm hom chồi in vitro (phương pháp mô – hom kết hợp) Tạo rễ in vitro phương pháp nuôi cấy mô Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần môi trường đến trình tạo rễ chồi in vitro, đề tài bố trí thí nghiệm theo thí nghiệm Sau tuần theo dõi, kết thu thể đồ thị 60 48.9 50 Tỷ lệ % rễ 40 30 26.7 20 10 8.9 13.3 26.7 26.7 17.8 20 15.6 1/2MS 1/2WPM 1/2MT BS 3/4MS 3/4WPM 3/4MT BS MS WPM MT BS Biểu đồ Biểu diễn tỷ lệ % rễ cơng thức mơi trƣờng khác Phân tích phương sai nhân tố cho kết F tính = 6,2 > F tra bảng = 2,5, điều chứng tỏ công thức khác cho tỷ lệ rễ khác Biểu đồ rõ mơi trường có khả phát sinh mầm rễ, tối ưu 3/4 WPM, đạt 48,9% Trong thực nghiệm, quan sát mơi trường cịn đầy đủ hàm lượng dinh dưỡng, in vitro sinh trưởng tốt chiều cao phát triển kém, môi trường giảm 1/2 hàm lượng dinh dưỡng in vitro khơng tăng trưởng mạnh chiều cao phát triển tạo nốt sần (mô sẹo) Trong trình sinh trưởng phát triển cây, Auxin tác động lên mầm rễ trạng thái ngủ trở nên hoạt động với cấu trúc khơng có mầm rễ Auxin kích thích hình thành rễ bất định từ lớp phloem Đề tài tiến hành nghiên cứu với môi trường chọn lọc thí nghiệm 3/4 WPM bổ sung 0,1 mg/l BAP chất thuộc nhóm Auxin (bố trí theo thí nghiệm 3) Theo dõi thí nghiệm sau tuần nuôi cấy, kết đưa bảng Bảng Ảnh hưởng chất thuộc nhóm Auxin đến trình tạo rễ in vitro Tỷ lệ % rễ Tỷ lệ % tạo mô sẹo Au Nồng độ (mg/l) TB CV% TB CV% 0,1 6.7 86.60 86.7 6.66 IAA 0,5 23.3 24.74 56.7 10.19 3.3 173.21 23.3 24.74 0,1 10.0 0.00 83.3 6.93 IBA 0,5 46.7 12.37 50.0 0.00 6.7 86.60 50.0 20.00 0,1 0.0 0.00 90.0 11.11 a - NAA 0,5 26.7 21.65 63.3 9.12 3.3 173.21 13.3 43.30 Bảng cho thấy nồng độ nhóm auxin tăng cao, khả tạo rễ thấp có độ biến động lớn (không đáng tin cậy) Kết nghiên cứu khả tạo rễ IAA nhất, mơi trường có hàm lượng IBA tỷ lệ rễ đạt cao so với chất khác nồng độ Tuy nhiên, hệ số rễ tương đối thấp, với nồng độ IBA 0,5 mg/l cho thấy sinh trưởng tốt cho tỷ lệ rễ cao (46,7%) Qua theo dõi nghiên cứu thí nghiệm ni cấy in vitro Dó trầm so với số loài khác keo lai, bạch đàn…, đề tài nhận thấy Dó trầm lồi có phần cịn nhiều hạn chế q trình ni cấy in vitro Để tìm hiểu khả kết hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin đến khả tạo rễ Dó trầm in vitro, đề tài tiến hành thí nghiệm với hàm lượng 0,5 mg/l chia cho loại chất nhóm Auxin (bố trí theo thí nghiệm 4) Sau tuần theo dõi, thu kết biểu diễn biểu đồ 0,25mg/l IAA + 0,25mg/l IBA 70 0,25mg/l IBA + 0,25mg/l NAA 0,25mg/l IAA + 0,25mg/l NAA 60 60.2 50 40 47.7 30 31.8 31.8 31.8 38.6 20 10 T ỷ lệ % rễ T ỷ lệ % t ạo mô sẹo Biểu đồ Biểu diễn ảnh hƣởng hàm lƣợng auxin đến khả rễ chồi in vitro Trong nghiên cứu nuôi cấy mô, thành phần môi trường bản, hàm lượng chất sinh trưởng quan trọng thích hợp với lồi khác Với Dó trầm, sử dụng độc lập loại chất kích thích sinh trưởng nhóm cho hiệu thấp, nhóm chất Cytokinin, phối hợp chất BAP, Kinetin adenin cho tỷ lệ nhân chồi cao với nhóm Auxin tương tự Biểu đồ cho thấy khác biệt việc phối hợp tỷ lệ 0,5 mg/l cho IBA NAA cho kết cao hẳn so với sử dụng 0,5 mg/l IBA, cụ thể môi trường nuôi cấy bổ sung 0,5 mg/l IBA cho tỷ lệ rễ 46,7% sử dụng kết hợp 0,25 mg/l IBA + 0,25 mg/l NAA cho tỷ lệ rễ đạt 60,2% Mơi trường thích hợp giai đoạn tạo rễ in vitro môi trường: 3/4 WPM + 0,1 mg/l BAP, bổ sung thêm 0,25 mg/l IBA + 0,25 mg/l NAA Giai đoạn cuối quy trình ni cấy mơ đưa in vitro từ phịng thí nghiệm ngồi vườn ươm Giai đoạn bước định khả ứng dụng toàn q trình ni cấy in vitro vào thực tiễn sản xuất Đây giai đoạn in vitro chuyển từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng có nghĩa sống từ mơi trường nhân tạo ngồi mơi trường tự nhiên bên ngồi có nhiều yếu tố biến động nhiệt độ, thời tiết, đất đai, sâu bệnh, Chính thay đổi đột ngột điều kiện sống nên gây không khó khăn việc đưa in vitro ngồi mơi trường đất Để giảm khó khăn này, đề tài thí nghiệm mang bình mẫu khỏi phịng ni trước đưa vườn ươm khoảng từ – ngày Sau đó, tiến hành lấy khỏi bình, rửa lớp thạch chất điều hòa sinh trưởng bám vào rễ in vitro, sau cấy vào bầu đất Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống in vitro, đề tài bố trí theo thí nghiệm Sau tuần đưa in vitro ngoài, đề tài thu kết bảng Bảng Ảnh hưởng giá thể trồng Dó trầm in vitro ngồi vườn ươm Tỷ lệ % TB Thí nghiệm Tỷ lệ % sống CV% sống PP 30.0 36.7 20.0 PP2 60.0 56.7 53.3 F tính = 37 56.7 PTPS 23.3 16.7 26.7 13.3 29.0 21.69 36.7 56.7 40.0 F tra bảng = 54.3 16.52 LSD = 11.9 Kết phân tích phương sai cho thấy F tính = 37 > F tra bảng = 5, chứng tỏ phương pháp thử nghiệm cho tỷ lệ % sống sót khác rõ rệt Chỉ số LSD = 11,9