GIÁO TRÌNH THỰC HÀNH VI SINHVẬTHỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM **************** Biên soạn: PGS.TS TRỊNH KHÁNH SƠN GIÁO TRÌNH THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC Lưu hành nội THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 01/2022 MỤC LỤC NỘI QUI PHỊNG THÍ NGHIỆM QUAN SÁT NẤM SI ĐỊNH LƯNG TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 11 ĐỊNH LƯNG TỔNG SỐ NẤM MEN VÀ NẤM MỐC 15 ĐỊNH LƯNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHAÙP MPN 18 PHỤ LỤC MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THÔNG DỤNG 24 PHỤ LỤC CÁCH CHUẨN BỊ MỘT SỐ HÓA CHẤT Error! Bookmark not defined NỘI QUI PHỊNG THÍ NGHIỆM Một số sinh vật sử dụng thí nghiệm gây bệnh cho người động vật, nội qui ban hành để ngăn ngừa nguy nhiễm bệnh cho sinh viên cán phịng thí nghiệm Bất kỳ cá nhân không tuân thủ tốt nội qui hay gây nguy hại cho người khác khơng phép vào phịng thí nghiệm Khi có thắc mắc phải yêu cầu hướng dẫn giáo viên cán phịng thí nghiệm Các qui định chung  Sinh viên vào phịng thí nghiệm phải mặc trang phục bảo hộ (áo khoác trắng) phải đeo thẻ sinh viên  Sinh viên phải tham dự 100% buổi thí nghiệm 100% thời gian buổi thí nghiệm Sinh viên phép sử đồng ý giáo viên  Sinh viên phải đến giờ, đến trễ 15 phút, sinh viên không phép vào phịng thí nghiệm xem vắng mặt khơng lý  Nếu lý bất khả kháng khơng tham dự buổi thí nghiệm, sinh viên phải báo trước (hoặc vào buổi thí nghiệm) cho cán có trách nhiệm  Sinh viên phải hồn thành đầy đủ thí nghiệm thực hình thức kiểm tra hạn theo yêu cầu giáo viên  Khi làm hư hỏng trang thiết bị phịng thí nghiệm, sinh viên phải có nghĩa vụ hồn trả lại ngun trạng  Sinh viên phải đọc kỹ trước vào thí nghiệm khơng mang tài liệu vào phịng thí nghiệm  Khi làm đổ/tràn dung dịch làm bể dụng cụ thủy tinh, sinh viên phải báo cáo cho cán phịng thí nghiệm xin ý kiến giải  Sinh viên phải nắm vững thao tác vô trùng: vệ sinh tiệt trùng (trong autoclave, 121oC/30 phút) tất môi truờng, mẫu sinh vật dụng cụ qua thao tác thí nghiệm  Cố gắng giảm thiểu hình thành khí dung thao tác  Rửa tay trước sau thí nghiệm  Khơng ăn/uống phịng thí nghiệm  Khơng nằm phịng thí nghiệm  Đọc kỹ làm theo nội qui/qui định thực hành  Vệ sinh bàn/ghế/kệ…và dụng cụ trước sau làm thí nghiệm  Đổ bỏ rác thải qui định  Không ngậm đồ dùng (viết, mắt kính…) miệng  Trả đầy đủ dụng cụ sau hồn thành xong thí nghiệm (dụng cũ tiệt trùng rửa sạch)  Vệ sinh phòng thí nghiệm theo yêu cầu người phụ trách Các u cầu an tồn a Cột tóc, mặc trang phục bảo hộ (áo khoác trắng, găng tay chống nhiệt…) sử dụng dụng cụ/thiết bị lúc, nơi b Nghiêm cấm dùng miệng hút pipette Trong tình khẩn cấp a Lưu ý trang bị cấp cứu cần (dụng cụ y tế, bình cứu hỏa, vòi nước, cầu dao điện, điện thoại số điện thoại cấp cứu…) b Báo cáo tình khẩn cấp cho giáo viên hướng dẫn cán phịng thí nghiệm c Bình tĩnh có tình khẩn cấp PTN Vi Sinh QUAN SÁT NẤM SI Kỹ thuật ni cấy quan sát nấm mốc (nấm sợi) hoàn toàn khác so với kỹ thuật tương ứng dùng cho vi khuẩn Nấm mốc sinh trưởng tương đối chậm, thường khoảng vài ngày