2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là 94 chủng vi khuẩn, 29 chủng xạ khuẩn và 26 chủng nấm được phân lập từ đất, rễ của cây tiêu bị bệnh lấy từ các Huyện Cam Lộ, Vĩnh Linh của Tỉnh Quảng Trị, thời gian, địa điểm lấy mẫu được trình bày ở bảng 2.1:
Bảng 2.1: Địa điểm và thời gian lấy mẫu
STT Ký hiệu Địa điểm lấy mẫu Ngày lấy mẫu
1 CL Cam Lộ 08/03/2013
2 VL Vĩnh Linh 08/03/2013
2.1.2 Vật liệu
Các chủng nấm Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Phytophthora sp gây bệnh hại cây trồng từ bộ sưu tập giống của Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quảng Trị – Viện Hóa sinh biển.
Bộ BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) sử dụng cho phản ứng đọc trình tự ADN; chỉ thị ADN chuẩn (Invitrogen); Tag ADN polymeraza (Perkin Elmer); ...
Các cặp mồi để khuếch đại gen 16s rADN ( cặp mồi 16sF, 16sR dùng cho vi khuẩn [37]; và cặp mồi 27sF, 1527sR dùng cho xạ khuẩn [29] được đặt tại hãng Invitrogen.
2.1.3 Hóa chất và thiết bị
- Các loại hóa chất: Yeast Extract (DIFCO-Mỹ); EDTA; SDS; Tris (Sigma- Mỹ); Acid acetic, Ampicillin (Meck-Đức); Agar (Sigma, Mỹ); Cồn tuyệt đối; Ethidium bromide, tryptone, X-gal; Meat Extract, nước cất, chlorofom, TAE, isoamyalcohol, EDTA, ethanol, parafil lỏng, NaCl 0.85%...
- Các dung dịch để tách chiết DNA tổng số: + Dung dịch Chloroform: Isoamylacohol =24:1 + Dung dịch TE.
Tris- HCl :10mM pH=8,0 EDTA :1mM
+ Dung dịch đệm dành cho điện di:
Dung dịch đệm điện di TAE 1X được lấy từ dung dịch TAE 50X gốc có thành phần: Tris base :121 g
Axit acetic glacial :28,6 ml EDTA 0,5M (pH =8) :50 ml Nước khử ion vừa đủ → 500ml + Gel agarose 1%: 100ml
Agarose :1g Đệm TAE 1X :100ml
+ Dung dịch nhuộm gel: Ethidium bromide (EtBr)
Dung dịch gốc: 10mg/ml. Pha 1g EtBr với 100ml nước cất, khuấy từ cho tan đều, giữ trong lọ tối màu ở nhiệt độ phòng.
Khi sử dụng pha 20μl dung dịch gốc trong 100ml đệm TAE 1X. + Đệm tra mẫu (loading buffer) 5X:
Tris-HCl 1M ,pH=8,0 :1ml EDTA 0,5M ,pH=8,0 :0,2ml Glycerol :2ml Bromophenol Blue 1% :2ml - Trang thiết bị, máy móc:
+ Lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc). + Máy lắc ổn nhiệt 30°C, 37°C. + Tủ ấm ổn nhiệt 30°C, 37°C. + Máy khuấy từ (RotoLab, OSI).
+ Máy ly tâm (Microcentrifuge-Sorvall, Mỹ). + Tủ lạnh cất giữ sinh phẩm (4°C và 0°C). + Tủ lạnh sâu -20°C ( Sanyo, Nhật Bản). + Tủ lạnh sâu -75°C ( Sanyo, Nhật Bản). + Máy khuấy trộn Vortex ( RotoLab, OSI).
+ Máy hút chân không ( Speed Vac Sc 110-Savant). + Máy soi chụp ảnh gel ( Bio-Rad).
+ Cân phân tích 10-4 g ( Mettler Toledo). + Bộ nguồn điện di ( Bio-Rad).
+ Tủ cấy vô trùng ( Sanyo). + Pipettman các loại ( Gilson). + Nồi khử trùng ( Nhật Bản).
+ Cân điện 10-2 g ( Mettler Toledo). + Bộ điện di ( Advance Tech, Nhật Bản).
