(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh thực vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng tiêu ở quảng trị​

1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - TRẦN THỊ HỒNG NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG TIÊU Ở QUẢNG TRỊ Ngành : Sinh học Chuyên ngành : Động vật học Mã số : 60420103 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS PHẠM VIỆT CƯỜNG Hà Nội - 2014 download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài luận văn thạc sĩ, bên cạnh nỗ lực cố gắng than cịn có hướng dẫn nhiệt tình q Thầy Cơ, ủng hộ động viên gia đình bạn bè suốt thời gian học tập nghiên cứu thực luận văn thạc sĩ Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Việt Cường-Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành luận văn Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS.Nguyễn Thị Kim Cúc anh chị em Phòng Cơng nghệ sinh học – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; Trung tâm Sinh học phân tử Nghĩa Đô –Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến tồn thể q Thầy Cô môn Vi sinh vật học hết lòng truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi suốt q trình học tập nghiên cứu tơi hồn thiện đề tài Cuối xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình, bạn bè, người không ngừng động viên, hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập thực luận văn Hà nội, ngày 30 tháng 09 năm 2014 Học viên Trần Thị Hồng MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH download by : skknchat@gmail.com MỞ ĐẦU………………………………………………………………………….… Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………….…….3 1.1 Đặc điểm số vi nấm gây bệnh thực vật…………………………….… 1.1.1 Khái quát nấm gây bệnh…………… …………………………………… .3 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, chế gây bệnh biểu Fusarium oxysporum……………………………………………………………… .4 1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, chế gây bệnh biểu Fusarium solani .6 1.1.4 Đặc điểm hình thái, sinh lý, chế gây bệnh biểu Phytophthora spp……………………………………………………………………….6 1.2 Tổng quan tiêu………………………………………………………………8 1.3 Tình hình nghiên cứu loại vi sinh vật gây hại cho tiêu biện pháp phịng trừ ngồi nước ……………………………………………….9 1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước……………………………………………… 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước………………………………………………14 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP……………………… 21 2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ…………………………21 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu………………………………………………………… 21 2.1.2 Vật liệu .21 2.1.3 Hóa chất thiết bị .21 2.2 PHƯƠNG PHÁP………………………………………………………………….24 2.2.1 Phương pháp phân lập làm vi sinh vật 24 2.2.1.1 Phương pháp phân lập làm nấm 24 2.2.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn xạ khuẩn đối kháng 24 2.2.2 Nuôi lưu giữ chủng vi sinh vật 24 download by : skknchat@gmail.com 2.2.3 Phương pháp nhuộm Gram 25 2.2.4 Phương pháp xác định khả ức chế nấm gây bệnh chủng nấm phân lập .26 2.2.5 Phương pháp đục lỗ xác định hoạt tính kháng sinh dịch ni 27 2.2.6 Phương pháp sinh học phân tử 27 2.2.6.1 Quy trình tách chiết ADN genom .27 2.2.6.2 Xác định nồng độ ADN nhờ máy quang phổ tử ngoại 28 2.2.6.3 Trình tự thơng số cặp mồi sử dụng để tiến hành PCR .29 2.2.6.4 Kỹ thuật PCR 29 2.2.6.5 Điện di ADN gel agaroza .31 2.2.6.6 Xác định trình tự nucleotit gen .31 2.2.6.7 Xử lý trình tự ADN phân tích số liệu phần mềm máy tính 32 2.2.7 Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nguồn bệnh nấm thực vật số chủng tuyển chọn cà chua 32 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………….34 3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM CĨ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG……………………………………………………………………………….34 3.1.1 Phân lập tuyển chọn nấm .34 3.1.2 Định danh chủng vi nấm phân lập 35 3.1.3 Đánh giá khả ức chế sinh trưởng nguồn bệnh nấm vi nấm phân lập…………………………………………………………………………… 39 3.2 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT download by : skknchat@gmail.com TÍNH ĐỐI KHÁNG………………………………………………………………… 42 3.2.1 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn .42 3.2.2 Tách dịng giải trình tự gen mã hoá 16s rARN bốn chủng vi khuẩn nghiên cứu 47 3.2.2.1 Tách ADN genome từ vi khuẩn 48 3.2.2.2 Nhân gen 16S ADN riboxom .48 3.2.2.3 Giải trình tự gen chủng vi khuẩn nghiên cứu .49 3.3 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG 54 3.3.1 Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn .54 3.3.2 Tách dịng giải trình tự 16S ARN chủng xạ khuẩn .55 3.3.2.1 Kết tách chiết ADN tổng số chủng xạ khuẩn XK3 XK28 .56 3.3.2.2 Kết nhân gen 16S-rARN PCR 57 3.3.2.3 Giải trình tự gen chủng xạ khuẩn nghiên cứu 57 3.4 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG NGUỒN BỆNH F.OXYSPORUM CỦA CÁC CHỦNG TUYỂN CHỌN TRÊN MƠ HÌNH CÂY CÀ CHUA .59 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………….64 4.1 KẾT LUẬN……………………………………………………………………….64 4.2 KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO……………………… 65 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN……………………… 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………….67 PHỤ LỤC download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT NCBI : National Center for Biotechnology Information BLAST : BASIC LOCAL ALIGNMENT SEARCH TOOL DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate EtBr : Ethidium bromide EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid SDS : Sodium dodecyl sulphate Bp, Kb : Base pair, Kilo base CFU : Colony forming units mRNA : Messenger RNA PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic acid RNase TAE Taq polymerase TE : Ribonuclease : Tris-Acetate-EDTA : Polymerase Thermus aquarius : Tris- EDTA download by : skknchat@gmail.com PIMG : Percentage of inhibition of growth ĐC : Đối chứng cs : Cộng đtg : Đồng tác giả CSK : Chất kháng sinh CLĐ : Mẫu đất lấy từ huyện Cam Lộ- Quảng Trị CLR : Mẫu rễ lấy từ huyện Cam Lộ- Quảng Trị VLĐ : Mẫu đất lấy từ huyện Vĩnh Linh- Quảng Trị VLR : Mẫu rễ lấy từ huyện Vĩnh Linh- Quảng Trị PDA : Potato dextrose agar PSA : Potato sucrose agar DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Địa điểm thời gian lấy mẫu………………………………………… 21 Bảng 2.2: Trình tự thông số cặp mồi để khuếch đại gen 16S rRNA cho Vi khuẩn…………………………………………………………………………… 29 Bảng 2.3: Trình tự thông số cặp mồi để khuếch đại gen 16S rRNA cho xạ khuẩn………………………………………………………………………… …29 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR cho vi khuẩn……………………………… 29 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR cho xạ khuẩn……………………………… 30 Bảng 2.6: Sơ đồ thí nghiệm………………………………………………………… 33 Bảng 3.1: Đặc điểm bào tử chủng nấm phân lập……………………………35 Bảng 3.2: Tỷ lệ ức chế nguồn bệnh vi nấm phân lập sau ngày nuôi 39 Bảng 3.3: Tỷ lệ ức chế nguồn bệnh vi nấm phân lập sau ngày ni 40 Bảng 3.4: Hình thái tế bào chủng đối kháng……………………………… 43 Bảng 3.5: Khả đối kháng số nguồn bệnh nấm chủng vi khuẩn… 44 download by : skknchat@gmail.com Bảng 3.6: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng nghiên cứu……………… 47 Bảng 3.7: Kết xác định tỷ lệ A260/A280 nồng độ ADN (µg/ml) chủng nghiên cứu…………………………………………………………………………….48 Bảng 3.8: Kết nhận dạng chủng vi sinh vật nghiên cứu sau so sánh BLAST……………………………………………………………………………….50 Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng nghiên cứu môi trường ISP4………………………………………………………………………………… 54 Bảng 3.10: Khả kháng nấm kiểm định chủng xạ khuẩn 55 Bảng 3.11: Kết xác định tỷ lệ A260/A280 nồng độ ADN (µg/ml) chủng nghiên cứu 56 Bảng 3.12: Kết nhận dạng chủng xạ khuẩn nghiên cứu sau so sánh BLAST 57 Bảng 3.13: Ảnh hưởng chủng vi sinh vật tuyển chọn lên sinh trưởng cà chua……………………………………………………………………………… 60 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Triệu chứng tiêu bị nhiễm Phytopthora spp………………………… 16 Hình 1.2: Triệu chứng tiêu bị nhiễm Fusarium oxysporum…………………… 16 Hình 2.1: Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp…………………………………… 26 Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc đặc trưng nấm sợi phân lập từ mẫu vật…… 34 Hình 3.2: Hình thái bào tử đặc trưng số chủng nấm sợi phân lập………….39 Hình 3.3: Khả đối kháng nấm P.oxalicum T.harzianum với nấm bệnh………………………………………………………………………………… 41 Hình 3.4: Khả đối kháng số vi khuẩn phân lập với nấm F.oxyporum… 45 Hình 3.5: Khả tồn môi trường MPA số chủng vi khuẩn download by : skknchat@gmail.com đối kháng…………………………………………………………………………… 46 Hình 3.6: Điện di đồ DNA genom chủng nghiên cứu………………………48 Hình 3.7: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16 S-rRNA chủng nghiên cứu… 49 Hình 3.8: Cây phát sinh chủng loại chủng CLĐvk 30.1……………………………50 Hình 3.9: Cây phát sinh chủng loại chủng CLĐvk 31.3……………………………51 Hình 3.10: Cây phát sinh chủng loại chủng CLĐvk 31.6………………………… 51 Hình 3.11: Cây phát sinh chủng loại chủng CLRvk 31.8………………………… 52 Hình 3.12: Khả đối kháng hai chủng xạ khuẩn CLĐ XK3, VLĐ XK 28 với nấm F.solani F.oxysporum………………………………………………… 55 Hình 3.13: Ảnh điện di AND tổng số chủng xạ khuẩn……………………… 56 Hình 3.14: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S-rARN chủng xạ khuẩn…… 57 Hình 3.15: Cây phát sinh chủng loại chủng CLĐxk3……………………………… 58 Hình 3.16: Cây phát sinh chủng loại chủng VLĐ xk28…………………………… 58 Hình 3.17: Khả đối kháng F.oxysporum chủng CLĐ VK30.1, CLĐ XK3, VLĐ XK28………………………………………………….…61 download by : skknchat@gmail.com 10 MỞ ĐẦU Hàng năm, bệnh gây tổn thất to lớn cho nông nghiệp, chúng phá hủy loại nông sản chủ yếu, chiếm 12% tổng sản lượng nông nghiệp Thế giới Đã có 11000 loại bệnh phát hiện, nguyên nhân khoảng 120 chi nấm, 30 loại virut chi vi khuẩn Thiệt hại nấm hại chiếm khoảng 80% tổng thiệt hại mùa màng, bệnh Fusarium, Phytophthora gây chiếm tỷ lệ tương đối lớn Đây tác nhân chủ yếu gây nên bệnh chết héo, tắc mạch dẫn thối rễ thối thân nhiều loại trồng : lạc, cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu, bơng…[6] Nền nơng nghiệp nước ta có vai trị quan trọng, khơng cung cấp lương thực, thực phẩm, mà cịn tạo hàng hóa có giá trị xuất cao, đặc biệt công nghiệp như: tiêu, bông, cà phê…Tuy nhiên suất chất lượng trồng phải đối mặt với nhiều vấn đề khó khăn, đặc biệt bệnh trồng nấm gây Hiện nay, biện pháp hóa học sử dụng phổ biến xem hữu hiệu phòng trừ bệnh cho trồng Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học nơng nghiệp có thuốc trừ nấm ngày nhiều gây ảnh hưởng xấu đến môi trường làm giảm chất lượng sản phẩm dư lượng thuốc cao, chi phí phịng trị bệnh cao Ngồi ra, đất đai bạc màu, làm chết sinh vật có ích, làm tăng khả kháng thuốc sinh vật gây hại, kết việc sản xuất nông nghiệp rơi vào tình trạng khó khăn Đặc biệt khu vực Miền Trung tiêu cà phê thường bị thối cổ rễ Fusarium oxysporum, F solani , Phytophthora số tác nhân khác [4], [5] Để góp phần khắc phục tồn này, nhà khoa học ý đến nguồn tài nguyên lớn thứ ba giới tự nhiên – Tài nguyên vi sinh vật có ích để bảo vệ mơi trường sinh thái Phương pháp sử dụng vi sinh vật bảo vệ môi trường khơng mang lại hiệu cao, an tồn, sản phẩm thu hoạch không ảnh hưởng tới người sử dụng, có lợi cho cân sinh thái, mà cịn giảm phần lớn lượng thuốc hoá học sử dụng download by : skknchat@gmail.com 66 NR_041080.1, chủng phân lập đất Nhật Bản Chủng lần Waksman phát vảo năm 1957 Kết định danh cho thấy chủng CLĐ XK3 VLĐ XK28 thuộc chi Streptomyces Các loài thuộc chi Streptomyces biết rõ nhân tố kiểm soát sinh học ức chế nguồn bệnh nấm thực vật từ đất khơng khí Hoạt tính đối kháng Streptomyces đến nguồn bệnh nấm thường liên quan đến sản xuất hợp chất đối kháng nấm Ví dụ chủng Streptomyces antimycoticus CSSP696 sử dụng Trung Quốc để bảo vệ mùa chống lại nguồn bệnh nấm Chủng Streptomyces lydicus WYEC108 nhân tố kiểm soát sinh học để kiểm soát Pythium gây bệnh thối rễ hạt…[28] Các nghiên cứu giới loài Streptomyces diastatochromogenes cho thấy chủng có khả sinh CKS oligomyxin Oligomyxin CKS thuộc nhóm macrolit có khả kháng nấm bệnh gây bệnh trồng tốt Chất số hãng sản xuất lớn kháng sinh giới quan tâm Chủng xạ khuẩn lần Krainsky phát từ năm 1914, sau đến năm 1948 