Trình tự của gen được xác định theo phương pháp của Sanger và cs bằng máy giải trình tự tự động. Sau khi xử lý các dữ liệu thu được qua phần mềm Bioedit, chúng tôi nhận được trình tự các gen 16S rRNA của 2 chủng CLĐ XK3 và VLĐ XK28. Chương trình BLAST đã được sử dụng để so sánh trình tự các đoạn gen nhận được với các trình tự gen 16S rRNA của các chủng xạ khuẩn khác trong Ngân hàng gen quốc tế. Kết quả định danh hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA được trình bày trong Bảng 3.12:
Bảng 3.12: Kết quả nhận dạng các chủng xạ khuẩn nghiên cứu sau khi so sánh bằng BLAST
Ký hiệu chủng Tên chủng trong ngân hàng gen Độ tương đồng (%)
CLĐ XK3 Streptomyces diastatochromogenes
(KF730772.1)
99
VLĐ XK28 Streptomyces antimycoticus 99
Hình 3.14: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S-rARN của 2 chủng xạ khuẩn
Giếng 1: thang ADN chuẩn
Giếng 2,3: PCR của chủng CLĐ XK3, VLĐ XK28 tương ứng.
1.5kb 1.5 kb
(NR_041080.1)
Để làm sáng tỏ hơn về vị trí phân loại của các chủng CLĐ XK3; VLĐ XK28, mối quan hệ di truyền của chủng này được xác định dựa trên sự thiết lập cây phả hệ của 2 chủng CLĐ XK3 và VLĐ XK28 với một số chủng Streptomyces đặc trưng.
Sử dụng phần mềm MegAlign (của DNASTAR.Lasergene.v7.1.0.PROPER- EDGE) đã lập được cây phân loại của 2 chủng CLĐ XK3 và VLĐ XK28.
Nhìn vào cây phát sinh chủng loại, có thể thấy chủng CLĐ XK3 có quan hệ rất gần với chủng Streptomyces diastatochromogenes có số đăng ký trình tự gen 16S ADN riboxom là KF730772.1, đây là chủng có khả năng kiểm soát nấm bệnh F.oxysporum
hại tiêu được phân lập tại Trung Quốc (Hình 3.15).
Kết quả trên Hình 3.16 cho thấy chủng VLĐ XK28 có quan hệ rất gần với chủng
Streptomyces antimycoticuscó số đăng ký trình tự gen 16S ADN riboxom là
Hình 3.15: Cây phát sinh chủng loại chủng CLĐxk3
Nucleotide Substitutions (x100)
0 0.1
CûL xk3.seq
S. diastatochromogenes.seq
S. diastatochromogenes ATCC 12309 .seq S. diastatochromogenes NBRC 3337.seq S. diastatochromogenes NBRC 13389.seq
CLĐxk3
Hình 3.16: Cây phát sinh chủng loại chủng VLĐ xk28
Nucleotide Substitutions (x100) 0 0.1 S. antimycoticus NBRC 12839 .seq VLû xk28.seq S. antimycoticus CGMCC 4.1591.seq S. antimycoticus CSSP696.seq VLĐ xk28
NR_041080.1, đây là chủng được phân lập ở đất tại Nhật Bản. Chủng này lần đầu tiên được Waksman phát hiện vảo năm 1957.
Kết quả định danh cho thấy các chủng CLĐ XK3 và VLĐ XK28 thuộc chi
Streptomyces. Các loài thuộc chi Streptomyces được biết rõ là các nhân tố kiểm soát sinh học ức chế nguồn bệnh nấm thực vật từ đất hoặc không khí. Hoạt tính đối kháng của Streptomyces đến nguồn bệnh nấm thường liên quan đến sự sản xuất các hợp chất đối kháng nấm. Ví dụ chủng Streptomyces antimycoticus CSSP696 được sử dụng ở Trung Quốc để bảo vệ mùa bông chống lại nguồn bệnh nấm. Chủng Streptomyces lydicus WYEC108 là nhân tố kiểm soát sinh học để kiểm soát Pythium gây bệnh thối rễ và hạt…[28].
Các nghiên cứu trên thế giới về loài Streptomyces diastatochromogenes cho thấy chủng này có khả năng sinh CKS oligomyxin. Oligomyxin là CKS thuộc nhóm macrolit có khả năng kháng nấm bệnh gây bệnh trên cây trồng rất tốt. Chất này đã được một số hãng sản xuất lớn về kháng sinh trên thế giới rất quan tâm. Chủng xạ khuẩn này lần đầu tiên đã được Krainsky phát hiện từ những năm 1914, sau đó đến năm 1948 được Waksman và Henrici phân loại lại [38], [51].
Các chủng Streptomyces được phân lập từ đất trồng tiêu bị bệnh ở Quảng Trị cũng thể hiện hoạt tính đối kháng các nguồn bệnh Fusarium và Phytophtora.