Môi trường và dung dịch dùng cho cho quá trình phân lập, tuyển chọn được thống kê ở phụ lục.
2.2 PHƯƠNG PHÁP
2.2.1 Phương pháp phân lập và làm sạch vi sinh vật
2.2.1.1 Phương pháp phân lập và làm sạch nấm
Loại bỏ rác từ các mẫu đất, rễ nhỏ ở xung quanh vùng rễ cây bị bệnh. Các mẫu vật (đất, rễ) sau đó được nghiền nhỏ trong cối chày sứ (đã khử trùng). Hòa 10g mỗi mẫu trong bình nón chứa 90ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 200 vòng/phút trong 10-20 phút, dùng pipetman hút 1ml dung dịch sang ống nghiệm có 9ml nước vô trùng (hoặc nước muối sinh lý) và tiếp tục pha loãng tới 10-3,10-4, 10-5. Từ mỗi nồng độ pha loãng cấy 100µl vào đĩa petri đường kính 90mm chứa môi trường Czapeck-Dox. Nuôi ở 24-30oC sau 1-2 ngày quan sát sự phát triển của các khuẩn lạc.
2.2.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn và xạ khuẩn đối kháng
Mẫu đất, rễ nhỏ (10 g) lấy ở xung quanh vùng rễ cây bị bệnh được loại bỏ rác, nghiền nhỏ trong cối chày sứ vô trùng, bổ sung 90 ml nước cất vô trùng và chuyển sang bình nón, lắc trên máy lắc 200 vòng/phút trong 10-20 phút. Lấy 1 ml dung dịch chuyển sang ống nghiệm có 9 ml nước muối sinh lý vô trùng, và tiếp tục pha loãng tới 10-3,10-4, 10-5. Từ các ống nghiệm với nồng độ pha loãng khác nhau (10-3,10-4, 10-5), cấy trải 100 µl lên môi trường MPA hoặc King B (để phân lập vi khuẩn) và môi trường ISP4 (cho xạ khuẩn). Nuôi ở 30oC và 37oC, sau 1-2 ngày quan sát sự phát triển của các khuẩn lạc.
+ Nuôi cấy vi khuẩn: các chủng phân lập sau khi làm sạch được nuôi cấy từ 16-24h ở 300C và 370C trên môi trường lỏng MPA, King B.
+ Nuôi cấy xạ khuẩn: Các chủng phân lập sau khi làm sạch được nuôi cấy từ 48- 72h ở 300C trên môi trường lỏng ISP4.
+ Lưu giữ các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn: Bổ sung glyxerol vô trùng đến nồng độ cuối cùng 30% vào canh trường nuôi cấy vi khuẩn (qua đêm) và xạ khuẩn (48-72h) và giữ ở -800C.
2.2.3 Phương pháp nhuộm Gram [3]
- Vật liệu, hoá chất:
+ Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet): 2g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml etanol 95% + 0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất. Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối, sử dụng vài tháng.
+ Dung dịch Iod: Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối. + Dung dịch tẩy màu: Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton.
+ Dung dịch nhuộm bổ sung: Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%.
- Các bước tiến hành:
+ Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
+ Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
+ Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. + Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
+ Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.
+ Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí.
+ Soi kính: dùng vật kính dầu 100x.
-Kết quả:
Vi khuẩn Gram dương (+) bắt màu tím, Gram âm (-) bắt màu đỏ.
2.2.4 Phương pháp xác định khả năng ức chế nấm gây bệnh của các chủng nấm phân lập [26], [28], [35]. phân lập [26], [28], [35].
Hai khoanh nấm (nấm phân lập và nấm bệnh) được cấy đối xứng nhau trên đường kính đĩa Petri và mỗi bên cách tâm 3cm, trong đó nấm bệnh được cấy trước 1 ngày.
Phần trăm ức chế sự phát triển hệ sợi nấm (PIMG): Sau 7 ngày nuôi cấy đối kháng trực tiếp, đánh giá phần trăm ức chế nguồn bệnh bằng cách đo đường kính của khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa có chủng được cho là có hoạt tính đối kháng (R2) và đường kính của khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa đối chứng (R1). Phần trăm ức chế được tính theo công thức: PIMG=(R1 –R2)/R1 ×100.
