Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá khả năng kháng khuẩn khi sử dụng kết hợp florfenicol và nano bạc và điều trị bệnh nhiễm khuẩn do Aeromonas veronii gây ra trên cá nheo Mỹ ở quy mô phòng thí nghiệm. Tính nhạy của vi khuẩn A. veronii với nano bạc và kháng sinh florfenicol đánh giá ở điều kiện in vitro thông qua kiểm tra vòng vô khuẩn dựa trên sự khuếch tán của kháng sinh trên thạch.
Vietnam J Agri Sci 2022, Vol 20, No 4: 475-483 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(4): 475-483 www.vnua.edu.vn THỬ NGHIỆM KẾT HỢP NANO BẠC VÀ FLORFENICOL TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH DO VI KHUẨN Aeromonas veronii TRÊN CÁ NHEO MỸ (Ictalurus punctatus) Nguyễn Thị Dung, Lê Việt Dũng, Kim Văn Vạn, Trương Đình Hồi* Khoa Thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: tdhoai@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 17.12.2020 Ngày chấp nhận đăng: 01.03.2022 TĨM TẮT Nghiên cứu nhằm mục đích đánh giá khả kháng khuẩn sử dụng kết hợp florfenicol nano bạc điều trị bệnh nhiễm khuẩn Aeromonas veronii gây cá nheo Mỹ quy mơ phịng thí nghiệm Tính nhạy vi khuẩn A veronii với nano bạc kháng sinh florfenicol đánh giá điều kiện in vitro thông qua kiểm tra vịng vơ khuẩn dựa khuếch tán kháng sinh thạch Thí nghiệm điều trị thực nghiệm in vivo phịng thí nghiệm thực cách cảm nhiễm cá nheo Mỹ khỏe với liều nhiễm LD50 cho cá ăn thức ăn có trộn thuốc với tỉ lệ phối trộn khác florfenicol nano bạc Kết thí nghiệm in vitro cho thấy kết hợp kháng sinh florfenicol 10ppm nano bạc 5ppm có tác dụng diệt khuẩn tốt tương đương sử dụng kháng sinh florfenicol (15ppm) Sau ngày điều trị cá cảm nhiễm bệnh cho thấy kết hợp kháng sinh florfenicol nano bạc có tác dụng điều trị tốt tương đương so với sử dụng kháng sinh Từ khóa: Nano bạc, florfenicol, A veronii, cá nheo Mỹ, Experimental Study on Combining Nanosilver and Florfenicol in the Treatment of Aeromonas veronii Disease on Channel Catfish (Ictalurus punctatus) ABSTRACT This study aimed to evaluate the antibacterial potential of florfenicol and nanosilver combination for the treatment of bacterial infection caused by Aeromonas veronii in channel catfish The susceptibility of A veronii to nanosilver and the antibiotic florfenicol was evaluated in vitro via measurement of inhibited zone based on the diffusion methods The in vivo experimental treatment was performed by challenging healthy Channel catfish at LD50 and by feeding with the supplement with different formulations of florfenicol and nanosilver The results of in vitro experiments showed that the combination of 10ppm florfenicol and 5ppm nanosilver resulted in the inhibited zone comparable to that of conventional use of antibioticflorfenicol (15ppm) After days of treatment, the combination of florfenicol and nanosilver antibiotics had a similar therapeutic effect compared to those using antibiotics alone Keywords: Nano-silver, florfenicol, A veronii, Channel catfish ĐẶT VẤN ĐỀ Cá nheo Mỹ loài bân đða châu Mỹ, di nhêp vào Việt Nam từ nëm 2010 Đåy lồi cá có giá trð dinh dưỡng cao, thðt thơm ngon, bổ dưỡng Đặc biệt, lồi chủ động sân xuỗt ging v nuụi thng phốm di nhiu hỡnh thc nuôi ghép, nuôi lồng hay nuôi hệ thng ao ỗt (Kim Vởn Vọn, 2017) Cỏ cú giỏ trð cao so với loài cá truyền thống khác nên người nuôi lựa chọn để tëng thu nhêp phát triển kinh tế Sau nhiều nëm, phong trào ni cá phát triển nhanh chóng, diện tích ni ngày mở rộng, nhiên mặt trái dðch bệnh phát sinh nhiều diễn biến phức täp gây thiệt häi đáng kể cho người nuôi (Trương Đình Hồi & cs., 2020) Từ nëm 2017, cá nheo Mỹ ni täi tỵnh miền Bíc thường xun xây dðch bệnh gây chết hàng