Waksman Henrici phân loại lại [38], [51] Các chủng Streptomyces phân lập từ đất trồng tiêu bị bệnh Quảng Trị thể hoạt tính đối kháng nguồn bệnh Fusarium Phytophtora 3.4 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG NGUỒN BỆNH F.OXYSPORUM CỦA CÁC CHỦNG TUYỂN CHỌN TRÊN MƠ HÌNH CÂY CÀ CHUA Cà chua loại rau quan trọng giới dễ bị nhiễm bệnh, thời kỳ nảy mầm Các loại nấm thường gây bệnh cho cà chua gồm: loài Pythium, vài chủng Rhizoctonia, gây thiệt hại nặng nề F.oxysporum F.oxysporum gây tượng tắc mạch dẫn nguyên nhân trực tiếp bệnh thối thân, thối rễ số cà chua, hồ tiêu, Trong số trồng cà chua nghiên cứu phịng thí nghiệm thử khả đối kháng chủng vi sinh vật nấm bệnh thực vật có gây ảnh hưởng đến q trình phát triển trồng hay không [32] download by : skknchat@gmail.com 67 Khả đối kháng chủng vi khuẩn (CLĐvk 30.1; CLĐvk 31.3; CLĐvk 31.6; CLRvk 31.8) chủng xạ khuẩn (CLĐ XK3 VLĐ XK28) đánh giá in vivo mơ hình cà chua điều kiện phịng thí nghiệm xác định ảnh hưởng chúng tới trình phát triển trồng Cà chua sau nảy mầm, rễ, xử lý với F.oxysporum phương pháp mô tả, sau đưa vào mơi trường nhân giống bổ sung ml dung dịch vi sinh vật đối kháng có mật độ 105 CFU/ml Các bình thí nghiệm chuyển sang mơi trường có hoocmon sinh trưởng thực vật tiếp tục nuôi tháng điều kiện ánh sang tối ưu (250C, 16h chiếu sáng/ ngày) Các số lượng lá, lượng rễ chiều cao trung bình đo đếm (Bảng 3.13) Bảng 3.13: Ảnh hưởng chủng vi sinh vật tuyển chọn lên sinh trưởng cà chua Lơ thí nghiệm Số lượng rễ trung bình Chiều cao trung bình (cm) Số trung bình 14 ngày 30 ngày 14 ngày 30 ngày 14 ngày 30 ngày CT1 ± 0,3 ± 0,7 3,3 ± 0,3 14,5 ± 0,9 ± 0,3 ± 0,5 CT2 ± 0.0 ± 0,0 3,2 ± 0,1 13,5 ± 1,2 ± 0,4 ± 0,3 CT3 ± 0,3 ± 0,6 3,0 ± 0,1 14,3 ± 1,2 ± 0,2 ± 0,0 CT4 ± 0,2 ± 0,3 2,9 ± 0,1 14,1 ± 0,6 ± 0,0 ± 0,7 CT5 ± 0,6 ± 0,2 3,3 ± 0,3 14,3 ± 1,0 ± 0,4 ± 0,3 CT6 ± 0,2 ± 0,4 3,1 ± 0,1 12,8 ± 0,7 ± 0,3 ± 0,3 CT7 ± 0,3 ± 0,2 3,2 ± 0,3 14,1 ± 0,6 ± 0,2 ± 0,7 CT8 ± 0,7 ± 0,0 3,1 ± 0,2 14,0 ± 0,2 ± 0,6 ± 0, CT9 ± 0,3 ± 0,6 3,3 ± 0,2 14,6 ± 1,1 ± 0,3 ± 0,3 CT10 ± 0,3 ± 0,7 3,3 ± 0,3 14,5 ± 0,5 ± 0,2 ± 0,3 CT11 ± 0,3 ± 0,2 1,5 ± 0,2 0 CV (%) 17,30 4,00 (LSD) 0,52 0,55 download by : skknchat@gmail.com 68 Kết thí nghiệm cho thấy, sau 14 ngày buồng sinh trưởng bình đối chứng không bổ sung chủng vi sinh vật đối kháng, cà chua không phát triển được, chết sau 1-2 ngày, phát triển còi cọc, phần thân rễ bị thối thâm đen, đổ gập sau tuần nuôi cấy bị nấm F.oxysporum mọc bao phủ (bình 4) Trong bình thí nghiệm có bổ sung vi sinh vật đối kháng, phát triển bình thường, cao, xanh đặc biệt bề mặt thạch không thấy phát triển sợi nấm (bình 1, 2, 3) Như vậy, chủng CLĐvk 30.1, CLĐvk 31.3, CLĐvk 31.6, CLRvk 31.8, CLĐ XK3 VLĐ XK28 có khả ức chế sinh trưởng F.oxysporumin vivo tốt Sự có mặt chủng vi sinh vật đối kháng ức chế phát triển F.oxysporum, làm tăng sức kháng bệnh cây, phát triển khỏe mạnh, thân thẳng, xanh Sau chuyển sang mơi trường có hoormon sinh trưởng (Zeatin mg/l), phát triển nhanh khỏe, lượng rễ/cây tương đối đồng đều, trừ CT11 (công thức đối chứng: có nấm F.oxysporum) Kết tương tự số trung bình/ Có vẻ chủng B.subtilis có tác dụng tốt cà chua việc ức chế nguồn bệnh F.oxysporum, mà lên sinh trưởng so với chủng nghiên cứu khác (CT1: F.oxysporum + B subtilis) Kết bảng 3.14 cho thấy sử dụng đa chủng (CT 5, 8, 9, 10) B subtilis kết hợp với P xylanilyticus, B cepacia, P luteliola hay kết hợp S.diastatochromogenes S antimycoticus ảnh hưởng lên tốt sử dụng đơn chủng (CT 1, 2, 3, 4, 6, 7) xử lý với B subtilis S.diastatochromogenes Và công thức sử dụng vi khuẩn (CT 1,2,3,4,5) ảnh hưởng lên tốt so với download by : skknchat@gmail.com 69 xạ khuẩn (CT 6,7,8) Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu nhà khoa học khác giới việc kết hợp sử dụng vi khuẩn với xạ khuẩn với nấm đối kháng cho kết kiểm soát nấm bệnh hại ảnh hưởng đến sinh trưởng trồng tốt [34], [43] Sarangthem đtg, (2012) phân lập định loại chủng Burkholderia sp có hoạt tính kháng nấm, vi khuẩn nấm men Hoạt tính kháng vi sinh vật chủng