đến vài tuần để phát triển thành khuẩn lạc đủ lớn nhìn thấy Khi phát triển, nấm mốc thường mọc lan môi trường Nấm mốc tạo thành bào tử (spore) khuẩn ty khí sinh (aerial phytae) có màu trắng nhạt Hầu hết nấm mốc phát triển tốt 25oC 35oC Môi trường để nuôi cấy nấm mốc Sabouraud dextrose agar Nồng độ đường cao pH thấp (5.6) mơi trường khơng thích hợp cho phát triển hầu hết vi khuẩn, đảm bảo hạn chế tạp nhiễm Hầu hết nấm mốc phát triển tốt pH 5.6 Khuẩn lạc nấm mốc quan sát trực tiếp cách lấy sinh khối đặt phiến kính (slide) với giọt nước hay thuốc nhuộm (tương tự tiêu giọt ép) Có cách khác dùng để quan sát nấm mốc sử dụng tiêu phịng ẩm (slide culture), tiêu có nhiều ưu điểm quan sát cấu trúc đặc trưng hình thái mà khơng gây ảnh hưởng đến phát triển nấm mốc Phương pháp quan sát cách dễ dàng cấu trúc liên quan đến sinh sản Việc định danh nấm mốc thường dựa vào cấu trúc liên quan đến sinh sản, đặc tính hình thái học phát triển khuẩn lạc Cấu trúc đại thể nấm mốc (khuẩn lạc, colony) thường gọi tản (thallus) Tản sinh khối tập hợp thành phẩn gọi hệ sợi (hay gọi khuẩn ty nấm mốc, mycelium) Khuẩn ty dinh dưỡng (vegetative hyphae) phát triển bề mặt mơi trường tạo thành khuẩn ty khí sinh gọi khuẩn ty sinh sản (reproductive hyphae) Khuẩn ty sinh sản mang bào tử sinh sản (asexual reproductive spore, gọi conidia) Khuẩn ty phát triển bên bề mặt môi trường gọi khuẩn ty dinh dưỡng (rhizoid hyphae hay rhizoidal hyphae) Sợi nấm có vách ngăn (septum) khơng có vách ngăn Khuẩn ty có chứa vách ngăn gọi khuẩn ty có vách ngăn (septate hyphae) Khuẩn ty nấm mốc có sợi nấm khơng có vách ngăn gọi khuẩn ty khơng vách ngăn (coenocytic hyphae) Nấm mốc phân loại chủ yếu dựa vào giai đoạn trình sinh sản Sự phân loại đặc tính nấm mốc dựa vào đặc điểm khuẩn lạc (kích thước, màu sắc), tổ chức khuẩn ty (có vách ngăn hay khơng có vách ngăn), cấu trúc tổ chức bào tử (sporangiospores-bào tử túi, conidiospores-bào tử đính) Nấm mốc có vai trị quan trọng cơng nghiệp sinh vật phân hủy (decomposer) môi trường Bào tử nấm mốc nguồn nhiễm vi sinh vật phổ biến phịng thí nghiệm vi sinh Hai giống nấm sợi Aspergillus Penicillium thuộc lớp nấm bất tồn Deuteromycetes Hai giống khơng có hình thức sinh sản hữu tính, hệ sợi có vách ngăn, bào tử vơ tính bào tử trần Mucor Rhizophus thuộc lớp nấm tiếp hợp Zygomycetes Hai giống vách ngăn có rễ giả, bào tử vơ tính bào tử kín, bào tử hữu tính bào tử tiếp hợp Rhizopus có cuống mang bào tử khơng phân nhánh Mucor có cuống mang bào tử phân nhán Hình Cấu trúc tổ chức bào tử nấm mốc Hình Aspergillus niger Hình Aspergillus nidulans Hình Hình dạng số loại nấm mốc Saptate hyphae (Penicillium) – khoang Non-Septate Hyphae (Coenocytic hyphae) tế bào Hình Sợi nấm có vách ngăn khơng có vách ngăn  Qui trình quan sát hình thái nấm mốc  Quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm hộp petri  Cho giọt methylen blue (0.3% ethanol) vào phiến kính hình chữ nhật  Dùng que cấy móc (vơ trùng) lấy hệ sợi nấm mốc đặt nhẹ nhàng lên giọt methylen blue  Quan sát kính hiển vi  Qui trình chuẩn bị tiêu bàn phịng ẩm  Chuẩn bị