Chiết xuất, phân lập epigallocatechin gallat từ lá trà xanh (camellia sinensis l ) làm chất đối chiếu

I H C QU C GIA TP.HCM I H C BÁCH KHOA HÙYNH TH NG C DUNG CHI T XU T, PHÂN L P EPIGALLOCATECHIN GALLATE T TRÀ XANH (Camellia sinensis L.) LÀM CH I CHI U Chuyên ngành: CÔNG NGH HÓA H C Mã s : 605275 LU TP H CHÍ MINH, tháng 08 c hồn thành t i: Vi n Ki m Nghi m Thu c TP.HCM Cán b ng d n khoa h c : TS DS Hà Di Cán b ng d n khoa h c: PGS.TS Ph Cán b ch m nh n xét : TS Nguy n Th Cán b ch m nh n xét : TS B ch Long Giang Lu cb ov t Thành ph n H ih m: PGS TS Ph m Thành Quân TS Nguy n Th Lan Phi TS B ch Long Giang TS Lê Xuân Ti n Xác nh n c a Ch t ch H ngành sau lu CH T CH H ng Khoa qu n lý chuyên c s a ch a (n u có) NG NG KHOA I H C BÁCH KHOA TP.HCM C NG HÒA XÃ H I CH IH C cL p T Do T NAM H nh Phúc Tp.HCM, ngày tháng 08 NHI M V LU H tên h c viên: HÙYNH TH NG C DUNG Chuyên ngành : CÔNG NGH H TÀI Chi t xu t, phân l p Epigallocatechin gallat t trà xanh (Camellia sinensis L.) làm ch i chi u NHI M V VÀ N I DUNG L a ch h p t xu t epigallocatechin gallat tinh t cao phù u ki n phịng thí nghi m Phân l p EGCG (+/-) catechin b ng s c ký c t silica gel Sephadex LH-20 k t h p v i s c ký l u ch Thi t l p ch t cô l c thành ch i chi ng d n ASEAN WHO theo ISO13528 Kh o sát nhóm h p ch t catechin m t s s n ph m th ng có thành ph n chi t xu t t trà xanh NGÀY GIAO NHI M V : 06/2013 NGÀY HOÀN THÀNH NHI M V : 06/2014 H VÀ TÊN CÁN B NG D N: TS.DS.Hà Di u Ly, PGS.TS Ph m Thành Quân Tp CÁN B NG D N CH NHI M B NG KHOA O L ic Tôi xin g i l i c n TS Hà Di ng l t n tình nghiên c u, xin c Thành Quân, th ng b o v Tôi xin g i l i c ng h C m phát sinh nghiên c u, th y cô h & Ch ng d ng nh n xét quý báu cho k t qu n anh ch khoa Thi t L p Ch t Chu n i Chi u Vi n Ki m Nghi m Thu su t th i gian làm lu ng viên h tr tơi hồn thành lu u ki n, h t lịng TĨM T T Trong lu c gi ng LD 97 c dùng làm nguyên li u cho trình chi t xu t, phân l p acid gallic, EGCG, catechin Quá trình chi t xu t, phân l p c th c hi tr siêu âm K t qu sau: Phân l p acid gallic, EGCG, (+/-) catechin t trà xanh u ki n phịng thí nghi m nh c u trúc EGCG, acid gallic (+/-) catechin b ng ph h ng ngo i, ph t ngo i ph c ng t h t nhân 1H, 13C tinh t c a ch nh b cao, k t qu sau phân tích ph Thi t l c ký l ng hi tinh t > 95 % t EGCG, (+/-) catechin thành ch i chi u theo ISO 13528 Kh o sát m t s s n ph m có chi t xu t t trà xanh dùng th c ph m th c ph m ch ng ABSTRACT In the thesis, the leaves of LD 97 tea collected from Lam Dong Provin wre extractd isolated EGCG, catechins, gallic acid Experiments were carried out procedure of ultrasonic-assisted extraction method for extracting polyphenols from fresh tea leaves The results were shown: Isolated EGCG, catechins, gallic acid from green tea extraction method by supports ultrasonic Define the structure of EGCG, gallic acid, catechins by infrared, ultraviolet and nuclear magnetic resonance spectroscopic The purity of three substances were determined more than 95 % by high performance liquid chromatography The EGCG, catechins were evaluated their purity foe establishment reference standard