khơng địi hỏi có mặt tế bào sống, phổ hoạt tính kháng vi sinh vật Burkholderia sp chứng minh với dịch ly tâm tế bào lọc vô trùng khử trùng phương pháp Paster Tế bào chủng Burkholderia sp giết 98% tế bào Tetrahymena pyriformis sau ngày ni cấy 250C Kiểm tra kính hiển vi thấy tế bào Tetrahymena pyriformis bị chủng Burkholderia sp lấp đầy sau ngày nuôi cấy bị vỡ tung ngày nuôi thứ Chủng Burkholderia sp thử nghiệm nhà kính để bảo vệ trồng đạt kết khả quan việc phịng trừ nhiễm nấm gây bệnh [40] Ngồi nghiên cứu sử dụng chi Paenibacillus đối kháng nấm bệnh, nhà khoa học từ Cục Quản lý Dược phẩm Thực phẩm Mỹ (FDA) xác định loại vi khuẩn lành tính đầy hứa hẹn giúp ngăn chặn vi khuẩn Salmonella xâm nhiễm cà chua sống Khi áp dụng cho cà chua bị nhiễm khuẩn Salmonella cánh đồng nghiên cứu, vi khuẩn biết đến với tên gọi Paenibacillus alvei, làm giảm đáng kể mật độ tác nhân gây bệnh so với cánh đồng đối chứng [32] Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus B subtillis chi Pseudomonas P.chlororaphis PCL1391, P.fluorescens WCS365 sử dụng có hiệu việc kiểm soát rễ cà chua bệnh thối rễ, bệnh loại nấm F.oxysporum f sp radicislycopersici gây nên [19], [28] Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu xạ khuẩn chi Streptomyces, nghiên cứu Lê Gia Hy (1994) xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam; Đỗ Thu Hà (2004) xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam-Đà Nẵng; nghiên cứu Bùi Thị Việt Hà (2006) xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam [6], [9] download by : skknchat@gmail.com 70 Hiện sản phẩm sinh học từ chủng vi khuẩn đối kháng ngày nhà sản xuất quan tâm để kiểm soát nguồn bệnh nấm gây hại cho trồng Từ kết nghiên cứu cho thấy: bốn chủng vi khuẩn Paenibacillus xylanilyticus, Burkholderia cepacia, Pseudomonas luteliola, Bacillus subtilis hai chủng xạ khuẩn S diastatochromogenes, S antimycoticus phân lập có khả ức chế phát triển số nấm gây bệnh thực vật F.oxysporum, F.solani, Phytophthora sp Tuy nhiên để định hướng sử dụng chủng vi khuẩn xạ khuẩn đối kháng cho việc sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh hại trồng cần phải có nghiên cứu để đảm bảo độ an toàn chế phẩm cho mục đích khác sử dụng chủng vi sinh vật đối kháng Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN download by : skknchat@gmail.com 71 Từ mẫu đất rễ khác tiêu bị bệnh từ Huyện Cam Lộ Vĩnh Linh (Tỉnh Quảng Trị), phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật (2 chủng xạ khuẩn, chủng nấm chủng vi khuẩn) có khả ức chế tốt sinh trưởng đồng thời 2-3 nguồn nấm bệnh Các chủng tuyển chọn định danh đến loài dựa đặc điểm hình thái khuẩn lạc bào tử (đối với nấm) kỹ thuật giải trình gen 16S rRNA (đối với vi khuẩn xạ khuẩn) Kết thu sau: - Đối với nấm: + Chủng N4 loài Trichoderma harzianum Rifai + Chủng N19 loài Penicillum oxalicum Currieand Thom - Đối với xạ khuẩn: + Chủng CLĐ XK3 thuộc loài Streptomyces diastatochromogenes + Chủng VLĐ XK28 thuộc Streptomyces antimycoticus - Đối với vi khuẩn: + Chủng CLĐvk 30.1 thuộc Bacillus subtilis + Chủng CLĐvk 31.3 Paenibacillus xylanilyticus + Chủng CLĐvk 31.6 thuộc Burkholderia cepacia + Chủng CLRvk 31.8 thuộc Pseudomonas luteliola Kết thí nghiệm in vivo mơ hình cà chua điều kiện phịng thí nghiệm cho thấy, chủng vi sinh vật nghiên cứu (CLĐvk 30.1, CLĐvk 31.3, CLĐvk 31.6, CLRvk 31.8, CLĐ XK3 VLĐ XK28) có khả ức chế sinh trưởng F.oxysporum, ngăn nguồn bệnh nhiễm lên cà chua non chủng không ảnh hưởng đến sinh trưởng cà chua 4.2 KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Nghiên cứu khả ứng dụng chủng nấm N4 N19 in vivo download by : skknchat@gmail.com 72 Nghiên cứu bản, tách chiết hợp chất từ chủng xạ khuẩn CLĐ XK3 VLĐ XK28 Nghiên cứu sản xuất sử dụng số chế phẩm sinh học từ chủng vi sinh vật nghiên cứu nhằm nâng cao suất hồ tiêu Quảng Trị nói riêng kiểm sốt nấm gây bệnh trồng nói chung CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Nguyễn Thị Kim Cúc, Trần Thị Hồng, Phạm Thị Thúy Hoài, Phạm Việt Cường (2013), “Đánh giá quần thể nấm sợi