Trình tự của gen được xác định theo phương pháp của Sanger & đtg, trên máy xác định trình tự ADN tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems) với bộ kít xác định trình tự BigDye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied Biosystems. Sau khi xử lý các dữ liệu thu được qua phần mềm Bioedit, chúng tôi đã nhận được trình tự các gen 16S rRNA của 4 chủng CLĐvk 31.3; CLĐvk 30.1; CLĐvk 31.6; CLRvk 31.8. Chương trình BLAST đã được sử dụng để so sánh trình tự các đoạn gen nhận được với các trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn khác trong Ngân hàng gen quốc tế. Kết quả định danh bốn chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA được trình bày trong Bảng 3.8:
Bảng 3.8: Kết quả nhận dạng các chủng vi sinh vật nghiên cứu sau khi so sánh bằng BLAST
Ký hiệu chủng Tên chủng trong ngân hàng gen Độ tương đồng (%)
CLĐvk 30.1 Bacillus subtillis (HQ111354.1) 99
CLĐvk 31.3 Paenibacillus xylanilyticus (HQ258920.1)
99
CLĐvk 31.6 Burkholderia cepacia (AF143789.1) 100
CLRvk 31.8 Pseudomonas luteola (KF360062.1) 100
Để làm sáng tỏ hơn về vị trí phân loại của các chủng CLĐvk 30.1; CLĐvk 31.3; CLĐvk 31.6; CLRvk 31.8, mối quan hệ di truyền của chủng này được xác định dựa trên việc thiết lập cây phát sinh loài giữa CLĐvk 30.1 với một số chủng Bacillus đặc trưng; CLĐvk 31.3 với một số chủng Paenibacillus; CLĐvk 31.6 với một số chủng
Burkholderia và CLRvk 31.8 với một số chủng Pseudomonas đặc trưng.
Sử dụng phần mềm MegAlign (của DNASTAR.Lasergene.v7.1.0.PROPER- EDGE) đã lập được cây phân loại của các chủng CLĐvk 30.1; CLĐvk31.3; CLĐvk 31.6; CLRvk 31.8.
Bacillus subtilis strain DmB55.seq CLû 301.seq
Bacillus subtilis strain DmB4 .seq Bacillus sp. LS-508.seq
Bacillus subtilis strain K3-9.seq
Kết quả trên hình 3.8 cho thấy chủng CLĐvk 30.1 có quan hệ rất gần với chủng
Bacillus subtilis DmB55 có số đăng ký trình tự gen 16S ADN riboxom là HQ111354.1, đây là chủng có khả năng ức chế sự tăng trưởng của Beauveria bassiana, một tác nhân gây bệnh trên cây ngô được phân lập tại Argentina.
Từ Hình 3.9 cho thấy chủng CLĐvk 31.3 có quan hệ rất gần với chủng Paenibacillus xylanilyticus KJ-03 có số đăng ký trình tự gen 16S ADN riboxom là HQ258920.1, được phân lập tại Morocco.
Nucleotide Substitutions (x100)
0 0.3
Paenibacillus xylanilyticus s AntCr13 Paenibacillus xylanilyticus s 49C.seq Paenibacillus xylanilyticus s JDG18.se Paenibacillus xylanilyticus s JDG22.seq CLû 31.3.seq
Paenibacillus xylanilyticus KJ-03.seq Paenibacillus xylanilyticus s YUPP-1 .
Hình 3.9: Cây phát sinh chủng loại chủng CLĐvk 31.3
CLĐvk 31.3.seq Nucleotide Substitutions (x100) 0 0.4 B.cepacia LMG7000.seq CLû 31 6.seq B. cepacia LMG14291.seq B.cepacia HP8.seq B.cepacia HP15 .seq B. cepacia M8.seq CLĐvk 31.6.seq
Có thể thấy chủng CLĐvk 31.6 có quan hệ rất gần với chủng Burkholderia cepacia LMG14291 có số đăng ký trình tự gen 16S ADN riboxom là AF143790.1, phân lập tại Canada và chủng Burkholderia cepacia LMG7000 có số đăng ký trình tự gen 16S ADN riboxom là AF143789.1 (Hình 3.10);
Kết quả từ Hình 3.11 cho thấy Chủng CLRvk 31.8 có quan hệ rất gần với chủng
Pseudomonas luteola BSP10 có số đăng ký trình tự gen 16S ADN riboxom là KF360062.1, được phân lập tại Morocco.
Kết quả nhận được cho thấy các chủng tuyển chọn thuộc các chi Paenibacillus, Burkholderia, Pseudomonas và Bacillus.