according ISO 13528 guide Identification and quantification EGCG, catechins from the finish product containing green tea extracts in market diertary supplements L trình nghiên c u c a riêng Các s li u, k t qu nêu lu t c công b b t kì cơng trình khác Hu nh Th Ng c Dung DANH SÁCH T EC: (-) epicatechin EGC: (-) epicatechin gallt EGCG: (-) GC: (+) VI T T T epigallocatechin gallt gallocatechin HPLC: High Performance Liquid Chromatography s c ký l ng hi ODS: Octadecylsilan c t C18 TPCN: Th c ph m ch NMR: Nuclear Magnetic Resonance IR: Infrared c ng t h t nhân h ng ngo i WHO: World Health Organization ISO/IEC: International Organization for Standardization/ International Electrotechnical Commission n Vi t Nam SKLM: S c ký l p m ng DANH M C HÌNH Hình 1.1: C u t o c a acid gallic Hình 1.2: C u t n c a h p ch t catechin Hình 1.3: C u t o ch t catechin Hình 3.1: Ph UV c a (X2.1) - EGCG Hình 3.2: Cơng th c c u t o c a EGCG Hình 3.3: Ph UV c a (X1.1) catechin Hình 3.4: Cơng th c c u t o c a catechin Hình 3.5: Ph UV c a (X1.2) acid gallic Hình 3.6: Cơng th c c u t o c a acid gallic Hình 3.7: S c a (X2.1) EGCG Hình 3.8: S c a (X1.2) acid gallic Hình 3.9: S c a (X1.1) catechin Hình 3.10: th bi u di n s uy n tính c a EGCG Hình 3.11: th bi u di n s uy n tínhc a catechin Hình 3.12: Chi t xu t t trà xanh th c ph m ch Hình 3.13: S c a h n h p chu n Hình 3.14: S c a m u th (a) Hình 3.15: S c a m u th (b) Hình 3.16: S c a m u th (c) DANH M C B NG B ng 1.1: Thành ph n hóa h c có trà B ng 2.1: Các tiêu chu n i chi u EGCG (+/-) catechin B ng 3.1: Hi u qu trích ly c B ng 3.2: D li u ph H NMR (500 MHz) 13 C NMR (125 MHz) c a EGCG aceton d-6 (tr s ngo c J tính b ng Hz) B ng 3.3: S li u ph H(500 MHz) 13 C NMR (125 MHz) c a catechin aceton d6 B ng 3.4: S li u ph H(500 MHz) 13 C NMR (125 MHz) c a acid gallic aceton d6 B ng 3.5: tinh t c a ch c phân l p B ng 3.6: K t qu ki th ng c a EGCG (n =6) B ng 3.7: K t qu ki th ng c a catechin (n =6) B ng 3.8: K t qu ki th ng c a acid gallic (n =6) B ng 3.9: K t qu kh o sát n tính c a EGCG (+/-) catechin B ng 3.10: K t qu kh a EGCG B ng 3.11: K t qu kh a catechin B ng 3.12: K t qu kh B ng 3.13: K t qu B ng 3.14: K t qu B ng 3.15: K t qu thô ph m tinh t liên phòng m c a EGCG theo Anova Hình 5.4: Ph 13 C NMR c a (X1.1) (±) catechin Trang | 17 Hình 5.5: Ph 13 C NMR c a (X1.1) - catechin Trang | 18 PH L C 6: S CÁC CH PH M Hình 6.1: S m u tr ng Trang | 19 Hình 6.2: s c a ch ph m (X1.1) (±) catechin Trang | 20 Hình 6.3: S c a ch ph m (X1.2) - acid gallic Trang | 21 Hình 6.4: Ph tinh t c a (X1.2) - acid gallic Trang | 22 Hình 6.5: Ph tinh t c a (X1.1) (±) catechin Trang | 23 Hình 6.6: Ph tinh t c a (X2.1) EGCG Trang | 24 PH L C 7: CÁC S LI U THAM KH O B ng ng catechin riêng bi t t ng b ph n c a búp trà catechin Lá Lá Lá Lá già C ng EGC 122,10 152,27 206,42 232,36 222,08 GC 0 0 68,79 EC 45,53 47,84 45,16 45,16 65,65 EGCG 580,54 577,93 431,14 431,14 292,93 ECG 138,52 132,27 103,09 103,09 87,98 T ng catechin 886,69 910,31 786,11 701,82 737,40 : mg/g ch ph m chi t b ng EtOAc B ng ng m t s kim l STT M u Al Ca Cu Fe PH1 163±10 3802±152 12.6±1.1 