tiêu bị bệnh Quảng Trị”, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc, Quyển 2, tr 90-94 download by : skknchat@gmail.com 73 Nguyễn Thị Kim Cúc, Trần Thị Hồng, Phạm Thị Thúy Hoài, Phạm Việt Cường (2014), “Phân lập vi sinh vật đối kháng số nguồn bệnh nấm thực vật đánh giá hoạt tính chúng in vitro in vivo”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 52(4), tr 419-430 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: Cục Bảo vệ Thực vật (2007), Báo cáo tình hình sản xuất hồ tiêu ảnh hưởng loại dịch hại quan trọng tới sản xuất Việt Nam, Hội thảo sâu bệnh hại tiêu biện pháp phòng trừ, Đắc Nông, tháng 7/2007 download by : skknchat@gmail.com 74 Đồn Nhân Ái (2007), Một số ngun tắc phịng trừ bệnh chết nhanh tiêu, Diễn Đàn khuyến nông công nghệ lần thứ 5, chuyên đề giải pháp kỹ thuật nâng cao suất, chất lượng giá trị hồ tiêu, tr 92-107 Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập Vi sinh vật học, Nhà xuất đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội Trần Kim Loang ( 2007), Một số ý kiến phòng trừ sâu, bệnh hại rễ hồ tiêu Tây Nguyên, Tài liệu Hội thảo sâu bệnh hại tiêu biện pháp phòng trừ, Cục Bảo vệ Thực vật, Dak Nông Tôn Nữ Tuấn Nam (2007), Một số giải pháp kỹ thuật để phát triển sản xuất hồ tiêu bền vững vùng Tây Nguyên, Diễn Đàn khuyến nông công nghệ lần thứ 5, chuyên đề giải pháp kỹ thuật nâng cao suất, chất lượng giá trị hồ tiêu, tr: 43-50 Nguyễn Lý Nhơn, Nguyễn Như Nhứt (2013), “Khảo sát khả đối kháng nấm bệnh trồng ảnh hưởng điều kiện tăng sinh số chủng phân lập Việt Nam”, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2013, 2, tr 445-449 Phạm Thanh Sơn (2004), Xác định loài tuyến trùng Meloidogyne rễ hồ tiêu tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu phòng trị Meloidogyne spp phân hữu cơ, Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nông lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Thân (2004), Tuyển chọn số dòng nấm Trichoderma sp đối kháng với nấm Phytophthora spp gây bệnh chết nhanh hồ tiêu bệnh xì mủ sầu riêng, Luận án thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nông lâm, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Tăng Tơn ( 2005), Báo cáo tổng kết đề tài cấp Nhà nước: Nghiên cứu giải pháp khoa học công nghệ thị trường để phát triển vùng hồ tiêu nguyên liệu phục vụ chế biến xuất khẩu, mã số KC.06.11.NN, thuộc Chương download by : skknchat@gmail.com 75 trình KC06 10 Ngơ Vĩnh Viễn (2007), Báo cáo dịch hại hồ tiêu biện pháp phòng trừ, Hội thảo sâu bệnh hại tiêu biện pháp phịng trừ, Đắc Nơng, tr 1-8 Tài liệu tiếng Anh: 11 Arijit Das, Sourav Bhattacharya, Abuelgasim Yegoup Hassan Mohammed, Subbaramiah Sundara Rajan (2014), “In vitro antimicrobial activity and characterization of mangrove isolates of streptomycetes effective against bacteria and fungi of nosocomial origin”, Brazilian Archives of Biology and Technology, Vol 57, no.3, pp: 1516-1524 12 Anith, K.N., Radhakrishnan, N.V and Manomohandas, T.P ( 2003), “ Screening of antagonistic bacteria for biological control of nursery wilt of black pepper (Piper nigrum)”, Microbiology Research (158): 1–7 13 Barbara, S., Andre, D ( 2001), Practical guide to detection and identification of Phytophthora spp., version 1.0, CRC for Tropical Plant Protection, Brisbane, Australia 14 Babu G P and Paramageetham C (2013), “Biocontrol of Sclerotium rolfsii – a polyphagous plant pathogen by Pseudomonas aeruginosa isolated from forest litter International”, Journal of Research in Plant Science 3: 1-4 15 Chacon M.R (2007), “Micropic and transcriptome analyses of early colonization of tomato roots by Trichoderma harzianum”, Int Micobiol 10(1): 19-27 16 Chen-Xiaoxi and Liu Wenhong (2011), “Potent antagonistic activity of newly isolated biological control Bacillus subtillis and novel antibiotic against Erysiphe graminis f.sp tritici”, Journal of Medicinal Plants Research 5(10): 2011-2014 17 Đang Vu Thi Thanh, “ Phythophthora diseases Ngo Vinh Vien and André Drenth (2004), in