lột, nhiều nơi tỵ l cht rỗt cao t 40-60% vi cỏ thng phốm có khối lượng 1-2kg (Truong Dinh Hoai & cs., 2019), thêm chí 475 Thử nghiệm kết hợp nano bạc florfenicol điều trị bệnh vi khuẩn Aeromonas veronii cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) với cá giống lên đến 100% câ hệ thống nuôi lng v ao ỗt, gõy thit họi kinh t ln cho người ni riêng ngành hàng cá da trơn miền Bíc nói chung Một tác nhân gây bệnh chủ yếu phát vi khuèn Aeromonas veronii (Truong Dinh Hoai & cs., 2019) Việc sử dụng lội vacxin cịn gặp nhiều khị khën áp dụng với hệ thống nuôi täi Việt Nam, vêy kháng sinh vén dùng phổ biến để điều trð bệnh nhiễm khuèn động vêt thuỷ sân Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh thường xuyên gây nhiều hệ lụy tồn dư kháng sinh sân phèm thủy sân, môi trường tình träng kháng kháng sinh ngày phổ biến Florfenicol kháng sinh có tác dng tt nhỗt vic iu tr cỏc bnh nhim khuèn Aeromonas spp gây (Nhinh & cs., 2021) Tuy nhiên, sân phèm thuỷ sân läi nhng mt hng xuỗt khốu quan trng ca nc ta, tiêu chí bít buộc với sân phèm không tồn dư kháng sinh sân phèm Do vêy, cỉn tìm lựa chọn thay kết hợp làm giâm liều lượng kháng sinh mà vén đâm bâo hiệu quâ điều trð quan tåm hàng đỉu Gỉn đåy, cơng nghệ nano cò bước phát triển mänh mẽ với nhiều ứng dụng ni trồng thuỷ sân nghiên cứu chèn đốn bnh, sõn xuỗt vacxin, thc ởn c bit l ng dụng tiềm nëng công nghệ nano hệ vên chuyển thuốc thông minh làm tëng thời gian tồn täi thuốc thể động vêt thuỷ sân, chống läi phân huỷ thuốc enzyme đường ruột, giâm thiểu phân rã thuốc môi trường nước, giâm hàm lượng kháng sinh vén đâm bâo hiệu quâ sử dụng thuốc (Camacho-Jiménez & cs., 2020; Li & cs., 2005; Miller & cs., 2013) Áp dụng công nghệ nano nuôi trồng thuỷ sân Việt Nam giai đoän áp dụng thử nghiệm số đða phương thành phố Hồ Chí Minh, Bến Tre chưa cò nhiều báo cáo nghiên cu v vỗn ny Mt s hiu quõ ca vêt liệu nano kết hợp với kháng sinh thử nghiệm kể đến Ag - Fe3O4 - Doxycylin - Alginate, Ag - TiO2 - Doxycylin - Alginate, nhiên hệ 476 vêt liệu sử dụng ni tơm thẻ chân tríng, chưa áp dụng cho lồi cá ni (Mäc Như Bình & cs., 2020) Do vêy, việc tìm phương pháp iu tr mang lọi hiu quõ tt nhỗt v bn vững tương lai đặc biệt loài cá ni có giá trð kinh tế điều vơ cỉn thiết Nghiên cứu thực để thử nghiệm đánh giá khâ nëng kết hợp nano bäc florfenicol điều trð bệnh vi khuèn A veronii cá nheo Mỹ quy mơ phịng thí nghiệm để làm sở ứng dụng vào thực tiễn điều trð bệnh đối tượng nuôi PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Cá nheo Mỹ chọn làm thí nghiệm có trọng lượng 14,1 ± 0,3 g/con, màu síc tươi sáng, phân ứng linh hột cá ni thn hố ngày Trước gây câm nhiễm, chọn ngéu nhiên 10 cá kiểm tra tác nhân gây bệnh, đâm bâo cá khóe mänh trước đưa vào bố trí thí nghiệm Vi khuèn A veronii gốc phân lêp từ cỏ nheo M b bnh, c cung cỗp bi Phũng thí nghiệm Bộ mơn Mơi trường Bệnh thuỷ sân, Khoa Thủy sân, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Chủng vi khuèn đðnh danh giám đðnh bìng phương pháp PCR (Truong Dinh Hoai & cs., 2019) Kháng sinh florfenicol ngun liệu có nguồn gốc từ cơng ty VMC Vit Nam cung cỗp v s dng tọi Phũng thí nghiệm Bộ mơn Mơi trường Bệnh thuỷ sân Kháng sinh đðnh lượng xác đðnh hàm lượng bìng hệ thống HPLC trước sử dụng thí nghiệm - Nano bäc 10.000ppm có nguồn gốc từ công ty CO-ACTION CORP 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tính nhạy vi khuẩn A veronii với kháng sinh florfenicol nano bạc Thí nghiệm gồm cơng thức (CT), CT bố trí lặp läi ba lỉn, liều lượng sử dụng sau: CT1: florfenicol 15ppm, CT2: florfenicol Nguyễn Thị Dung, Lê Việt Dũng, Kim Văn Vạn, Trương Đình Hồi 10ppm + nano bäc 5ppm, CT3: florfenicol 