phiến kính hình chữ nhật (glass slide) phiến kính hình vng (coverslips) Ngâm phiến kính ethanol 80% tối thiểu 15 phút (hình 5)  Hơ bề mặt phiến kính lửa để vô trùng (dùng kẹp để cầm) Cách 1:  Dùng mũi dao (đã vô trùng lửa đèn cồn, sau chờ nguội), cắt mảnh mơi trường Sabouraund dextrose agar hay Potato dextrose agar (vô trùng, chuẩn bị sẵn đĩa petri) có kích thước 11cm đặt vào phiến kính hình chữ nhật  Dùng que cấy móc, thao tác vơ trùng, lấy hệ sợi nấm mốc đặt vào mảnh mơi trường Sau đó, đặt phiến kính hình vng lên mảnh mơi trường (phiến kính hình vng ngâm ethanol 80% 15 phút, dùng kẹp lấy đặt giấy thấm vô trùng đĩa petri để tự khô) Cách 2:  Dùng parafin làm thành hai đường kẻ ngang phiến kính hình chữ nhật (hình 6) để bề mặt phiến kính hình vng cách bề mặt phiến kính hình chữ nhật 1mm  Đun chảy ống nghiệm chứa môi trường Sabouraund dextrose agar hay Potato dextrose agar, sau làm nguội đến 48 – 50oC  Dùng pipette vô trùng chuyển 0.5 ml huyền phù nấm mốc vào ống nghiệm chứa môi trường  Nhanh chóng chuyển hỗn hợp vào khoảng hai phiến kính cho chiếm khoảng khoảng trống hai phiến kính (hình 6) Các bước phải tiến hành thật nhanh trước môi trường đơng đặc lại (phiến kính hình vng ngâm ethanol 80% 15 phút, dùng kẹp lấy đặt giấy thấm vô trùng đĩa petri để tự khô) Sau thực hai cách trên, tiếp tục tiến hành sau:  Cho giấy thấm nước (vô trùng) vào đĩa petri Cho vài que tăm vào bên phần giấy thấm Đặt phiến kính vừa chuẩn bị phần trước lên que tăm Ủ nhiệt độ phòng từ – ngày (sao cho nấm mốc vừa chớm sinh bào tử) (hình 6d)  Quan sát kính hiển vi với vật kính từ 4 đến 40 Lưu ý: dùng dung dịch methylen blue (0.3% ethanol) để nhuộm màu giúp quan sát rõ cấu trúc nấm mốc (cồn giúp làm mềm vách tế bào nấm mốc giúp thuốc nhuộm dễ vào tế bào hơn) Hình Tiêu bàn phịng ẩm để quan sát nấm mốc (cách 1) Hình Qui trình chuẩn bi tiêu bàn phịng ẩm để quan sát nấm mốc (cách 2) 10 0.1 ml 0.1 ml Maãu thí nghiệm 0.9 ml dung dịch pepton 0.1% 10-1 0.1ml 10-2 0.1ml 10-3 ………10-n Hình Phương pháp pha lỗng mẫu 3.2 Đổ đóa a Dùng bút lông dầu ghi lên mặt đóa petri (tên mẫu, ngày tiến hành, độ pha loãng, nhóm nghiên cứu…) (hình 8) b Dùng pipette vô trùng chuyển 0.1 ml (hoặc ml) dịch mẫu pha loãng vào đóa petri Tương ứng với độ pha loãng thực – đóa (tức – lần lặp lại) c Sau cấy, đổ vào đóa 10 – 15 ml môi trường PCA đun chảy ổn định 45 - 50oC d Trộn dịch mẫu với môi trường cách xoay tròn đóa petri xuôi ngược chiều kim đồng hồ, chiều – lần sau đổ môi trường e Đặt đóa mặt phẳng ngang để yên cho môi trường đông đặc hoàn toàn (khoảng 15 phút) f Ủ tủ ấm nhiệt độ 30oC 24 – 48 (24 lấy kết sơ bộ, 48 lấy kết thức) Lưu ý: ủ phải để hộp petri trạng thái lật úp (phần môi trường trên, phần nắp nằm bên dưới)  Cách tính kết  Trường hợp số khuẩn lạc đĩa petri nằm khoảng 25-250 CFU (một số tài liệu khác yêu cầu số khuẩn lạc đĩa phải nằm khoảng 30-300 CFU) 13 N= ∑� × �1 + 0.1 × �2 ×� Trong đó: N: số khuẩn lạc 0.1 ml mẫu (nếu cho ml mẫu vào đĩa petri N số khuẩn lạc ml mẫu, Thể tích mẫu cho vào đĩa nằm phải nằm khoảng 0.1-1 ml) N trình bày dạng chữ số gồm