Hình 2.1. Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp.
R1, R2: đường kính khuẩn lạc nấm bệnh. T : khuẩn lạc chủng nấm đối kháng.
2.2.5 Phương pháp đục lỗ xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch nuôi [16].
Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong bình nón dung tích 250ml có chứa 100ml môi trường dịch thể, lắc trên máy lắc 220 vòng/phút. Sau 1-2 ngày lọc lấy dịch trong, nhỏ vào lỗ thạch đã đục sẵn trong đĩa petri đã cấy vi sinh vật kiểm định. Để tủ lạnh 30 phút cho chất kháng sinh khuếch tán vào thạch, sau đó nuôi ở 300C. Sau 1-3 ngày xác định vòng kháng vi sinh vật .
HTKS = D-d (mm)
D: Đường kính vòng kháng khuẩn d: Đường kính thỏi thạch.
2.2.6 Phương pháp sinh học phân tử
2.2.6.1 Quy trình tách chiết ADN genom
Quy trình tách chiết ADN genom của vi khuẩn [39]:
+ Ly tâm huyền dịch vi khuẩn, loại bỏ dịch nổi.
+ Cặn tế bào được hòa lại trong dung dịch đệm TE 10:1 (Tris HCl + EDTA)
+ Bổ xung SDS 10% và proteaza K, đảo đều, ủ ở 370C sau 1h để phá vỡ tế bào và loại bỏ protein.
+ Bổ sung NaCl 5M, đảo đều, ủ ở 650C trong 10 phút.
+ Ly tâm thu dịch nổi nằm trên lớp xác tế bào.
+ Chiết lại ADN bằng chloroform : izoamylalcohol (24:1) và phenol.
+ Tủa ADN bằng cách bổ sung NAOAc 3M, cồn 100% và giữ ở 200C tối thiểu trong 1h.
+ Ly tâm loại bỏ dịch nổi, rửa cặn ADN bằng cồn 70% làm khô ADN.
+ Hòa lại cặn trong đệm TE chứa ARNaza (100µg/ml), ủ ở 370C trong 1h để loại ARN. + Nồng độ và độ sạch của ADN được xác định bằng phổ hấp phụ trên máy quang phổ tử ngoại và điện di trên gel agaroza 1%.
Quy trình tách chiết ADN genom của xạ khuẩn [39]:
+ Lấy khuẩn lạc cho vào epp 1,5 bổ sung 200µl TE 10nM pH=8.0, votex kỹ (hoặc nuôi dịch sau đó ly tâm thu cặn)
+ Bổ sung 20µl SDS 20% (hoặc SDS 10%), votex nhẹ, ủ 650C trong 40-50p + Ly tâm 10000 vòng/ 10p/ 40C
+ Hút dịch phía trên sang ống epp mới, xác tế bào tiếp tục được xử lý.
+ Epp chứa xác tế bào cho vào lò vi sóng ở cấp độ low level khoảng 130 giây, lặp lại 3 lần.
+Trộn đều xác tế bào với dịch đã hút trước đó
+ Bổ sung 500µl CI (Chloroform:Isoamyl Alcohol), đảo đều, ly tâm 12000 vòng/10p/40C, hút pha trên chuyển sang epp mới.
+ Tủa bằng 400 µl Isopropanol (1:1 v/v), 10% CH3COONa, giữ -200C trong 2-3h + Ly tâm 12000 vòng/10p/40C, đổ dịch. Rửa tủa bằng 400 µl cồn 700C, ly tâm 10000 vòng/7p/40C.
+ Làm khô mẫu bằng máy hút chân không. DNA thu được hòa tan trong 20 µl nước.