57.2±5.1 LDP1 251±15 4881±222 11.4±1.2 156.8±11.3 Trang | 25 LD97 262±12 4272±258 13.1±1.2 72.3±4.1 HAT 302±18 5598±265 13.6±1.2 59.9±5.4 TB14 129±11 3662±189 12.0±0.9 58.4±5.6 STT M u Mg Mn Pb Zn PH1 658±32 152±11 1.1±0.1 15.8±1.2 LDP1 675±32 212±18 1.2±0.1 14.1±1.1 670±41 144±12 3.5±0.2 12.6±1.2 HAT 703±51 206±14 4.4±0.2 17.0±1.4 TB14 648±36 188±15 0.9±0.1 13.1±1.3 Trang | 26 Ph l c 8: Tiêu chu n ch t i chi u (+/-) catechin hydrat C15H14O6 , M = 290,27 Tính ch t: B t màu tr ng nh tính: Ph IR: ph c a m u th KBr ph i gi ng v i m u chu n ho c phù h p v i ph c sóng h p thu c i chi u d li u chu n i t i 280 nm H, 13C NMR: ph i gi ng m u chu n ho c phù h p v i ph i chi u b d li u chu n m ch y: 2010C Góc quay c c: + 1,20 tinh t ph m nguyên tr ng Dung d ch th : chu n b dung d ch có n 0,1 mg/ml methanol 70 %, l c qua màng l c 0,45 µm u ki n s c ký C t Agilent C18 (250 x 4,6 mm µm) c sóng 280 nm T dịng 1,0 ml/phút Trang | 27 Th tích tiêm 10 µl ng: A - dung d ch H3PO4 0,1 %; B Acetonitril Th i gian A B 10 90 85 10 15 10 20 85 75 15 25 15 30 75 90 25 10 Cách ti n hành: Ki ké th ng: cân b ng c t b a pic catechin không 1,5, s Tiêm riêng bi t l n dung d l ch chu qua pic s c ký s ng nh t 30 phút Tiêm dung d ch vào h th ng, h s c nh i (RSD) c a di n tích pic l n tiêm không l m u tr ng Công th c tính: tinh t (%) = 100 V i: ST: di n tích pic catechin; S: di n tích pic l i tr pic catechin pic s m u tr ng Trang | 28 Ph l c 9: Tiêu chu n ch i chi u EGCG C22H18O11 , M = 458,37 Tính ch t: B t màu tr ng ngà nh tính Ph IR: ph c a m u th KBr ph i gi ng v i m u chu n ho c phù h p v i ph c sóng h p thu c i chi u d li u chu n i t i 280 nm H, 13C NMR: ph i gi ng m u chu n ho c phù h p v i ph i chi u b d li u chu n m ch y: 2160C Góc quay c c: - 175,50 tinh t ph m nguyên tr ng Trang | 29 Dung d ch th : chu n b dung d ch có n 0,1 mg/ml methanol 70 %, l c qua màng l c 0,45 µm u ki n s c ký C t Agilent C18 (250 x 4,6 mm µm) c sóng 280 nm T dịng 1,0 ml/phút Th tích tiêm 10 µl ng: A - dung d ch H3PO4 0,1 %; B Acetonitril Th i gian A B 10 90 85 10 15 10 20 85 75 15 25 15 30 75 90 25 10 Cách ti n hành: Ki th ng: cân b ng c t b a pic EGCG không 1,5, s Tiêm riêng bi t l n dung d qua pic s c ký s l ch chu ng nh t 30 phút Tiêm dung d ch vào h th ng, h s t khơng c nh i (RSD) c a di n tích pic l n tiêm không l m u tr ng Cơng th c tính: Trang | 30 tinh t (%) = × 100 V i: ST: di n tích pic EGCG S: di n tích pic cịn l i tr pic EGCG pic s m u tr ng Trang | 31 ... t, phân l p Epigallocatechin gallat t trà xanh (Camellia sinensis L. ) l? ?m ch i chi u NHI M V VÀ N I DUNG L a ch h p t xu t epigallocatechin gallat tinh t cao phù u ki n phịng thí nghi m Phân l. .. 30 ( -) -Epigallocatechin gallat 12 ( -)- Epicatechin gallat ( -)- Epigallo catechin ( -)- Epicatechin (+ )- Catechin (+ )- Gallo catechin 3-4 Flavonol flavonol glucoside 3-4 Polyphenolic acid 3-4 Leucoanthocyanin... gallat [6],[7],[10],[11] EGCG vi t t t c a h p ch t Epigallocatechin gallat m t b n lo i c tìm th y nhi u trà xanh, bao g m epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), epicatechin gallat (ECG) epigallocatechin