số hàng đơn vị chữ số hàng thập phân với 10n (ví dụ: 2.4×104) ∑C: tổng số khuẩn lạc tất đĩa đếm (các đĩa có 25-250 CFU) n1: số đĩa độ pha loãng n2: số đĩa độ pha loãng d: độ pha lỗng đĩa (10-n) Ví dụ: Độ pha loãng 10-2 10-3 Số khuẩn lạc (CFU) đĩa 232; 244 33; 28 Giá trị APC (aerobic plate count) tính sau: N= (232+244+33+28) 1×2 +(0.1×2) ×10−2 = 537/0.022 = 24 409 = 2.4×104 CFU/0.1 ml = 2.4×105 CFU/ml  Trường hợp số khuẩn lạc tất đĩa petri 250 CFU (trường hợp cho ml mẫu lên đĩa petri) Độ pha loãng 10-2 10-3 EAPC/ml (hoặc EAPC/g) Số khuẩn lạc (CFU) TNTC 640 640 000 đĩa TNTC: nhiều để đếm (too numerous to count)  Tất đĩa có khuẩn lạc mọc lan hay có cố bất ngờ xảy trình thực ghi nhận kết SPR (mọc lan, spreader) hay LA (sự cố kỹ thuật, laboratory accident)  Tất đĩa có trung bình số khuẩn lạc >100 CFU/cm2 (trường hợp cho ml mẫu lên đĩa petri) Độ pha loãng 10-2 10-3 EAPC/ml (hoặc EAPC/g) (a) Số khuẩn lạc (CFU) TNTC 150 >6 500 000 (b) đĩa TNTC 490 >5 900 000 Diện tích bề mặt đĩa 65 cm2; bDiện tích bề mặt đĩa 59 cm2 a 14 ĐỊNH LƯNG TỔNG SỐ NẤM MEN VÀ NẤM MỐC Định nghóa nguyên tắc Nấm men nấm mốc nhóm vi sinh vật đa dạng, có trăm ngàn loài nấm men nấm mốc mô tả Chúng thuộc nhóm Eucaryote, có vách tế bào lớp vỏ chitin Nấm men nấm mốc vi sinh vật dị dưỡng, chúng tiêu thụ nguồn carbon hữu cung cấp từ môi trường bên tế bào Hầu hết nấm mốc nấm men thuộc nhóm mesophiles, số thuộc nhóm psychrophiles, thermophiles Hầu hết nấm men nấm mốc phát triển môi trường có hoạt độ nước từ 85% trở lên, số loài tăng trưởng môi trường có hoạt độ nước 60 – 70% Nấm mốc nấm men tăng trưởng khoảng pH từ 2.0 – 9.0, pH thích hợp 4.0 – 6.5 Đa số nấm men nấm mốc thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, số phát triển điều kiện vi hiếu khí Một số loài tiếp nhận oxi nguyên tử từ chất, dù dạng nào, oxi nguyên tố cần thiết cho trình phát triển nấm mốc nấm men Trong thực phẩm, diện sinh trưởng chúng làm thay đổi tính chất thực phẩm (màu sắc, mùi vị…), gây hư hỏng tạo thành số độc tố gây ngộ độc thực phẩm Mật độ nấm mốc nấm men mẫu xác định chung dạng tổng số nấm men nấm mốc kỹ thuật pha loãng, trải đóa đếm khuẩn lạc môi trường Dichloran Glycerol Agar, hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) Môi trường Dichloran Glycerol Agar sử dụng cho loại thực phẩm có hàm lượng nước thấp (thực phẩm khô, ngũ cốc, tiêu…, loại thực phẩm có dầu, có hàm lượng đường/muối cao) Môi trường DRBC sử dụng cho mẫu có hàm lượng nước cao (sữa, sản phẩm từ sữa, đồ hộp, loại rau quả…) Đối với mẫu có mật độ nấm mốc thấp, môi trường thường sử dụng Malt Extract Agar (MEA), Potato Dextrose Agar (PDA) chứa 40 ppm (0.004%) chloramphenicol (hay chlortetraciline) 0.0084g/L rose bengal 15 Ghi chú:  Cho viên chloramphenicol 250 mg pha vào 10ml nước cất, lắc đều, để lắng cặn Bổ sung 1.6 ml dung dịch vào môi trường PDA định mức 1000 ml để có nồng độ 40 ppm chloramphenicol  Pha dung dòch rose bengal 0.1% (0.1g rose bengal 100 ml nước cất) Dùng 8.4 ml dung dịch cho vào môi trường chloramphenicol-PDA định mức 1000 ml Cách tiến hành a.Tiến hành pha