Các chủng vi khuẩn chi Burkholderia được chứng minh sinh nhiều hợp chất khác nhau ức chế sinh trưởng nấm bệnh thực vật. Tenorio-Salgado và cs (2013) đã nhận dạng được 18 hợp chất bay hơi do vi khuẩn B. tropica sinh ra tham gia vào cơ chế ức chế sinh trưởng của nấm, trong đó có α-pinene và limonene. Ngoài ra Trường Đại học Cần Thơ đã phân lập và đưa vào sử dụng vi khuẩn đối kháng Burkholderia cepacia TG 17 với nấm Rhizoctonia solani gây bệnh đốm vằn trên lúa [44]. Baharat và đtg (1998) đã phân lập chủng vi khuẩn từ hồ nước trong vườn thực vật Tubigen (Đức) và chủng này đã được định danh đến loài là Burkholderia cepacia NB-1. Chủng NB-1 tạo ra một cơ chất phenypyrrole kháng vi sinh vật với phổ hoạt tính rộng, kháng cả nấm sợi, nấm men và vi khuẩn gram (+) [40].
Nucleotide Substitutions (x100)
0 0.6
31.8.seq
P. luteola BSP10 .seq P. luteola ATCC 43330 .seq P. luteola NBRC 103146.seq P.luteola Marseille.seq P.luteola CP155-2 .seq
Hình 3.11: Cây phát sinh chủng loại chủng CLRvk 31.8 CLRvk 31.8.seq
Pseudomonas spp. là vi khuẩn định cư hiệu quả ở rễ thực vật và là các nhân tố kiểm soát sinh học do chúng sản sinh các kháng sinh và các chất trao đổi chống nấm như hydrogen cyanide, siderophore gắn sắt, và các enzymes như gluconase, các enzymes phân hủy cellulose và chitin. Chủng P. fluorescens đã được khai thác để ức chế nguồn bệnh thực vật. Chủng P. aeruginosa được chứng minh sinh ra chất diệt nấm như HCN. Chủng Pseudomonas sp. được biết sinh các hợp chất bay hơi. Hiệu quả ức chế nhiều nguồn bệnh của các chủng Pseudomonas huỳnh quang đã được báo cáo, trong đó có các nguồn bệnh nấm như Fusarium, Rhizoctonia [14].
Bacillus subtilis được biết đến như một trong những vi sinh vật tiêu biểu có khả năng đối kháng tốt với nấm bệnh. Hoạt tính đối kháng của nó đã được nghiên cứu thành công tại nhiều nước trên thế giới như nghiên cứu của Fernando và đồng tác giả (2013) về tác động B. subtilis đối với nấm bệnh, xác định các điều kiện tăng sinh vi khuẩn Bacillus subtilis có hoạt tính kháng nấm của Fang và đồng tác giả (2013), ứng dụng B. subtilis trong kiểm soát bệnh thối trái của Gajbhiye và đồng tác giả (2013) hay nghiên cứu chọn lọc và tăng sinh B. subtilis có khả năng đối kháng nấm bệnh của Islam và đồng tác giả (2012). Kết quả nghiến cứu của Nguyễn Lý Nhơn và Nguyễn Như Nhứt (2013) cho thấy bốn chủng B. subtilis Ba02, Ba06, Ba39, Ba40 được phân lập từ tự nhiên của Việt Nam có hoạt tính đối kháng tốt với 4 chủng nấm bệnh phổ biến (Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, F.oxysporum và Phytopthora capsici) [6].
Patkowska và đtg (2014) thấy rằng, khi tác nhân kiểm soát sinh học (KSSH) vi khuẩn và xạ khuẩn kết hợp, sự biểu hiện của các gen KSSH của chúng đối kháng tốt hơn. Như sự kết hợp của vi khuẩn chi Bacillus / Paenibacillus và xạ khuẩn
Streptomyces đã làm tăng hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh thực vật lên rất nhiều [36].
Ngoài ra, nghiên cứu một số nhà khoa học trên thế giới như Tenorio et al (2013);
Babuet et al (2013) cho thấy, các chủng vi khuẩn đối kháng thuộc chi Burcholderia, Pseudomonas, Bacillus được quan tâm hơn cả bởi chúng tổng hợp một số chất trao đổi ngoại bào có khả năng ngăn cản sự phát triển hệ sợi nấm của Pythium sp., F.oxysporum
và Rhizoctonia solani. Pseudomonas tổng hợp các hơp chất ngoại bào syringomycin, syringostatin, syringotoxin, cepacin A, cepacin B, phenazine và pyrrolnitrin.
Burcholderia tổng hợp các hợp chất cepacin và pyrrolnitrin, trong khi đó Bacillus tổng hợp các hợp chất surfacin, bacilysin, bacillomycin, mycobacillin. Những hợp chất này có hoạt tính kháng nấm chống lại R.solani và F.oxysporum [44].
Các chủng vi khuẩn tuyển chọn từ đất trồng cà phê bị bệnh ở Quảng Trị đều thuộc các chi đã được nghiên cứu kỹ và có tiềm năng ứng dụng trong thực tế.