Tài liệu LUẬN VĂN:NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN pdf

sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzim thích hợp để cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dể h

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA VÀ THỰC PHẨM

-2009-MỤC LỤC

1 Mở đầu 1

1.1 Đặc điểm sinh học của nấm mốc 1

1.2 Hình dạng, kích thước, cấu tạo của nấm mốc 2

1.2.1 Hình dạng và kích thước 2

1.2.2 Cấu tạo 2

1.3 Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc 3

1.4 Sinh sản của nấm mốc 4

1.4.1 Sinh sản vô tính 4

1.4.2 Sinh sản hữu tính 5

1.5 Vị trí và vai trò của nấm mốc 6

2 Độc tố 7

2.1 Loại độc tố điển hình đối với chủng nấm mốc 7

2.2 Cơ chế tác dụng của độc tố trong cơ thể con người và súc vật 8

2.2.1 Trên súc vật thí nghiệm: biểu hiện ở 4 nhóm bệnh chính 8

2.2.2 Trên người 8

3 Cơ chế sinh tổng hợp độc tố 11

3.1 Norsolorinic acid-averatin 12

3.2 Versicolorin A – sterigmatocystin 13

3.3 Quá trình chuyển Sterigmatocystin thành Aflatoxin: 13

4 Phương pháp xác định độc tố 14

4.1 Phương pháp truyền thống 14

4.1.1 Dùng Kit để xác định Aflatoxin trong thực phẩm 14

4.1.2 Dùng VERATOX 14

4.1.3 Dùng Reveal 17

4.1.4 Dùng thử nghiệm sinh hóa phát hiện độc tố Aflatoxin 19

4.2 Phương pháp hiện đại 22

4.2.1 Phương pháp đo mật độ huỳnh quang 22

4.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 28

5.2.2.5 Phương pháp tiến hành 31

5 Biện pháp phòng nhiễm độc tố Aflatoxin 34

6 Tài liệu tham khảo 35

da dầy … Khác với bệnh nhiễm trùng là kháng sinh không điều trị được nhiễm độc

tố nấm mốc Cách tốt nhất là ngăn ngừa không cho độc tố nhiễm vào thức ăn

1.1 Đặc điểm sinh học của nấm mốc

Nấm mốc (fungus, mushroom) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản (thalophyte), tế bào không có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin, có hay không có celuloz và một số thành phần khác có hàm lượng thấp Nấm học (Mycology) được khai sinh bỡi nhà thực vật học người Ý tên là Pier Antonio Micheli (1729) qua tài liệu công bố “giống cây lạ” (Nova Plantarum Genera) nhưng theo Giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì người có công nghiên cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (1794 - 1874) Theo Elizabeth Tootyll (1984) nấm mốc có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài được mô tả, tuy nhiên, ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiện diện trên trái đất Nhiều loài nấm mốc có khả năng ký sinh trên nhiều ký chủ như động vật, thực vật, đặc biệt trên con người, cây trồng, vật nuôi, sản phẩm sau thu hoạch chưa hoặc đã qua chế biến, bảo quản Một số là tác nhân gây bệnh, làm hư các thiết bị thủy tinh bảo quản không tốt nhưng cũng có nhiều loài có ích như tổng hợp ra acid hữu cơ, thuốc kháng sinh, vitamin, kích thích tố tăng trưởng thực vật đã được đưa vào sản xuất công nghiệp và

có một số nấm được dùng làm đối tượng nghiên cứu về di truyền học

1.2 Hình dạng, kích thước, cấu tạo của nấm mốc

1.2.1 Hình dạng và kích thước

Một số ít nấm ở thể đơn bào có hình trứng (yeast = nấm men), đa số có hình sợi (filamentous fungi=nấm sợi), sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào) Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến 1mm Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn (Hình 1.1) Các sợi nấm có thể phân nhánh

và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì như bông Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào

tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm

có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm (Hình 1.2)

Hình 1.1: Sợi nấm và cấu tạo

Hình 1.2: Một số dạng khuẩn lạc nấm (theo Samson và ctv., 1995)

1.2.2 Cấu tạo

Tế bào nấm có cấu trúc tương tự như những tế bào vi sinh vật chân hạch khác được mô tả và trình bày như ở Hình 1.3