loãng thập phân mẫu ban đầu b Sử dụng kỹ thuật trải đóa để tiến hành xác định tiêu tổng số nấm men, nấm mốc mẫu (hình 8)  Ghi nhãn lên mặt sau đóa petri (tên mẫu, tên kỹ thuật viên, ngày…)  Đổ môi trường agar (nóng chảy) vào đóa petri (khoảng 15ml) Chờ cho môi trường đông đặc hoàn toàn (khoảng 15 phút)  Dùng pipette cho 0.1 ml mẫu vào đóa thạch  Nhúng que trang thủy tinh (hình L) vào cốc chứa ethanol Sau gõ nhẹ que thủy tinh vào thành cốc để loại bớt ethanol thừa  Khẽ đưa que thủy tinh gần lửa đèn ethanol để làm bốc cháy que thủy tinh Làm nguội cách chạm que thủy tinh vào phần nắp bên đóa thạch  Trải mẫu vi sinh vật cho mẫu dàn khắp bề mặt môi trường thạch  Nhúng que thủy tinh vào ethanol, gõ nhẹ vào cốc đốt cháy que thủy tinh  Lặp lại thao tác với đóa thạch Tương ứng với độ pha loãng thực – đóa (tức – lần lặp lại)  Tiến hành nuôi cấy tủ ủ vi sinh 30oC 16-24 (sao cho khuẩn lạc nấm mốc vừa chớm tạo thành chưa có hình thành bào tử)  Tiến hành quan sát hình thái đại thể khuẩn lạc, đếm số khuẩn lạc nấm men/nấm mốc ghi nhận lại kết Đọc kết a.Tương tự “Định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí” 16 b Đọc kết đóa có từ 10 – 150 colonies (tạm dịch khuẩn lạc nấm mốc khuẩn lạc nấm men) sau ngày 16 đến 24 nuôi cấy  Lưu ý: thời gian ủ, nấm mốc tạo bào tử phát tán vào môi trường nuôi cấy, tạo thành khuẩn lạc Để hạn chế tượng này, suốt thời gian ủ, hạn chế chạm tay di chuyển đóa đếm kết Mặt khác, tiến hành đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đóa để tránh phát tán bào tử vào không khí, gây nhiễm vào mẫu hay môi trường nuôi cấy khác Các đóa đem ủ phải để mặt chứa môi trường nằm phía dưới, nắp đóa petri nằm Hình Kỹ thuật đổ đóa trãi đóa 17 ĐỊNH LƯNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN Định nghóa Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân Coliforms (hình 9) trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí kị khí tùy ý, có khả lên men lactose sinh acid sinh 37oC 24 – 48 Trong thực tế phân tích, Coliforms định nghóa vi khuẩn có khả lên men sinh khoảng 48 ủ 37oC môi trường lỏng Lauryl Sulfate môi trường Brilliant Green Lactose Bile Salt Nhóm Coliforms diện rộng rãi tự nhiên, ruột người động vật Coliforms xem nhóm vi sinh vật thị: số lượng diện chúng thực phẩm, nước hay có loại môi trường dùng để thị khả diện vi sinh vật gây bệnh khác Nhiều nghiên cứu cho thấy số Coliforms thực phẩm cao khả diện vi sinh vật gây bệnh khác cao Tuy nhiên, mối liên hệ vi sinh vật gây bệnh vi sinh vật thị nhiều tranh cãi Nhóm Coliforms gồm giống: Escherichia với loại E.coli, Citrobacter, Clebsiella, Enterobacter Tính chất sinh hoá đặc trưng nhóm thể qua thử nghiệm indol (I), Methy Red (MR), Voges-Proskauer (VP) Citrate (iC) thường gọi tóm tắt chung IMViC Coliforms chịu nhiệt Coliforms có khả lên men lactose sinh khoảng 24 ủ 44oC môi trường lỏng EC Coliforms phân (faecal coliforms hay E.coli giả định)là Coliforms chịu nhiệt có khả sinh indole ủ khoảng 24 44.5oC môi trường lỏng Trypton Coliforms phân thành phần hệ vi sinh đường ruột người động vật máu nóng khác sử dụng