5ppm + nano bäc 10ppm, CT4: nano bäc 15ppm, CT5: đối chứng florfenicol 0ppm + nano bäc 0ppm Tính nhäy vi khuèn A veronii với nano bäc kháng sinh florfenicol xác đðnh bìng phương pháp khuếch tán kháng sinh thäch đïa Kirby-Bauer môi trường thäch TSA Đường kính vịng vơ khn (mm) xác đðnh mức độ nhäy, nhäy trung bình kháng xác đðnh dựa vào chn đường kính vịng vô khuèn theo tiêu chuèn Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2018) 2.2.2 Điều trị bệnh vi khuẩn A veronii phịng thí nghiệm * Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm thực täi Phịng Thí nghiệm Khoa Thuỷ sân, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Hệ thống bể thí nghiệm (96l) khử trùng bìng chlorine, rửa läi bìng nước säch Sau đị cho nước vào bể líp hệ thống sục khí liên tục vài ngày để lội hết chlorine, chỵ tiêu mơi trường nước kiểm tra trước tiến hành thí nghiệm gồm nhiệt độ, pH, DO, NO2, NH3, sử dụng dụng cụ nhiệt độ oxy chuyên dụng DO Meter (Nhêt Bân) test sera (Đức) * Thí nghiệm câm nhiễm xác đðnh LD50 Cá nheo Mỹ nuôi thn hố ngày sau đị cá bít ngéu nhiên vào 21 bể ni tích 96l, bể thí nghiệm bố trí 10 cá Các yếu tố mơi trường suốt q trình thí nghiệm kiểm soát với nhiệt độ dao động từ 25-28C, pH 6,5-8,5 Cá gây câm nhiễm bìng cách tiêm vi khuèn màng bụng (0,1ml vi khuèn/cá với dãy nồng độ 108, 107, 106, 105, 104, 103 CFU/ml), bể đối chứng tiêm bìng nước muối sinh lý, nồng độ vi khuèn bố trí lặp läi læn Sau câm nhiễm, biểu cá theo dõi liên tục 14 ngày Cá chết thu tiến hành giâi phéu quan sát dỗu hiu bnh v tỏi phõn lờp vi khuốn t thên Mêt độ vi khuèn gây nhiễm 50% cá thí nghiệm (LD50) xác đðnh từ thí nghiệm thëm dị sử dụng để gây câm nhiễm cá bố trí thí nghiệm điều trð bệnh bìng florfenicol nano bäc Cơng thức tính liều LD50: Liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50, lethal dose) xác đðnh theo công thức Reed and Muench (1938) sau: LD50 = 10(a-x) Trong đò: a: Nồng độ täi đò số lượng cá sống cá chết sau thí nghiệm 50% x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) Pa, Pu tỵ lệ cên cên nồng độ gây chết 50% * Thí nghiệm điều trð bìng phác đồ phối trộn nano kháng sinh Cá gây câm nhiễm với liều LD50% theo dõi biểu bệnh lý lâm sàng Khi cá bít đỉu có biểu bệnh, cá tiến hành điều trð bìng cơng thức thuốc CT1, CT2, CT3, CT4 cho ën liên tục ngày CT5 đối chứng: Cá gây câm nhiễm cho ën thức ën khơng trộn thuốc Thí nghiệm thực lặp läi lỉn Trong q trình thí nghiệm pH nhiệt độ ghi nhên hàng ngày lúc 14 Số lượng tỵ lệ cá chết ghi nhên ngày Tỗt cõ cỏ cũn sng sau thớ nghim cng c phân lêp vi khuèn xác nhên tình träng nhiễm khuèn Thời gian thí nghiệm 14 ngày Hiệu quâ điều trð bệnh phịng thí nghiệm đánh giá bìng tỵ lệ sống lơ điều trð lơ đối chứng không điều trð 2.2.3 Phương pháp giám định lại vi khuẩn gây cảm nhiễm kỹ thuật PCR Cá chết lơ thí nghiệm giâi phéu, lỗy mộu cỗy trờn mụi trng TSA c trng v xem hình thái khuèn läc, nhuộm Gram, phân lêp giám đðnh läi bìng phương pháp Duplex PCR Kỹ thuêt Duplex PCR giám đðnh khỵng đðnh cá chết lơ thí nghiệm chủng vi khn A veronii thực với hai cặp mồi xác đðnh độn gen 16S rRNA gen với kích thước 461bp họ Aeromonas cặp mồi xác đðnh đoän gen rpoB với kích thước 224bp để xác đðnh lồi A veronii theo mô tâ Persson & cs (2015) Chu kỳ nhiệt thực phân ứng 95C phút, lặp läi 30 chu kỳ với 94C 30 giây, 55C 30 giây, 72C phút, kéo dài cuối 72C phút Sân phèm PCR điện di gel 1% agarose 477 Thử nghiệm kết hợp nano bạc florfenicol điều trị bệnh vi khuẩn Aeromonas veronii cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) 2.2.4 Xử lý số liệu Số liệu xử lí SPSS 18, so sánh phương sai nhån tố, kiểm đðnh sai khác theo LSD với mức ý nghïa P