Nồng độ ADN được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm (A260) nhờ máy quang phổ Hewlett Packard (Mỹ) với nồng độ pha loãng 50 lần trong H20 khử ion. Một đơn vị A260 tương ứng với nồng độ 50 µg/ml. Do vậy nồng độ ADN được tính theo công thức: A260 x 50 x hệ số pha loãng= µg/ml
Độ hấp phụ của dung dịch chứa ADN cũng được đo ở bước sóng 280nm để xác định mức độ sạch của ADN đã tách chiết. Độ tinh sạch được xác định bằng tỉ số A260/A280 ≥ 1,7 thì có thể coi ADN tách chiết đủ độ sạch dùng cho các kỹ thuật sinh học phân tử tiếp theo.
2.2.6.3 Trình tự và thông số cặp mồi sử dụng để tiến hành PCR
Để thực hiện PCR, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi sau:
Bảng 2.2: Trình tự và thông số cặp mồi để khuếch đại gen 16S rRNA cho vi khuẩn
Mã hiệu Trình tự Tm(0C) %GC
16SF AGA GTT TGA TCA TGG CTC A 51 42
16SR AAG GAG GTG ATC CAG CC 56 59
Bảng 2.3: Trình tự và thông số cặp mồi để khuếch đại gen 16S rRNA cho xạ khuẩn
Mã hiệu Trình tự Tm(0C) %GC
27F AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 53.2 50
1525R AAA GGA GGT GAT CCA GCC 54.5 56
2.2.6.4 Kỹ thuật PCR [39]
Hỗn hợp phản ứng PCR cho một mẫu với tổng thể tích 25µl bao gồm các thành phần như sau (Bảng 2.4 và 2.5) :
Thành phần phản ứng Nồng độ Lượng (µl) H20 khử ion vô trùng 15.7 Taq buffer (+ MgCl2) 2.5 DNTP 5nMol 2.5 16SF 10pmol/ µl 1.5 16SR 10pmol/ µl 1.5
Taq-polymeraza 5U/ µl 0.3
ADN khuôn 50ng/ µl 1
Chu trình nhiệt để tiến hành nhân gen 16S rARN: 940C -5 phút; 940C -1 phút; 560C -50 giây; 720C - 1phút 30 giây; 30 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4); 720C -7 phút; kết thúc ở 40C. Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR cho xạ khuẩn Thành phần phản ứng Nồng độ Lượng (µl) H20 khử ion vô trùng 17.1 Buffer 10X 2.5 DNTP 2.5mM 2 27F 10pmol/ µl 1 1525R 10pmol/ µl 1
Taq-polymeraza 5U/ µl 0.4
Chu trình nhiệt để tiến hành nhân gen : 940C -3 phút; 940C -1 phút; 640C – 1 phút; 720C - 1phút 30 giây; 32 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4); 720C - 10 phút; kết thúc ở 40C.
2.2.6.5 Điện di ADN trên gel agaroza [39]
Các bước điện di ADN trên gel agaroza như sau:
Đổ bản gel:
+ Cho gel agarose 0.8% vào lò vi sóng đun nóng trong khoảng 30 giây, lắc cho gel tan hoàn toàn.
+ Để nguội ở nhiệt độ phòng đến 50oC – 60oC. + Cài lược gel và đổ gel vào khuôn gel.
+ Chờ cho gel đông tụ hoàn toàn (khoảng 30 phút), rồi sau đó tháo lược và đặt khuôn gel vào buồng điện di.
Chuẩn bị mẫu và điện di:
+ Cho vào ống eppendorf 1,5 ml 2 µl mẫu DNA và 1 µl dung dịch tải mẫu loading dye, 7 µl nước cất vô trùng.
+ Dùng pipetman nạp mẫu và nạp chuẩn ( 2 µl ) vào giếng gel. + Đậy nắp buồng điện di và cắm điện cực.
+ Điện di với hiệu điện thế 90 V – 120 V trong vòng 30 phút.
Nhuộm và hiển thị trên gel:
+ Sau khi nhuộm điện di xong, rút điện mở nắp và lấy bản gel ra.
+ Cho bản gel vào dung dịch nhuộm ethidium bromide ngâm trong 10 – 15 phút. + Vớt bản gel ra và soi kết quả trên đèn UV.
Trình tự ADN được xác định theo phương pháp của Sanger & đtg, trên máy xác định trình tự ADN tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems) với bộ kít xác định trình tự BigDye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied Biosystems.