để thị mức độ vệ sinh trình chế biến, bảo quản, vận chuyển, thực phẩm, nước uống để thị ô nhiễm phân mẫu môi trường E.coli Coliforms phân cho kết thử nghiệm IMViC ++ (Indol + , Methyl Red + , Voges-Proskauer -, Citrate -) 18 Hình 10 Coliform tổng số Phương pháp MPN (Most Probable Number) Phương pháp MPN (phương pháp số có xác suất cao nhất, số tối khả) gọi phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ Đây phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn diện đơn vị thể tích mẫu Đây phương pháp định lượng dựa kết định tính loạt thí nghiệm lặp lại số độ pha loãng khác Thông thường, việc định lượng thực lặp lại lần độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng x = ống nghiệm Qui trình thực định lượng theo phương pháp sau: cho vào ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho tăng trưởng đối tượng vi sinh vật cần định lượng thể tích xác dung dịch mẫu nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 10-1, 10-2, 10-3) nhiệt độ thời gian thích hợp Dựa vào kết biểu kiến chứng minh tăng trưởng vi sinh vật cần kiểm định ống nghiệm (thường tượng sinh hơi, đổi màu, đục…) Ghi nhận số lượng ông nghiệm dương tính độ pha loãng Sử dụng số liệu dựa vào bảng Mac Crady suy mật độ vi sinh vật trình bày dạng số MPN/ml, MPN/ g mẫu (số vi sinh vật/ml hay số vi sinh vật/g 19 mẫu) Độ xác trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại độ pha loãng: số lượng ống nghiệm lặp lại cao độ xác trị số vi sinh vật nuôi cấy môi trường lỏng chọn lọc cho kết biểu kiến thích hợp Ví dụ, sử dụng môi trường BGBL 37oC định lượng nhóm coliforms, môi trường 45oC cho phép định lượng Coliforms phân môi trường Mannitol Salt Broth dùng để định lượng Staphylococcus… Định lượng Coliforms phương pháp MPN a Tuần tự cấy ml dịch mẫu pha loãng 10-1 vào ống nghiệm giống nhau, ống chứa môi trường LSB ống Durham úp ngược (lượng môi trường phải vượt chiều cao ống Durham) Thực tương tự với dịch mẫu pha loãng 10-2, 10-3 đến 10-10…Ủ ống nghiệm 48 37oC ng dương tính ống có sinh khí (bọt khí ống Durham) Ghi nhận số ống dương tính b Thử nghiệm khẳng định: dùng que cấy vòng chuyển dịch mẫu từ ống LSB dương tính sang ống chứa môi trường BGBL ủ 37oC 48 Ghi nhận số ống dương tính ứng với độ pha loãng  Lưu ý: cần loại bỏ (tiệt trùng trước loại bỏ) ống nghiệm có chứa vi sinh vật sau làm thí nghiệm xong Các ống có khả diện Coliforms ống dương tính môi trường LSB lẫn BGBL Lựa chọn độ pha loãng để tính kết  Khi nhiều độ pha loãng thiết lập phép đo, kết độ pha loãng chọn để xác định giá trị MPN Chọn độ pha loãng thấp (hệ số pha loãng cao nhất) có ống dương tính với ống có độ pha loãng thấp (hệ số pha loãng cao tiếp theo) (ví dụ a, b, c, d, e, f)  Khi độ pha loãng thấp độ pha loãng chọn xuất ống dương tính, ống dương tính tính thêm vào độ pha loãng thấp độ pha loãng chọn (ví dụ g, h)  Nếu độ pha loãng dãy ống sử dụng phép đo cho ống dương tính, chọn độ pha loãng thấp có ống dương tính ống có độ pha loãng cao liền kề (ví dụ i) 20  Nếu mật độ vi sinh vật thấp (ví dụ j), kết ống dương tính đặt độ pha loãng chọn