(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu giám định một số loài giổi ăn hạt (michelia spp ) ở việt nam bằng chỉ thị hình thái và phân tử​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP TRẦN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ LOÀI GIỔI ĂN HẠT (Micheliaspp.) Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC M SỐ 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS VŨ QUANG NAM PGS TS BÙI VĂN THẮNG Hà Nội – 2018 download by : skknchat@gmail.com i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tôi, hướng dẫn khoa học giảng viên PGS.TS Vũ Quang Nam PGS.TS Bùi Văn Thắng – Viện Công nghệ sinh học trường Đại học Lâm nghiệp Các nội dung nghiên cứu, kết nêu đề tài trung thực chưa công bố nghiên cứu khác Luận văn sử dụng thông tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu nội dung nghiên cứu trùng lặp với cơng trình nghiên cứu khác cơng bố, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm tuân thủ kết luận đánh giá luận văn hội đồng khoa học N i g y th g Người cam đoan Trần Thị Thu Hiền download by : skknchat@gmail.com ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập nghiên cứu trường Đại học Lâm nghiệp, thân l nh hội nhiều kiến thức qu báu nhận quan tâm, giúp đ từ phía nhà trường, gia đình bạn b đồng nghiệp Tơi xin gửi lời cảm n chân thành đến toàn th qu Thầy Cơ giáo trong, ngồi nhà trường, đến gia đình, bạn b đồng nghiệp ủng hộ, giúp đ , tạo điều kiện vật chất, tinh thần cho suốt thời gian vừa qua Luận văn tốt nghiệp hỗ trợ phư ng diện từ đề tài nghiên cứu khoa học c bản, tài trợ Quỹ Phát tri n khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), giai đoạn 2017 – 2020, Mã số: 106.03– 2017.16 PGS.TS Vũ Quang Nam làm Chủ trì với tên “Nghiên cứu giám định loài Giổi hạt Việt Nam (Michelia spp.) bằ g phươ g ph p hì h thái, phân tử v si h th i” Tôi xin chân thành cảm n giúp đ qu báu đó! Tơi xin bày tỏ lòng biết n sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Vũ Quang Nam PGS.TS Bùi Văn Thắng – Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp hướng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi giúp đ từ hình thành tưởng, trình thực hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học Đặc biệt, xin cảm n cô giáo Th.S Nguyễn Thị Hải Hà cô giáo Th.S Nguyễn Thị Th Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp trực tiếp hướng dẫn tơi thực thí nghiệm phân tử, phân tích số liệu đ luận văn hồn thành Mặc dù có nhiều cố gắng, đề tài nghiên cứu khoa học h n khơng tránh khỏi nh ng thiếu sót Kính mong nhận đóng góp kiến qu Thầy Cơ giáo, bạn b đồng nghiệp đ đề tài nghiên cứu khoa học tơi hồn thiện h n Tơi xin trân trọng cảm n! N i g y th g Học vi n Trần Thị Thu Hiền download by : skknchat@gmail.com iii MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii Đ T VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát đối tượng nghiên cứu Ng h h Ng (Magnoliaceae) (Magnolioideae)……………………………………5 1.1.3 Chi iổi (Michelia L.) Lo i iổi hạt (Michelia spp.) 1.2 Tổng quan DNA mã vạch (DNA barcode) 12 iới thiệu DNA ã vạ h 12 C đặ điể bả ủ trì h tự DNA ã vạ h…………………… 14 M t số o us đượ sử dụ g tro g phươ g ph p DNA ã vạ h thự vật 16 1.3 Một số DNA mã vạch sử dụng nghiên cứu thực vật 19 1.4 Một số thành tựu nghiên cứu DNA mã vạch thực vật 24 1.5 Một số nghiên cứu loài Giổi ăn hạt 25 M t số ghiê ứu go i ướ …………………………………… 25 M t số ghiê ứu Việt N 26 download by : skknchat@gmail.com iv Chƣơng NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Nội dung nghiên cứu 30 2.2 Vật liệu nghiên cứu 30 2.3 Hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu 31 ó 2.3 hất 31 2.3.2 Các thiết bị sử dụ g tro g ghiê ứu 32 2.4 Phư ng pháp nghiên cứu 33 2.4 hươ g ph p ghiê ứu hì h th i v vị trí ph 2.4 hươ g ph p ghiê ứu ph oại 33 tử 34 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Kết nghiên cứu giám định loài Giổi ăn hạt 39 3.1.1 Về ph oại v hệ thố g h thự vật hi iổi ………………………39 3.1.2 Đặ trư g bả hì h th i ủ 3.1.3 Đặ điể hì h th i bả ủ o i tro g hi iổi ………… 42 o i iổi hạt……………………42 3.1.4 Khóa tra phân loại cho m t số loài Giổi Việt Nam 52 3.2 Kết nghiên cứu giám định loài Giổi ăn hạt thị phân tử 53 3.2.1 Kết x 3.2.2 X đị h đoạ DNA ã vạ h ủ đị h v ph 3.2.3 X y dự g o i iổi hạt 53 tí h trì h tự u eotide ủ đoạ DNA ã vạ h 58 y ph t si h hủ g oại 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 Kết luận 71 Kiến nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO download by : skknchat@gmail.com v DANH MỤC BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết đầy đủ Từ viết tắt Bp base pair CBOL Consortium for the Barcode of Life CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ITS Internal Transcribed Spacer kb kilobase NCBI National Centre for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction PVP Polyvinyl pyrrolidone rDNA ribosome deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid Rnase Ribonuclease RUBISCO Rubilose – 1,5 – bisphosphate cacboxylase/oxygenase SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris – Acetic acid – EDTA TE Tris – Ethylenediaminetetraacetic acid UV Ultra Violet v/p vòng/phút VNTR Variable number tandem repeat RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms LSC Large single – copy region SSC Small single – copy region download by : skknchat@gmail.com vi DANH MỤC CÁC BẢNG T n bảng TT Trang 1.1 Phân bố số loài thuộc chi Giổi Việt Nam 2.1 Các mẫu Giổi ăn hạt Việt Nam nghiên cứu 30 2.2 Thành phần đệm tách A 31 2.3 Thành phần đệm tách B 32 2.4 Thành phần đệm TE (TE Buffer) 32 2.5 Trình tự thơng tin cặp mồi nghiên cứu 36 2.6 Thành phần phản ứng PCR 36 2.7 Chu kỳ phản ứng PCR 37 3.1 Kết đo hàm lượng độ mẫu DNA tổng số 54 Trình tự nucleotide gen atpB – rbcL phân lập từ mẫu Giổi ăn hạt 59 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen atpB – rbcL 3.3 mẫu Giổi ăn hạt với trình tự nucoleotide gen atpB – rbcL loài Michelia alba với mã số Genbank AB623323.1 61 Trình tự nucleotide gen trnH – psbA phân lập từ mẫu Giổi ăn hạt 62 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen trnH – psbA 3.5 mẫu Giổi ăn hạt nghiên cứu với trình tự nucoleotide gen trnH – psbA loài Magnolia insignis (KY921716.1) 63 3.2 3.4 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen trnL intron mẫu Giổi ăn hạt với trình tự nucoleotide gen trnL intron loài 3.6 Michelia champaca (AY009041.1), Michelia baillonii 64 (AY009042.1), Magnolia laevifolia (MF583748.1) 3.7 So sánh trình tự nucleotide gen trnL – trnF mẫu Giổi ăn hạt nghiên cứu download by : skknchat@gmail.com 66 vii DANH MỤC CÁC HÌNH TT 1.1 3.1A 3.1B Tên hình Cây Giổi xanh rừng tự nhiên Kon Hà Nừng Gia Lai Một phần Phylogeny hình thái th mối quan hệ phát sinh loài Michelia Một phần Phylogeny phân tử (ndhF sequences) th mối quan hệ phát sinh loài Michelia Trang 10 41 41 3.2 Cành mang hoa loài Giổi ăn hạt (Michelia tonkinensis) 42 3.3 Một số đặc trưng hình thái chi Michelia L 43 3.4A 3.4B Hình thái non chồi