Vietnam”, In Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia, ACIAR Monograph No.114: 83-89 download by : skknchat@gmail.com 76 18 De cal, A., Pascual, S., Melgarejo, P (2003), “Involvement of resistance induction by Penicillum oxalicum in the biocontrol of tomato wilt”, Article first published online, pp 72–79 19 Djebi, M (1990), “Characterization of Fusarium oxysporum f.sp albedinis, the causal agent of bayoudh disease on the basis of vegetative compatibility”, In: Proceedings of the Eighth Congress of the Mediterranean Phytopahological Union, Agadir, Moroco, p.533 20 Duarte, M.R.L., Filho, P.C and Dantas, M.S.F ( 2002), Pests and diseases of black pepper in Brazil, Paper presented at the Symposium on Pests and Diseases on Pepper, Sarawak, Malaysia 21 Eng, L ( 2001), Biological control of root-knot nematodes, (Meloidogyne species) on black pepper (Piper nigrum L.) in Sarawak, PhD thesis The University of Reading, UK 22 Eng, L (2002), Viral disease and root-knot nematode problems of black pepper (Piper nigrum L.) in Sarawak, Malaysia Paper presented at the Symposium on Pests and Diseases on Pepper Sarawak, Malaysia 23 Fernando, E., Stephen, W., Thomas, J (2006), “Penicillium species endophytic in coffee plants and ochratoxin A production”, Mycologia, 98(1), pp 31– 42 24 Gumbek, M (2002), Management of pepper pests in Sarawak, Malaysia Paper presented at the Symposium on Pests and Diseases on Pepper, Sarawak, Malaysia 25 Howell C.R (2003), “Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases”, The history and evolution of current concepts Plant Dis 87:4-10 26 Kredics, L., Antal, Z., Manczinger, L., Szekeres, A., Kevei, F., and Nagy, E (2003), “Influence of environmental parameters on Trichoderma strains with download by : skknchat@gmail.com 77 biocontrol potential”, Food Techn, Biotech 41(1): 37-42 27 Kularatne, R.S (2002), Pests and diseases of black pepper (Piper nigrum L.) in Sri Lanka Paper presented at the Symposium on Pests and Diseases on Pepper Sarawak, Malaysia 28 Larena, I., Melgare, P., Decal, A (2002), “Production, Survival, and Evaluation of Solid –Subtrate Inocula of Penicillum oxalicum, a biocontrol agent against Fusarium wilt of Tomato”, Department of plant protection, vol 92, No 8, pp 863 – 869 29 Lal B., Bhattacharya D (2003), “Evaluation of microbial diversity of three oily sludge contaminated sites situated in different geoclimatic region”, Submitted (07-APR-2003) Center for Bioresources and Biotechnology,TERI School of Advanced Studies, Lodhi Road, New Delhi, Delhi 110007, India 30 Mai, W.F (1985), “Plant-parasitic nematodes: Their threat to agriculture”, In An Advanced Treatise on Meloidogyne Volume I: Biology and control (K.R Barker, C.C Carter and J.N Sasser) Printed by North Carolina State University Graphics, pp 11-17 31 Manohara, D., Mulya, A., Purwantara, A., and Wahyuno, D ( 2002), “ Phytophthora capsici on black pepper in Indonesia”, Paper presented at the Workshop on Phytophthora in South Asia, Chiang Mai, Thailand, pp: 9-11 32 Mohamed Adam, Holger Heuer, Johannes Hallmann (2014), “Bacterial Antagonists of Fungal Pathogens Also Control Root-Knot Nematodes by Induced Systemic Resistance of Tomato Plants”, Plos one, Volume 9, Issue 2, pp: 1-8 33 Newman D.J, Cragg G.M, Snader K.M, (2003), Natural products as ourees of new drugs over the period”, J Nat Prod, 66, 1022-1037 34 Patrycja Golinska (2013), “Antagonistic properties of Streptomyces isolated from forest soils against fungal pathogens of pine seedlings”, Dendrobiology, Vol 69, pp 87 – 97 download by : skknchat@gmail.com 78 35 Pilar Santamarina, Josefa Roselló, Reyes Llacer & Vicente Sanchis (2003), “Antagonistic activity of Penicillium oxalicum Corrie and Thom, Penicillium decumbens Thom and Trichoderma harzianum Rifai isolates against fungi, bacteria and insects in vitro”, Rev Iberoam Micol 19: 99-103 36 Patkowska E., Konopiński M (2014), “Antagonistic bacteria in the soil after cover crops cultivation”, Plant Soil Environ, Vol 60, No 2: 69–73 37 