Bảng Ví dụ lựa chọn độ pha loãng để tính kết MPN Ví dụ a b c d e f g h i j Độ pha loãng mẫu 10-2 10-3 10-4 10-5 0 3 0 2 3 3 0 1 1 2 2 0 -1 10 3 3 3 3 Kết chọn 3-2-0 3-1-0 3-2-2 3-0-1 3-3-3 3-0-1 3-2-2 3-2-3 2-2-2 0-1-0 Xác định số MPN/ml (vi sinh vật/ml)  Từ kết lựa chọn, tiến hành tra bảng MPN Với độ pha loãng thấp chọn (10-n): Kết (MPN/ml) = kết trang bảng x n Bảng Ví dụ cách xác định số MPN/ml 10-3 10-4 10-5 Tra baûng MPN MPN/ml 14 14 x 103 21 1ml 1ml Mẫu thí nghiệm 1ml 1ml 9ml nước vô trùng 10-1 10-2 10-3 ………10-n Các ống nghiệm LSB có ống Durham 10-3 ………10-n 10-2 10-1 Hình 11 Cách pha loãng mẫu chuyển mẫu pha loãng vào môi trường lỏng LSB 22 Bảng Bảng tra MPN dùng cho loạt ống nghiệm nồng độ pha loãng liên tiếp 0.1 ml 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 Số ống dương tính 0.01 ml 0.001 ml 0 1 1 2 2 3 3 3 0 1 1 2 2 3 3 3 MPN/ml 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 3.6 7.2 11 15 7.3 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29 0.1 ml 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 23 Số ống dương tính 0.01 ml 0.001 ml 0 1 1 2 2 3 3 3 0 1 1 2 2 3 3 3 MPN/ml 9.1 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 - PHỤ LỤC MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THÔNG DỤNG  M1 (môi trường giá đậu đường) Cân 100g giá đậu (đã rửa sạch), thêm 1000 ml nước, cho vào nồi Đun sôi 30 phút Lấy phần dịch Thêm nước cho đủ 1000 ml Dùng beaker, bổ sung thêm glucose (5% w/v), pepton (0.1% w/v) Nếu làm mơi trường agar bổ sung thêm 2.2% (w/v) agar Tiến hành đun sôi nhẹ bếp (dùng lưới amiang để tránh nứt beaker), dùng đũa thủy tinh khấy nhẹ mơi trường hồn tồn Sau đó, phân phối mơi trường vào bình tam giác Lưu ý, môi trường chiếm 1/2 đến 2/3 thể tích bình tam giác Đậy nút bơng gịn khơng thấm miệng bình tam giác, bọc giấy nhơm phần nút Tiệt trùng môi trường 121oC 15 phút, sau để nguội bảo quản ngăn mát tủ lạnh  M2 (moâi trường khoai tây đường cám) Khoai tây cắt nhỏ, rửa sạch, cân lấy 300g Thêm 500ml nước, đun sôi 30 phút nồi Lọc lấy nước Cân 100g cám, thêm 500ml nước, đun sôi 30 phút Lọc lấy nước Trộn loại dịch lọc thêm 2.2% (w/v) agar (nếu chuẩn bị mơi trường agar) Bổ sung nước cho đủ 1000ml Khoai tây 30% Cám 10% Sucrose 5% Nước 1000ml  M3 (môi trường Sabouraud dextrose agar) Pepton 1% Glucose 4% Agar 2% Nước 1000ml pH 5.6 – 6.0  M4 (môi trường Hansen) Glucose 5% Pepton 1% K2HPO4 0.3% MgSO4.7H2O 0.2% 24 Agar (nếu cần) 2% Nước 1000ml  M5 (môi trường Potato dextrose agar) Để chuẩn bị chất chiết khoai tây, đun sôi (trong nồi) 200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ với 1000ml nước 30 phút Lọc qua vải thưa rây, giữ lại phần dịch, chất chiết khoai tây Dùng beaker, trộn với thành phần khác đun sôi để hoà tan Đối với môi trường potato dextrose salt: chuẩn bị môi trường M5 thêm 7.5% NaCl Chất chiết khoai tây 20% (v/v) Glucose 2% Agar (nếu cần) 2% Nước 1000ml  M6 (môi trường thạch malt) Lấy 250g malt, nghiền nhỏ, hoà vào 1000ml nước cất Dùng đũa thủy tinh khuấy gia nhiệt từ từ, đến 45 – 50oC, giữ nhiệt độ 30 phút Sau nâng nhiệt độ lên 