Hình 1.3: Cấu tạo tế bào đỉnh sợi nấm Fusarium (theo Howard R J & Heist J R., 1979) (Chú thích: MT: vi ống, M: ty thể, SC: bộ Golgi, V: bọng(túi) đỉnh, P: màng sinh chất 4 lớp)

Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin và có hoặc không có celluloz Chitin là thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm trừ nhóm Oomycetina Những vi sợi chitin được hình thành nhờ vào enzim chitin syntaz

Tế bào chất của tế bào nấm chứa mạng nội mạc (endoplasmic reticulum), không bào (vacuoles), ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid), đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật Ngoài ra, tế bào nấm còn có ribô thể (ribosomes) và những thể khác chưa rỏ chức năng

Tế bào nấm không có diệp lục tố, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc tố đặc trưng mà Matsueda và ctv (1978) đầu tiên ly trích được và gọi là neocercosporin (C29H26O10) có màu tím đỏ ở nấm Cercosporina kikuchi

Tế bào nấm không nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân Nhân của tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục với màng đôi m, bên trong màng nhân chứa ARN vàphospholipid và protein dầy 0,02 ADN

1.3 Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc

Hầu hết các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng Tuy nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử (Buller, 1950) Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 2oC đến 5oC, tối hảo từ 22oC đến 27oC và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35oC đến 40oC, cá biệt

có một số ít loài có thể sống sót ở OoC và ở 60oC Nói chung, nấm mốc có thể phát triển tốt ở môi trường acit (pH=6) nhưng pH tối hảo là 5 - 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 (Ingold, 1967)

Oxi cũng cần cho sự phát triển của nấm mốc vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc

và sự phát triển sẽ ngưng khi không có oxi và dỉ nhiên nước là yếu tố cần thiết cho

sự phát triển

Theo Alexopoulos và Minns (1979) cho biết nấm mốc có thể phát triển liên tục trong 400 năm hay hơn nếu các điều kiện môi trường đều thích hợp cho sự phát triển của chúng

Nấm mốc không có diệp lục tố nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống

ký sinh trong cơ thể động vật hay thực vật) hay hoại sinh (saprophytes) trên xác bã hữu cơ, cũng có nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm thực vật nhất định

Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như glucoz, muối ammonium sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzim thích hợp để cắt các đại phân

tử này thành những phân tử nhỏ để dể hấp thu vào trong tế bào

1.4 Sinh sản của nấm mốc

Nói chung, nấm mốc sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính Trong sinh sản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái

1.4.1 Sinh sản vô tính

The Alexopoulos và Mims (1979), nấm mốc sinh sản vô tính thể hiện qua 2 dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân nhánh và sinh sản bằng các loại bào tử

Một số loài nấm có những bào tử đặc trưng như sau:

a Bào tử túi (bào tử bọc)(sporangiospores): các bào tử động (zoospores) (Hình 1.4 a, b, c) có ở nấm Saprolegnia

Hình 1.4: Bào tử động (theo Samson và ctv., 1995)

b Bào tử đính (conidium): các bào tử đính không có túi bao bọc ở giống nấm Aspergillus, Penicillium, Hình dạng, kích thước, màu sắc, trang trí và cách sắp xếp của bào tử đính thay đổi từ giống này sang giống khác và được dùng làm tiêu chuẩn để phân loại nấm

Cuống bào tử đính dạng bình có thể không phân nhánh như ở Aspergillus (Hình 1.5) hay dạng thẻ phân nhánh như ở Penicillium (Hình 1.6)

Hình 1.5: Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus a 1 lớp, b 2 lớp, c phiến, d tia, e tể

(theo Samson và ctv., 1995)

Hình 1.6: Bào tử đính và cuống bào tử đính ở Penicillium chrysogenum (theo Samson và ctv 1995)

1.4.2 Sinh sản hữu tính

Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái (gametes)

có trải qua giai đoạn giảm phân Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn: Tiếp hợp tế bào chất (plasmogamy) với sự hòa hợp 2 tế bào trần (protoplast) của 2 giao tử

Tiếp hợp nhân (karyogamy) với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để tạo một nhân nhị bội (diploid)

Giảm phân (meiosis) giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội (haploid) qua

sự giảm phân từ 2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội)