búp loài thuộc chi Michelia L Một số đặc trưng hình thái vết sẹo lồi thuộc chi Michelia L 44 44 3.5 Giản đồ phát sinh chồi cành syllepsis prolepsis 45 3.6 Hình thái c quan sinh sản loài thuộc chi Michelia 46 3.7 Hình thái lồi Giổi ăn hạt (Michelia tonkinensis A.Chev) 49 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 Đặc m hình thái nhụy hoa số loài Giổi ăn hạt DNA tổng số mẫu Giổi ăn hạt tách chiết điện di gel agarose 1% Sản phẩm PCR nhân đoạn gen atpB – rbcL điện di gel agarose 1% Sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnH – psb A điện di gel agarose 1% Sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnL intron điện di gel agarose 1% download by : skknchat@gmail.com 53 54 55 56 57 viii 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnL – trn F điện di gel agarose 1% Cây phân loại dựa đoạn gen atpB – rbcL xây dựng MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining) Cây phân loại dựa đoạn gen trnH – psbA xây dựng MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining) Cây phân loại dựa đoạn gen trnL intron xây dựng MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining) Cây phân loại dựa đoạn gen trnL – trnF xây dựng MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining) download by : skknchat@gmail.com 58 67 68 69 39 Đ T VẤN ĐỀ Lí chọn đề tài Đất nước Việt Nam tiếng với nhiều hệ sinh thái môi trường sống đa dạng, thiên nhiên ưu đãi có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm gió mùa, đất đai màu m , n i có điều kiện tự nhiên khí hậu thích hợp cho nhiều lồi cối phát tri n Một quốc gia có hệ thực vật vơ phong phú mang lại nhiều giá trị kinh tế cao, có lồi Giổi ăn hạt, nh ng lồi mang nhiều giá trị khơng nghiên cứu khoa học mà thực tiễn đời sống Loài Giổi ăn hạt đề cập đến số tài liệu phân loại thực vật, thuốc, lâm đặc sản, Trong tài liệu đó, chúng nhắc đến lồi có phân bố khu vực miền núi phía Bắc tỉnh: Hịa Bình, Phú Thọ, V nh Phúc, Tuyên Quang, Hà T nh số tỉnh khác Việt Nam Loài Giổi ăn hạt nh ng loài số c quan tổ chức nghiên cứu phát tri n bảo tồn như: Vườn quốc gia Bến En (Thanh Hóa), Vườn quốc gia Xuân S n (Phú Thọ), Vườn quốc gia Tam Đảo (V nh Phúc) hay Sở Khoa học Cơng nghệ tỉnh Hịa Bình, v.v… Từ nh ng nghiên cứu trên, cộng thêm thông tin từ tài liệu liên quan Giổi ăn hạt lồi có giá trị, có th dùng làm thuốc gia vị, nghiên cứu, phát tri n Tuy nhiên, nh ng nghiên cứu hay phát tri n nguồn gen loài Giổi dừng lại quy mô hẹp, chưa đưa nh ng khuyến cáo c sở khoa học cần thiết cho việc bảo tồn phát tri n nguồn gen q lồi quy mơ rộng H n n a, hầu hết nguồn hạt Giổi xuất phát từ số hộ gia đình số địa phư ng, mang tính tự phát, nhỏ lẻ đến từ thu gom lẻ tẻ số bà vùng núi cao; nhu cầu hạt Giổi ngày lớn Trong hầu hết tài liệu thống khơng thống thực download by : skknchat@gmail.com ... xác thị hình thái phân tử, từ góp phần quan trọng việc bảo tồn phát tri n loài/ các loài Giổi ăn hạt Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu  Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu giám định số loài Giổi ăn hạt Việt. .. quả, hạt Xuất phát từ lý luận thực tiễn nói trên, tơi thực đề tài: ? ?Nghiên cứu giám định số loài Giổi ăn hạt (Michelia spp. ) Việt Nam thị hình thái phân tử” Kết nghiên cứu cung cấp nh ng c sở d... skknchat@gmail.com - Xác định số thị DNA mã vạch (DNA barcoding) số loài Giổi ăn hạt Việt Nam - Xây dựng phát sinh hình thái phân loại dựa nh ng đoạn gen phân lập từ mẫu thu thập loài Giổi ăn hạt Việt Nam Đối