65 – 68oC, có khuấy, trình đường hóa xảy hoàn toàn (không thấy màu xanh xuất thử dịch cháo với dung dịch Lugol) Lọc tách bã qua vải thô (hay gòn thấm nước), đem hấp phần dịch 121oC / 30 phút, lấy để lắng Lọc bỏ kết tủa, pha loãng để đạt – 8o Brix, thêm 2% agar, đun khuấy thạch tan hết Cho môi trường thạch vào dụng cụ chứa, hấp tiệt trùng 121oC / 15 phút  M7 (môi trường Billiant Green Bile Lactose Broth – dạng pha sẵn) Peptone 1% Lactose 1% Ox-bile khô 2% Brilliant green 0.0133g/L pH 7.2 (25oC) Dùng 40g hỗn hợp pha sẵn để chuẩn bị thành 1000ml môi trường Tiệt trùng 121oC 15 phút Ox-bile Brilliant green có tác dụng ức chế phát triển vi khuẩn G(+) Sự tạo thành khí lên men lactose phát nhờ ống Durham úp ngược chứng tỏ có mặt coliforms 25  M8 (môi trường Lauryl Sulfate Broth, hay Lauryl Tryptose Broth) Tryptose 20g/L Potassium dihydrogen phosphate 2.75g/L Lactose 5g/L Sodium lauryl sulfate 0.1g/L Sodium chloride 5.0g/L Dipotassium hydrogen phosphate 2.75g/L pH 6.8±0.2 ( 25oC) Dùng 35.6g hỗn hợp pha sẵn để chuẩn bị thành 1000ml môi trường Tiệt trùng 121oC 15 phút Tryptose cung cấp nguồn nitrogen, carbon, vitamin amino acid Sodium lauryl sulfate ức chế vi khuẩn khơng phải coliforms Sodium chloride trì cân áp suất thẩm thấu môi trường Potassium phosphate trì pH ổn định suốt trình lên men 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO Food Microbiology Laboratory Manual Professor Nagendra Shah School of Molecular Sciences Victoria University, 2004 Handbook of Microbiologycal Media for the Examination of Food Ronald M Atlat CRC Press, Taylor &Francis Group, 2006 Laboratory Exercise in Microbiology, fifth edition Harley Presscott McGraw Hill Companies, 2002 Laboratory Manual and Workbook in Microbiology – Application to Patient Care 7th Edition Josephine A Morello, Paul A Granato, Helen Eckel Mizer 2002 Laboratory Manual of Food Microbiology for Ethiopian health and Nutrition Research Institute Dr Ciira Kiiyukia – Unido project, 2003 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mó phẩm Trần Linh Thước Nhà xuất Giáo dục, 2003 Thí nghiệm Vi sinh vật học thực phẩm Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương Nhà xuất Đại học quốc gia TP.HCM, 2006 Thực tập Vi sinh vật học thực phẩm Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn Đại học Bách Khoa TP.HCM Understanding and Teaching the Most Probable Technique J L Oblinger, J A Koburger J Milk Food Technol Vol 38, No 9, Pages 540-545, 1975 27 ... tích vi sinh vật nước, thực phẩm mó phẩm Trần Linh Thước Nhà xuất Giáo dục, 2003 Thí nghiệm Vi sinh vật học thực phẩm Lê Văn Vi? ??t Mẫn, Lại Mai Hương Nhà xuất Đại học quốc gia TP.HCM, 2006 Thực. .. với độ pha loãng thực – đóa (tức – lần lặp lại)  Tiến hành nuôi cấy tủ ủ vi sinh 30oC 16-24 (sao cho khuẩn lạc nấm mốc vừa chớm tạo thành chưa có hình thành bào tử)  Tiến hành quan sát hình... thí nghiệm, sinh vi? ?n phải báo trước (hoặc vào buổi thí nghiệm) cho cán có trách nhiệm  Sinh vi? ?n phải hoàn thành đầy đủ thí nghiệm thực hình thức kiểm tra hạn theo yêu cầu giáo vi? ?n  Khi làm