Theo Machlis (1966) tất cả các giai đoạn trên kể cả giai đoạn tạo cơ quan sinh dục được điều khiển bởi một số kích thích tố sinh dục (sexual hormones)

Cơ quan sinh dục của nấm mốc có tên là túi giao tử (gametangia) có 2 loại: cơ quan sinh dục đực gọi là túi đực (antheridium) chứa các giao tử đực (antherozoids), còn cơ quan sinh dục cái gọi túi noãn (oogonium) chứa giao tử cái hay noãn, khi có

sự kết hợp giữa giao tử đực và noãn sẽ tạo thành bào tử, bào tử di động được gọi là bào tử động (zoospores)

Kiểu hai sợi nấm có giới tính đực và cái tiếp hợp nhau sinh ra bào tử có tên là tiếp hợp tử (myxospores), tiếp hợp tử là đặc trưng của nhóm nấm Myxomycetes Bào tử sinh dục khi hình thành có dạng túi gọi là nang (ascus) và túi này chứa những bào tử gọi là bào tử nang (ascospores) Nang và bào tử nang là đặc trưng của nhóm Ascomycetes

Trong nhóm Basidiomycetes, 4 bào tử phát triển ở phần tận cùng của cấu trúc thể quả gọi là đãm (basidium) và bào tử được gọi là bào tử đãm (basidiospores)

Nhóm Nấm bất toàn (Deuteromycetes=Deuteromycotina)) gồm những nấm cho đến nay chưa biết rõ kiểu sinh sản hữu tính của chúng

Hình 1.7: Các kiểu bào tử đảm a Astrea, b Bovista, c Agaricales,

nấm mốc Nấm mốc cũng giúp tổng hợp những loại kháng sinh (penicillin, griseofulvin), acit hữu cơ (acit oxalic, citric, gluconic ), vitamin (nhóm B, riboflavin), kích thích tố (gibberellin, auxin, cytokinin), một số enzim và các hoạt chất khác dùng trong công nghiệp thực phẩm và y, dược đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới Ngoài ra, nấm còn giử vai trò quan trọng trong việc phân giải chất hữu cơ trả lại độ mầu mỡ cho đất trồng

Một số loài thuộc giống Rhizopus, Mucor, Candida gây bệnh trên người, Microsporum gây bệnh trên chó, Aspergillus fumigatus gây bệnh trên chim; Saprolegnia và Achlya gây bệnh nấm ký sinh trên cá Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng như Phytophthora, Fusarium, Cercospora đặc biệt nấm Aspergilus flavus và Aspergillus fumigatus phát triển trên ngũ cốc trong điều kiện thuận lợi sinh ra độc tố aflatoxin

Bên cạnh tác động gây hại, một số loài nấm mốc rất hữu ích trong sản xuất và đời sống như nấm ăn, nấm dược phẩm (nấm linh chi, Penicillium notatum tổng hợp nên penicillin, Penicillium griseofulvum tổng hợp nên griseofulvin ), nấm Aspergillus niger tổng hợp các acit hữu cơ như acit citric, acit gluconic, nấm Gibberella fujikuroi tổng hợp kích thích tố gibberellin và một số loài nấm thuộc nhóm Phycomycetina hay Deuteromycetina có thể ký sinh trên côn trùng gây hại qua đó có thể dùng làm thiên địch diệt côn trùng Ngoài ra, những loài nấm sống cộng sinh với thực vật như Nấm rễ (Mycorrhizae), giúp cho rễ cây hút được nhiều hơn lượng phân vô cơ khó tan và cung cấp cho nhu cầu phát triển của cây trồng

2 Độc tố

2.1 Loại độc tố điển hình đối với chủng nấm mốc

Aspergillus flavus và A parasiticus là hai loài nấm mốc quan trọng trong các lòai

nấm mốc có khả năng tạo độc tố mycotoxin gây ngộ độc thực phẩm Độc tố mycotoxin có thể được tạo ra từ nhiều chuẩn của hai loài này được gọi chung là aflatoxin có khả năng gây ung thư Các nấm mốc này có thể phát triển ở nhiệt độ từ