2.2.6.7 Xử lý trình tự ADN và phân tích số liệu bằng phần mềm máy tính
Chúng tôi sử dụng chương trình máy tính Bioedit để xử lý trình tự ADN. Sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự các đoạn gen nhận được với các trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn và xạ khuẩn khác trong Ngân hàng gen quốc tế.
2.2.7 Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nguồn bệnh nấm thực vật của một số chủng tuyển chọn trên cây cà chua [28], [32] một số chủng tuyển chọn trên cây cà chua [28], [32]
- Gieo hạt cà chua: Khử trùng hạt bằng ethanol 70 % trong 1 phút, rửa qua bằng nước cất khử trùng 1 lần; Tiếp đó cho dung dịch Javen 30 % vào, lắc đều (không cần liên tục) trong vòng 20 phút, chắt hết phần nước Javen, rửa bằng nước cất khử trùng nhiều lần (5 lần). Thấm khô hạt bằng giấy lọc vô trùng, đặt hạt lên đĩa petri có chứa giấy thấm nước vô trùng với độ ẩm khoảng 40% và đưa vào tủ ấm 280C trong 48h.
- Hoạt hóa các chủng vi sinh vật: bốn chủng vi khuẩn (bao gồm Paenibacillus xylanilyticus; Bacillus subtilis; Burkholderia cepacia; Pseudomonas luteola) được hoạt hóa và nuôi cấy trong môi trường MPA, nhiệt độ 30 hoặc 37 0C, tùy chủng; hai chủng xạ khuẩn (Streptomyces diastatochromogenes; Streptomyces antimycoticus) được hoạt hóa và nuôi trong môi trường ISP4, nhiệt độ 28-30 0C; chủng nấm gây bệnh thực vật (Fusarium oxysporum) được hoạt hóa và nuôi trên môi trường Czapect-Dox, nhiệt độ 26-28 0C.
- Xâm nhiễm bệnh: cây cà chua sau 2 ngày tuổi, nhúng rễ vào nguồn nấm gây bệnh (nồng độ 105 bào tử/ml) trong 1 phút. Chuyển vào các bình tam giác có chứa 50ml môi trường MS (đã được bổ sung vi khuẩn và xạ khuẩn đối kháng với nồng độ 105/ml). Nuôi trong buồng sinh trưởng (25 0C, 16h chiếu sáng/ngày), theo dõi sự phát triển của cây trong 2 tuần. Sau 2 tuần, các cây còn xanh được chuyển sang môi trường tái sinh có bổ sung 1 mg/lít zeatin, điều kiện nuôi cấy tương tự, theo dõi sự phát triển sau 1 tháng. Sơ đồ thí nghiệm được bố trí như Bảng 2.6:
Bảng 2.6: Sơ đồ thí nghiệm Lô thí nghiệm Chủng vi sinh vật CT1 F.oxysporum + B. subtilis CT2 F.oxysporum + P. luteola CT3 F.oxysporum + B. cepacia CT4 F.oxysporum + P. xylanilyticus
CT5 F.oxysporum + B. Subtilis + P. Luteola+ B. Cepacia+ + P. xylanilyticus
CT6 F.oxysporum + S. diastatochromogenes
CT7 F.oxysporum + S. antimycoticus
CT8 F.oxysporum +(S. diastatochromogenes & S. antimycoticus)
CT9 F.oxysporum +(S. diastatochromogenes & B. subtilis)
CT10 F.oxysporum +(B.subtilis & S.diastatochromogenes &S. antimycoticus)
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM CÓ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG KHÁNG
3.1.1 Phân lập và tuyển chọn nấm
13 chủng nấm có hoạt tính đối kháng đã được tuyển chọn từ 26 chủng nấm phân lập được từ 10 mẫu đất, 10 mẫu rễ (12 mẫu từ Cam Lộ và 8 mẫu từ Vĩnh Linh) của vùng trồng tiêu bị bệnh được phân lập theo phương pháp mô tả ở trên. Trên môi trường Czapek-Dox, các loại khuẩn lạc đặc trưng khác nhau phát triển sau 3-5 ngày nuôi cấy,