Prasanna Kumar C [2012], “Culture independent survey of marine bacterial community from OMZ of southeast coast of India”, Submitted (05-JUN-2012) Center of Advanced Study in Marine Biology, Faculty of Marine Science, Annamalai University, Annankovil Road,Parangipettai, Tamil Nadu 608502, India 38 Robati R and Mathivanan N (2013), “Antagonistic activity of Streptomyces Sp MML1715 against Rhizoctonia solani”, Annals of Biological Research 4: 156158 39 Sambrook J., Frisch E.F., Maniatis T (1989), Molecular cloning I, II, III: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 40 Sarangthem Indira Devi, Bharat Somkuwar, Momota Potshangbam, Narayan Chandra Talukdar (2012), “Genetic characterization of Burkholderia cepacia strain from Northeast India: A potential bio-control agent”, Advances in Bioscience and Biotechnology, 3, 1179-1188 41 Sarma, Y.R and Saju, K.A (2004), “ Biological control technology for the management of foot rot and slow decline diseases of black pepper”, In: Focus on pepper (Piper nigrum L.) Journal of the Pepper Industry 1(2): 25-51 42 Sempere, F., Santamarina, M.P (2010), “Study between Penicillium oxalicum Currie & Thom and of the interactions Alternaria alternate”, Keissler Braz J Microbiol, vol.41 no.3, pp: 22-29 download by : skknchat@gmail.com 79 43 Siddiqui, Z A., Akhtar, M S (2009), “Effects of antagonistic fungi and plant growth-promoting rhizobacteria on growth of tomato and reproduction of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita”, Australasian Plant Pathology, Volume 38, Issue 1, pp: 22-28 44 Tenorio-Salgado S, Raunel Tinoco, Rafael Vazquez-Duhalt, Jesus CaballeroMellado and Ernesto Perez-Rueda (2013), “Identification of volatile compounds produced by the bacterium Burkholderia tropica that inhibit the growth of fungal pathogens”, Bioengineered 4: 236–243 45 Tran Thi Thu Ha (2007), Interactions between biosurfactant-producing Pseudomonas and Phytophthora species PhD thesis Wageningen University, The Netherlands 46 Tsao, P.H and Alizadeh, A (1988), “Recent advances the taxonomy and nomenclature of the so- called ‘Phytophthora palmivora’ MF4 occurring on cocoa and other tropical crops”, In: Proceedings of the 10th International Cocoa Research Conference, Santo Domingo, pp: 17-23 47 Tsao, P.H., Kasim, R and Mustika, I (1985), “Morphology and identity of black pepper isolates in Indonesia”, FAO Plant Protection Bulletin (33): 61-66 48 Weindling R (1932), “Trichoderma lignorum as a parasite of other soil fungi”, Phytopathology, 22, pp: 837-845 49 Wong, Mee-Hua ( 2002), Fungal diseases of black pepper and their management in Sarawak, Malaysia Paper presented at the Symposium on Pests and Diseases on Pepper Sarawak, Malaysia 50 Yonggang Li, Li Zhang, Chunling Wang, Xiaobing Geng and Wenbin Li (2013), “Antagonistic machaism and control effect of Bacillus subtillis Y2 against Fusarium oxysporum causing soybean root rot”, African Joural of Microbiology Research, 7: 652-656 51 Zahaed Evangelista-Martínez (2014), “Preliminary Study on Some Actinomycetes download by : skknchat@gmail.com 80 and Evaluation of Their Potential Antagonism against Fungal Pathogens”, British Microbiology Research Journal 4(3), pp 272-281 Website: 52 http://sonongnghiepvaptntquangtri.gov.vn 53 http://www.caytieuvn.com download by : skknchat@gmail.com ... số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng tiêu Quảng Trị.” Mục tiêu nghiên cứu đề tài - Phân lập, tuyển chọn định danh số chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng cao với số nấm gây bệnh hại thực. .. LUẬN 3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM CÓ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG 3.1.1 Phân lập tuyển chọn nấm 13 chủng nấm có hoạt tính đối kháng tuyển chọn từ 26 chủng nấm phân lập từ 10 mẫu đất, 10 mẫu... 0,35 Kết nhận cho thấy chủng vi nấm phân lập có hoạt tính đối kháng chủng nấm gây bệnh thực vật với mức độ khác Một số chủng ức chế mạnh sinh trưởng loại nấm gây bệnh, từ 70 % đến 90 % sau 14