7 – 40oC và tối ưu ở 24 – 28oC, do vậy có khả năng tăng tưởng tốt trên các lọai ngũ cốc, nông sản( lúa, gạo, bắp ) không được phơi sấy tốt, đặc biệt là các nước nhiệt đới với điều kiện độ ẩm và nhiệt độ không khí cao Từ các nguyên liệu này, nấm mốc và độc tố có thể nhiễm vào thực phẩm gây ngộ độc cho người Ở các chủng có khả năng dinh độc tố, sau khi tăng tưởng 1 – 3 ngày độc tố đượ tạo ra và tiến vào cơ

chất Bốn loại aflatoxin được tạo ra bởi Aspergillus flavus và A parasiticus là

aflatoxin B1, B2 phát huỳnh quang màu xanh (blue) va G1, G2 phát huỳnh quang màu lục (green) Khi ăn cỏ hoặc thức ăn chứa B1 hoặc B2, bò sữa có thể chuyển hóa chúng thành các độc tố aflatoxin M1, M2 hiện diện trong sữa bò Do aflatoxin là chất gây ung thư mạnh nên được kiểm tra nghiêm ngặt Hầu hết các nước đều có

tiêu chuẩn quốc gia về hàm lượng tối đa cho phép sự hiện diện của độc tố này trong nông sản, thực phẩm, thường la 10ppb

Hình 2.1: Nấm sợi Aspergillus flav

2.2 Cơ chế tác dụng của độc tố trong cơ thể con người và súc vật

2.2.1 Trên súc vật thí nghiệm: biểu hiện ở 4 nhóm bệnh chính

Những phá hủy có tính chất cấp tính ở gan - thể hiện một nhiễm độc cấp tính Thường là do Aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong đó độc tố có độc tính mạnh nhất là B1, sau đó đến G1, rồi đến B2, và sau cùng là G2 Bên cạnh gan, các cơ quan khác như: phổi, thận, mạc treo, túi mật cũng bị tổn thương ít nhiều

- Hiện tượng xơ gan: sau một nhiễm độc cấp tính như trên có hai khả năng có thể diễn ra:

Một là các tổ chức mới ở gan sẽ được tái tạo dần dần và gan trở lại hồi phục hoàn toàn

Hai là chuyển thành xơ gan

- Ung thư gan: liều gây ung thư gan trên chuột nhắt trắng là 0,4ppm, tức là cho chuột ăn hàng ngày với liều 0,4mg aflatoxin/kg thức ăn Sau 2-3 tuần có thể gây

ung thư gan Riêng Aflatoxin B1 liều gây ung thư gan có thể là 10ppm tức là mỗi

ngày cho chuột ăn 10mg/kg thức ăn

- Hiện tượng gây viêm sưng nặng nề dẫn đến hoại tử các tổ chức và nội tạng

2.2.2 Trên người

- Năm 1986, Payet và cộng sự đã quan sát trên 2 trẻ em bị suy dinh dưỡng Kwashiorkor, được nuôi bằng thức ăn bổ sung đạm dưới dạng bột lạc, không may

bột lạc này đã bị nhiễm độc tố Aflatoxin Trẻ đã ăn mỗi ngày 70-100g bột lạc bị

nhiễm Aflatoxin với hàm lượng 0,5-1ppm ăn kéo dài trong 10 tháng, đến khi trẻ 4

tuổi thì thấy xuất hiện các triệu chứng rối loạn chức năng gan Sinh thiết gan thấy

có hiện tượng loét mô gan ở cả 2 trẻ

- Bệnh bạch cầu không tăng bạch cầu là bệnh không do độc tố nấm Anatoxin gây

ra, lần đầu tiên xuất hiện ở Xiberi (Liên Xô cũ) và một số vùng khác thuộc Liên Xô

Ở những vùng này thức ăn cơ bản là kê, lúa mì, lúa mạch Sau này, các công trình nghiên cứu đã xác định tác nhân gây bệnh là nấm fusarium Về lâm sàng bệnh thường tiến triển theo 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Kéo dài 3-6 ngày, biểu hiện đầu tiên là viêm niêm mạc miệng, họng sau đó lan xuống dạ dày, ruột Sang ngày thứ 3 có đi ngoài nhiều lần, đau bụng, nôn mửa

Giai đoạn 2: còn gọi là giai đoạn bất sản của hệ bạch huyết và cơ quan tạo máu, kéo dài 15-30 ngày Xét nghiệm máu: Bạch cầu giảm, tiểu cầu giảm và thiếu máu rõ rệt

Sự chuyển hóa aflatoxin trong cơ thể

Điều đầu tiên chúng ta cần biết aflatoxin là tinh thể trắng, bền với nhiệt, không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở 120oC phải đun 30 phút mới mất tác dụng độc) do vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của nấm mốc tương ứng; đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa Tuy nhiên nó lại không bền dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại, nên việc khử độc thực phẩm sẽ có nhiều biện pháp hơn Có 17 loại aflatoxin khác nhau, nhưng thường gặp và độc nhất

là aflatoxin B1

Aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ, có trọng lượng phân tử thấp, dễ dàng được hấp thu sau khi ăn, sự hấp thu là hoàn toàn Khi đến ruột non, aflatoxin B1 sẽ được nhanh chóng hấp thu vào máu tĩnh mạch mạc treo, sự hấp thu ở ruột non và tá tràng

là nhiều nhất Niêm mạc ống tiêu hóa có khả năng chuyển dạng sinh học aflatoxin B1 nhờ sự gắn kết với protein – đây là con đường chính để giải độc aflatoxin B1 cho gan Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, aflatoxin được tập trung vào gan nhiều nhất (chiếm khoảng 17% lượng aflatoxin của cơ thể) tiếp theo là ở thận, cơ,

mô mỡ, tụy, lách Trong vòng 24 giờ có khoảng 80% bị đào thải theo đường tiêu hóa qua mật, đường tiết niệu qua thận và đáng chú ý nó còn bài tiết qua cả sữa

Độc tính trên động vật thí nghiệm

Nhiễm độc các aflatoxin gây một loạt các triệu chứng cấp tính và mạn tính Nhiễm độc cấp thường biểu hiện bằng cái chết của các động vật thí nghiệm với các triệu chứng thường gặp là hoại tử nhu mô gan, chảy máu ở gan và viêm cầu thận cấp Nhiễm độc mạn tính thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu và hoại tử nhu mô Loại mạn tính tác động tới yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến

Độc tính của aflatoxin trên người

Bệnh do nhiễm aflatoxin cấp tính đã được thông báo ở các nước, với các biểu hiện chủ yếu là suy chức năng gan cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan

Bên cạnh các nghiên cứu về vai trò của virut viêm gan, ký sinh trùng, dinh dưỡng, các chất độc đối với ung thư gan, các nhà khoa học cũng đang tập trung nghiên cứu về vai trò của aflatoxin với căn bệnh phổ biến này

Trên người, một loạt các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát tăng ở những vùng có tỷ lệ phơi nhiễm cao với aflatoxin, nhưng cơ chế tác động của aflatoxin gây ung thư gan ở người như thế nào vẫn còn nhiều tranh cãi, tuy nhiên đã tìm thấy sự gắn kết của aflatoxin B1 với AND của tế bào gan ở những bệnh nhân bị ung thư gan nguyên phát, phức hợp này còn được tìm thấy trong máu ngoại vi, trong máu rau thai và máu dây rốn của các sản phụ có phơi nhiễm với aflatoxin B1 Bên cạnh đó còn có sự liên quan giữa phơi nhiễm aflatoxin B1 với sự đột biến gen ở các bệnh nhân này, mà nhiều nhất là sự đột biến gen p53 – một gen kiểm soát sự chết tế bào theo chương trình, khi đột biến gen này sẽ làm đời sống tế bào tăng lên kéo theo nguy cơ tế bào sẽ chuyển thành ác tính

Cho đến nay, người ta tạm thời công nhận khả năng tác động lên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đoạn

- Tác động qua lại với AND và ức chế các polymeraza chịu trách nhiệm tổng hợp AND và ARN

- Ngừng tổng hợp AND

- Giảm tổng hợp AND và ức chế tổng hợp ARN truyền tin

- Biến đổi hình thái nhân tế bào

- Giảm tổng hợp protein

Hậu quả của quá trình tác động sinh hóa lên tế bào gan này là gây ung thư biểu

mô tế bào gan

Như vậy, aflatoxin có khả năng gây độc tính cấp và mạn ở các loài động vật và con người Độc tính nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan nguyên phát Các nhà khoa học đã gây được ung thư gan nguyên phát trên thực nghiệm bằng cách cho các con vật ăn thức ăn có aflatoxin Một loạt các nghiên cứu cũng cho thấy sự phơi nhiễm aflatoxin tăng liên quan đến sự gia tăng mắc bệnh ung thư gan nguyên phát trên người

Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm, an toàn lương thực thực phẩm, không sử dụng các thực phẩm đã bị hỏng, bị nấm mốc là một vấn đề hết sức quan trọng có ý nghĩa trong việc hạn chế tần suất xuất hiện bệnh ung thư gan nguyên phát

3 Cơ chế sinh tổng hợp độc tố

Aflatoxin là sản phẩm của quá trình trao đổi chất thứ cấp của A flavus và A.parasiticus Các gene liên quan đến quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin có trong bộ đơn trong hệ gene của những loài nấm sợi Những nghiên cứu trực tiếp đi sâu về sinh học phân tử của quá trình sinh tổng hợp Cặp gen sinh tổng hợp acid béo (fatty acid synthase) được xác định có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp 2 gene này đặc trưng cho dòng cytochrome P450 monooxygenase

Các độc tố này thường được thấy trước quá trình thu hoạch bắp, cây bông, đậu phụng Aflatoxin ảnh hưởng lớn đến thức ăn và công ngành công nghiệp hạt giống

vì nó có độ độc cao và có khả năng gây ung thư Aflatoxin B1 liên quan đến quá trình chuyển G – T ở codon 249 của hệ gene

Gen đầu tiên được tìm ra có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp aflatoxin là vào năm 1992 Kể từ đó ngành sinh học phân tử tiến hành nghiên cứu về bộ gen tổng hợp aflatoxin từ A Flavus và A parasiticus nhanh và chính xác hơn Bộ gen trong A Flavus nằm trong 4.9 mb chromosome Tác giả Prieto et al chỉ ra rằng việc

bổ sung vào bộ gene loại bỏ các đột biến của A flavus là các gen được tổng hợp aflatoxin ở trong gần 90kb đoạn gen vô tính DNA Yu et al đã sắp xếp lại từng bộ gen trong A Flavus và A parasiticus, và ước lượng kích thước của mỗi bộ khoảng 75kb Các vị trí liên quan trong bộ và các nucleotide tạo thành của các bộ gene tương đối giống nhau giữa 2 loài, mặc dù A.parasiticus có bản sao bổ sung của một vài gen xác định có một số ít phần trong gene nhân đôi

Việc tìm hiểu về quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin dựa vào hệ gene trong A.nidulans có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp sterigmatocystin qua đó xác định được tỉ lệ của các gen sinh tổng hợp aflatoxin cũng tâp trung thành bộ Toàn

bộ nucleotide được tạo thành của A.nidulans cũng như 25 quá trình chuyển đổi để tạo thành cuống đính bào tử đã được xác định, Việc sắp xếp các gen trong nhóm này khác với việc sắp xếp các gen trong bộ tạo Aflatoxin nhưng các acid amin bị giảm đi là giống nhau

Sinh tổng hợp acid Norsolorinic :

Polyketide là viên gạch cấu trúc cơ bản tạo AFB1 liên quan đến quá trình kéo dài

1 đơn vị hexanoate bởi enzyme polyketide synthase (PKS) mà enzyme này là do tập hợp của 7 đơn vị acetyl từ malonyl CoA mà không qua sự khử Ketone tạo noranthrone Việc tổng hợp acid norsolorinic là giai đoạn trung gian bền vững, được tạo thành sau quá trình oxi hóa noranthrone từ enzyme oxidase PKS và enzyme tổng hợp acid béo (FAS) được lấy từ bộ gen có chứa pksA (pksL1) và fas1 Tác giả Chang đã cho thấy pksA được xác định thông qua quá trình chuyển mạch NA của

A parasiticus với phần DNA tham gia tổng hợp AFlatoxin Gần 5% chất vận chuyển bị mất khả năng sản xuất NA khi chất vận chuyển bị phá vỡ trong gene pksA Việc phá vỡ gene của pksL1 là do trong chất vận chuyển không liên kết với Aflatoxin hay NA được xác định qua quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin Gene FAS, fas, được xác định bằng việc thêm vào A.parasiticus mạch, không sản sinh ra Aflatoxin hay sản phẩm trung gian Thí nghiệm loại bỏ gene thêm vào là lúc đầu fas1 tham gia tạo NA và gene đó không cần thiết cho quá trình trưởng thành của nấm Gene FAS thứ 2, fas2, nằm sát fas1 làm nhiệm vụ như nhóm phụ tạo chức năng cho FAS

Việc phân tích để tạo nucleotide xác định motif thông thường để biết PKS và FAS có trong sản phẩm gene, có tên là enzyme –cetoacyl synthase, acyltransferase

và protein chất mang acyl Gene FAS cũng chứa enzyme –ketoacyl reductase, enoyl reductase và anoyl hydrase Thiếu enzyme ketoreductase trong PKS bao gồm thiếu bước khử trong phản ứng PKS sản xuất noranthrone

3.1 Norsolorinic acid-averatin

Việc chuyển từ NA thành averatin (AVN) thông qua enzyme ketoreductase Tương ứng là việc bổ sung vào lỗ hổng do đột biến của A.parasiticus qua viêc tập hợp NA và aflatoxin Nor1 mã hóa 1 protein 29kDa có acid amin tương tự như enzyme dehydrogenase có liên kết NADPH Tương tự NA đột biến ban đầu, chất vận chuyển cắt đứt nor1 không tam gia sinh tổng hợp aflatoxin, người ta dự đoán là

có NA-reductase khác Thực tế thì enzyme reductase thứ 2 này có khả năng chuyển

NA thành AVN khi nghiên cứu in vitro tạo dạng đồng nhất và cho protein phụ khoảng 40kb Sử dụng kháng thể đơn tính kháng lại enzyme reductase này Cary et

al xác định cDNA đơn tính tương đương với gen norA nằm trong bộ gene của Aflatoxin có trong loài A parasiticus cũng như loài A.flavus Các chuỗi acid amin của NOR1 và NORA có độ đồng nhất thấp (22%) nhưng cả 2 loại đều có motif xác định enzyme loại dehydrogenase với phần liên kết adenine nucleotide Để loại bỏ 2 bản sao của norA trong A.parasiticus chưa xác định được Tuy nhiên, người ta chưa xác định chính xác chức năng các gene này

Averatin-versicolorin A:

Gene liên quan đến quá trình chuyển AVN thành versicolorin A (VER A) xác định gene trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin Qua việc sử dụng các đoạn đột biến, chất ức chế và các chất trung gian phóng xạ, thì quá trình trao đổi chất trong quá trình chuyển đổi này sẽ quyết định:

AVN  Averufanin (AVNN)  Averufin (AVF)  1- hydrocyversicolorone (HVN)  versiconal hemiacetal cetate (VHA)  Versiconal (VHOH) 

versicolorin B (VERB) VER A (hình 1) Sử dụng cDNA vô tính, Yu et al đã loại

bỏ được gene tương ứng trong bộ gene tổng hợp Aflatoxin của A.parasiticus và thu đươc chất vận chuyển tích lũy với AVN Gene avnA mã hóa 56.3 kDa cytochrome P450 monooxygenase, gene có liên quan đến quá trình chuyển AVN thành AVNN Prieto et al thay đổi gen đột biến của A flavus thiếu toàn bộ bộ gen Aflatoxin thành 2 phage cos (5E6 và 8B9) và lấy lại chất vận chuyển tham gia với AVF Thêm vào phage cos thứ 3 sẽ giữ được quá trình sinh tổng hợp aflatoxin trong gene đột biến này, người ta cho rằng có 1 gene liên quan đến quá trình chuyển AVF thành VHA nằm ở phage cos 13B9 Gene avf1 nằm trong phần 7kb trên phage cos 13B9 Kết quả phân tích cho thấy phần DNA chứa 2 loại gene, aflB và aflW, mã hóa protein với các acid amin tương ứng với stc B và stcW

Quá trình chuyển VHOH thành VER A rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin vì hệ thống dihidrobisfuran sẽ được tạo thành trong bước này Dihyrobisfuran là cần thiết cho quá trình đột biến tự nhiên của Aflatoxin B1 Liên kết đôi giữa vị trí 2 và 3 trong phần difuran là do enzyme cytochrome P450 hay lipozygenase tạo ra nhóm epoxide linh động có trong thận và gan Các enzyme dehydrative cyclization, là quá trình oxy hóa VER B thành VER A cùng enzyme versicolorin B synthase (VBS), tạo dihydrobisfuran Gene mã hóa VBS , vbs, tương ứng với mồi PCR được tạo ra dựa vào phần peptide của enzyme Sản phẩm gene vbs cho thấy khả năng đồng nhất đặc trưng của các enzyme tự do flavin oxydase và dehydrogenase Các nghiên cứu gần đây cho thấy cấu trúc của Aflatoxin B2 đúng hơn AFB2 khi nó thiếu liên kết đôi trong cấu trúc của bifuran

3.2 Versicolorin A – sterigmatocystin

Sterigmatocystin được tạo thành từ VERA thông qua một số phản ứng enzyme gồm: phản ứng oxy hóa, khử ceton, decarboxyl hóa và methyl hóa Việc thêm gene vào VER A của A.parasiticus dẫn đến việc cô lập được ver1A mã hóa 1 NADPH – ketoreductase Gene thứ 2, ver1B, trong A.parasiticus có 95% tương đồng với ver1

A và không nằm trong bộ gene

3.3 Quá trình chuyển Sterigmatocystin thành Aflatoxin:

Sterigmatoxystin được chuyển thành O-methylsterigmatocystin (OMST) bởi enzyme O-methyltransferase 40 kDa Huyết thanh miễn dịch được đưa vào chống lại protein được dùng để che chắn cDNA và tách omt1 Các acid amin từ cDNA xác định OMT1 có trong chuỗi amino nhờ liên kết S-adenosylmethionine Cả A flavus

và A.parasiticus đều chứa 1 bản sao của omt1

Đoạn gene chuyển OMST thành AFB1 của A flavus xóa đi bộ gene Aflatoxin Chất vận chuyển chứa phage cos không sản sinh ra Aflatoxin hay bất kỳ chất trung gian nào nhưng có chuyển OMST thành AFB1 Gen ord1 chịu trách nhiệm hoạt hóa

enzyme nằm ở phần gene DNA 3.3kb trên phage cos 8B9 Sản phẩm của ORD1 là cytochrome P450 mono oxygenase (CYP64)

- Veratox xác định Aflatoxin thử nghiệm đơn (AST)

- Veratox xác định Aflatoxin độ nhạy cao

4.1.2 Dùng VERATOX

4.1.2.1 Mục đích sử dụng

Veratox xác định Aflatoxin AST (thử nghiệm đơn Aflatoxin) sử dụng để phân tích định lượng Aflatoxin trong các mặt hàng như ngũ cốc, bột ngũ cốc, hỗn hợp protein trong ngũ cốc, hỗn hợp ngũ cốc/ đậu phộng, lúa mỳ, gạo, sữa, tương, hạt bông, bột hạt bông, đậu phộng, bơ đậu phộng và hỗn hợp khác

4.1.2.2 Nguyên tắc

Thí nghiệm này dùng phương pháp cạnh tranh trực tiếp Elisa có thể xác định chính xác nồng độ Aflatoxin tới cỡ phần tỉ (ppb) Aflatoxin được chiết được chiết từ mẫu nền với dung dịch methanol bằng cách đánh đều và lọc Độc tố được chiết ra trong lọc là mẫu đwocj trộn với độc tố găn enzyme (tiếp hợp) Dung dịch hỗn hợp này được chuyển tới những giếng tẩm kháng thể, tại đây độc tố tự do và chất tiếp hợp cạnh tranh để liên kết Sau khi rửa, chất nền được thêm vào, độ hấp thụ của mẫu và mẫu so sánh 20ppb được đọc so sánh với đường chuẩn Kết quả mẫu được tính toán sau đó

4.1.2.3 Phương pháp

Thêm 100 ml chất tiếp hợp vào mỗi giếng trộn

Thêm 100 ml mẫu so sánh vào giếng thứ nhất

Thêm 100 ml của mẫu đầu tiên vào giếng thư hai và thứ ba

Trộn đều Chuyển 100 ml vào mỗi giếng kháng thể Ủ khoảng 5 phút

4.1.2.4 Cách tiến hành:

B1:Xử lý mẫu:

B2: Tiến trình thí nghiệm

B3:Đọc kết quả